Name: generation and assembly of virus-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus
Uploaded: 2021-07-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus at JoVE.com

एमोरी में लियांग प्रयोगशाला में अनुसंधान कार्यक्रमों को अमेरिका के राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान (एनआईजीएमएस), राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) द्वारा पुरस्कार संख्या R01GM130950 के तहत समर्थन दिया जाता है, और एमोरी यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन में रिसर्च स्टार्ट-अप फंड । लेखक सहायक समर्थन और महत्वपूर्ण चर्चा के लिए लियांग प्रयोगशाला के सदस्यों को स्वीकार करते हैं ।

1. आणविक क्लोनिंग
नोट: लिगासे इंडिपेंडेंट क्लोनिंग (एलआईसी) का उपयोग आरएसवी द्वि-सिस्ट्रोनिक सहएक्सपीशन निर्माण प्लाज्मिड बनाने के लिए किया गया था। एलआईसी 1990 के दशक की शुरुआत में विकसि?...

<ol>
	<li>Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+and+replication+of+nonsegmented+negative-strand+RNA+viruses.">Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).</li><li>Lamb, R. A., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields virology. , (2013).</li><li>Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+syncytial+virus:+virology,+reverse+genetics,+and+pathogenesis+of+disease.">Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).</li><li>Fearns, R., Deval, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+antiviral+approaches+for+respiratory+syncytial+virus+and+other+mononegaviruses:+Inhibiting+the+RNA+polymerase.">New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase.</a> Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).</li><li>Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+replication+by+respiratory+syncytial+virus+(RSV)+is+directed+by+the+N,+P,+and+L+proteins;+transcription+also+occurs+under+these+conditions+but+requires+RSV+superinfection+for+efficient+synthesis+of+full-length+mRNA.">RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA.</a> Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).</li><li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+metapneumovirus+polymerase+phosphoprotein+complex.">Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex.</a> Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).</li><li>Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+rabies+virus+polymerase+complex+from+electron+cryo-microscopy.">Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).</li><li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+respiratory+syncytial+virus+RNA+polymerase.">Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase.</a> Nature Communications. 11 (1), 368 (2020).</li><li>Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+paramyxovirus+polymerase+complex+reveals+a+unique+methyltransferase-CTD+conformation.">Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).</li><li>Gilman, M. S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Respiratory+Syncytial+Virus+Polymerase+Complex.">Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex.</a> Cell. 179 (1), 193-204 (2019).</li><li>Liang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+L+Protein+of+Vesicular+Stomatitis+Virus+from+Electron+Cryomicroscopy.">Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy.</a> Cell. 162 (2), 314-327 (2015).</li><li>Jenni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Vesicular+Stomatitis+Virus+L+Protein+in+Complex+with+Its+Phosphoprotein+Cofactor.">Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor.</a> Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).</li><li>Renner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocapsid+assembly+in+pneumoviruses+is+regulated+by+conformational+switching+of+the+N+protein.">Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein.</a> Elife. 5, 12627 (2016).</li><li>Cox, R. M., Plemper, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+organization+of+paramyxovirus+particles.">Structure and organization of paramyxovirus particles.</a> Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).</li><li>Desfosses, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+vesicular+stomatitis+virus+nucleocapsid+into+a+bullet+shape.">Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape.</a> Nature Communications. 4, 1429 (2013).</li><li>Green, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+mechanism+for+RNA+encapsidation+by+negative-strand+RNA+viruses.">Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses.</a> Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).</li><li>Jamin, M., Yabukarski, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsegmented+Negative-Sense+RNA+Viruses-Structural+Data+Bring+New+Insights+Into+Nucleocapsid+Assembly.">Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly.</a> Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).</li><li>Wan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+assembly+of+the+Ebola+virus+nucleocapsid.">Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid.</a> Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).</li><li>Mendes, A., Kuhn, R. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+chemically+competent+E.+coli.">Transformation of chemically competent E. coli.</a> Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).</li><li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM.">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li><li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Staining+and+Image+Classification+-+Powerful+Tools+in+Modern+Electron+Microscopy.">Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy.</a> Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).</li><li>Aebi, U., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glow+discharge+unit+to+render+electron+microscope+grids+and+other+surfaces+hydrophilic.">A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic.</a> Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).</li><li>Green, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Access+to+RNA+encapsidated+in+the+nucleocapsid+of+vesicular+stomatitis+virus.">Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus.</a> Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).</li><li>Alvarez Paggi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conformational+switch+balances+viral+RNA+accessibility+and+protection+in+a+nucleocapsid+ring+model.">A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).</li><li>Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+vesicular+stomatitis+virus+nucleoprotein-RNA+complex.">Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex.</a> Science. 313 (5785), 357-360 (2006).</li><li>Tawar, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+nucleocapsid-like+nucleoprotein-RNA+complex+of+respiratory+syncytial+virus.">Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus.</a> Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).</li><li>Galloux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+viral+phosphoprotein+binding+site+on+the+surface+of+the+respiratory+syncytial+nucleoprotein.">Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein.</a> Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).</li><li>Milles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembly+of+Measles+Virus+Nucleocapsid-like+Particles:+Kinetics+and+RNA+Sequence+Dependence.">Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence.</a> Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).</li><li>Desfosses, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+cryo-EM+structures+of+RNA-specific+measles+virus+nucleocapsids+provide+mechanistic+insight+into+paramyxoviral+replication.">Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).</li></ol>

गैर-संरक्षित नकारात्मक-भावना (एनएनएस) आरएनए वायरस की ज्ञात न्यूक्लियोकैप्सिड-जैसे कण (एनसीएलपी) संरचनाएं दर्शाती हैं कि इकट्ठे हुए एनसीएलपी मेजबान सेलुलर आरएनए के साथ जटिल एन हैं जब बैक्टीरियल या यू?...

गैर-संरक्षित नकारात्मक-भावना (एनएनएस) आरएनए वायरस में रेबीज, इबोला और श्वसन सिंक्टियल वायरस (आरएसवी)1,2जैसे कई महत्वपूर्ण मानव रोगजनक शामिल हैं। आरएसवी3साल के छोटे बच्चों और बड़े वयस्कों में ब्रोंकिओलाइटिस और निमोनिया जैसी श्वसन बीमारी का प्रमुख कारण है । वर्तमान में, आरएसवी4को रोकने या इलाज करने के लिए कोई प्रभावी टीके या एंटीवायरल उपचार उपलब्ध नहीं हैं। जीवन चक्र के हिस्से के रूप में, आरएसवी जीनोम आरएसवी आरएनए निर्भर आरएनए पॉलीमरेज द्वारा प्रतिकृति के लिए टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है ताकि एक एंटीजेनोम का उत्पादन किया जा सके, जो बदले में एक संतान जीनोम उत्पन्न करने के लिए टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है। जीनोम और एंटीजेनोम आरएनए दोनों को न्यूक्लियोप्टोप्रोटीन (एन) द्वारा न्यूक्लियोकैप्सिड्स (एनसी) 3 बनाने के लिए पूरीतरहसे समाहित किया गया है। चूंकि एनसी आरएसवी पॉलीमरेज द्वारा प्रतिकृति और प्रतिलेखन दोनों के लिए टेम्पलेट्स के रूप में काम करते हैं, इसलिए पॉलीमरेज के लिए आरएनए संश्लेषण5के लिए टेम्पलेट्स तक पहुंच प्राप्त करने के लिए उचित एनसी असेंबली महत्वपूर्ण है। दिलचस्प बात यह है कि एनएनएस वायरल पॉलीमेरेरेस के संरचनात्मक विश्लेषणों के आधार पर, यह परिकल्पना की जाती है कि कई एन प्रोटीन एनसी से क्षणिक रूप से अलग होते हैं ताकि आरएनए संश्लेषण6,7,8,8, 9,11,12के बाद पॉलीमरेज और आरईएन तक पुनर्विष्कार की पहुंच की अनुमति दी जा सके।
वर्तमान में, आरएसवी आरएनए बहुलकीकरण परख को छोटे नग्न आरएनए टेम्पलेट्स13, 14पर शुद्ध आरएसवी पॉलीमरेज का उपयोग करकेस्थापितकिया गया है। हालांकि, आरएसवी पॉलीमरेज की गतिविधियां इष्टतम तक नहीं पहुंचती हैं, जैसा कि नग्न आरएनए टेम्पलेट्स का उपयोग करते समय आरएसवी पॉलीमरेज द्वारा उत्पन्न गैर-प्रक्रियाशील और निष्फल उत्पादों में मनाया जाता है। वायरस विशिष्ट आरएनए के साथ नेकां की कमी आरएसवी आरएनए संश्लेषण की आगे की यंत्रवादी समझ के लिए एक प्राथमिक बाधा है । इसलिए, एक प्रामाणिक आरएनए टेम्पलेट का उपयोग आरएसवी आरएनए संश्लेषण के मौलिक ज्ञान को आगे बढ़ाने के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता बन जाती है। आरएसवी और अन्य एनएनएस आरएनए वायरस से न्यूक्लियोकैप्सिड जैसे कणों (एनसीएलआरपी) की ज्ञात संरचनाओं से पता चलता है कि एनसीएलपीएस में आरएनए या तो यादृच्छिक सेलुलर आरएनए या औसत वायरल जीनोमिक आरएनए15,16,17,18, 19हैं। एक साथ, मुख्य बाधा यह है कि एन मेजबान कोशिकाओं में एन अतिव्यक्त होने पर एनसीएलपी बनाने के लिए गैर-विशेष रूप से सेलुलर आरएनए को बांधता है।
इस बाधा को दूर करने के लिए, हमने आरएनए-फ्री (एन0)को पहले प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित किया और एन0 को एनसीएलपीएस20में प्रामाणिक वायरल जीनोमिक आरएनए के साथ इकट्ठा किया। इस प्रोटोकॉल का सिद्धांत आरएसवी फॉस्फोप्रोटीन (पीएनटीडी)के एन-टर्मिनल डोमेन, एक चैपरोन के साथ एन-एक्सप्रेसिंग द्वारा बड़ी मात्रा में पुनर्संयोजन आरएनए-मुक्त एन (एन0)प्राप्त करना है। शुद्ध एन0पी को आरएसवी-विशिष्ट आरएनए ओलिगोस जोड़कर एनसीएलपीएस में उत्तेजित और इकट्ठा किया जा सकता है, और विधानसभा प्रक्रिया के दौरान, चैपरवन पीएनटीडी को आरएनए ओलिगोस के अलावा विस्थापित किया जाता है।
यहां, हम आरएसवी आरएनए-विशिष्ट एनसी की पीढ़ी और असेंबली के लिए एक प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम आणविक क्लोनिंग, प्रोटीन तैयार करने, इन विट्रो असेंबली और जटिल असेंबली के सत्यापन का वर्णन करते हैं। हम आणविक क्लोनिंग के लिए प्रोटीन सहएक्सप्रेशन के लिए द्वि-सिस्ट्रोनिक संरचनाओं को उत्पन्न करने के लिए क्लोनिंग रणनीति को उजागर करते हैं। प्रोटीन तैयार करने के लिए, हम सेल संस्कृति, प्रोटीन निष्कर्षण, और प्रोटीन परिसर की शुद्धि की प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं। फिर हम आरएसवी आरएनए-विशिष्ट एनसी की इन विट्रो असेंबली के लिए विधि पर चर्चा करते हैं। अंत में, हम इकट्ठे एनसीएलपी की विशेषता और कल्पना करने के लिए आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी (एसईसी) और नकारात्मक दाग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) का उपयोग करते हैं।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1293px;" width="1293">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Agarose</td>
			<td style="width:302px;">SIgma</td>
			<td style="width:301px;">A9539-500G</td>
			<td style="width:319px;">making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>concentrate the protein sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Ampicillin sodium</td>
			<td style="width:302px;">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td style="width:301px;">5118.111317A</td>
			<td>antibiotic for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">AseI</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">R0526S</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cobalt (High Density) Agarose Beads</td>
			<td style="width:302px;">Gold Bio</td>
			<td>H-310-500</td>
			<td>For purification of His-tag protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Corning LSE Digital Dry Bath Heater</td>
			<td style="width:302px;">CORNING</td>
			<td style="width:301px;">6885-DB</td>
			<td>Heate the sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">dCTP</td>
			<td style="width:302px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:301px;">10217016</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">dGTP</td>
			<td style="width:302px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:301px;">10218014</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Glycerol</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">G5516-4L</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HEPES</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">H3375-100G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HiTrap Q HP</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">GE29-0513-25</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Imidazole</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">I5513-100G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)</td>
			<td style="width:302px;">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td style="width:301px;">1116.071717A</td>
			<td>induce the expression of protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:302px;">VWR</td>
			<td style="width:301px;">47730-598</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor</td>
			<td style="width:302px;">SpectraLab</td>
			<td style="width:301px;">MSX-XL-2020</td>
			<td>sonicator for lysing cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Negative stain grids</td>
			<td style="width:302px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:301px;">CF400-Cu-TH</td>
			<td>For making negative stain grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">New Brunswick Innova 44/44R</td>
			<td style="width:302px;">eppendorf</td>
			<td style="width:301px;">M1282-0000</td>
			<td>Shaker for culturing the cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Nonidet P 40 Substitute</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">74385-1L</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">OneTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">M0480L</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:302px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:301px;">28706</td>
			<td>Purify DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">SSPI-HF</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">R3132S</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td>GE29-0915-96</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">T4 DNA polymerase</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td>70099-3</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td style="width:302px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:301px;">36-101-0816</td>
			<td>Centrifuge, highest speed 20,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Trizma hydrochloride</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">T3253-250G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Uranyl Formate</td>
			<td style="width:302px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:301px;">22451</td>
			<td>making negative stain solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and assembly of virus-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus

वायरल आरएनए संश्लेषण के मौलिक ज्ञान को आगे बढ़ाने के लिए एक प्रामाणिक आरएनए टेम्पलेट का उपयोग महत्वपूर्ण है जो वायरोलॉजी में मशीनी खोज और परख विकास दोनों का मार्गदर्शन कर सकता है। नॉनसगमेंटेड निगेटिव-सेंस (एनएनएस) आरएनए वायरस का आरएनए टेम्पलेट, जैसे श्वसन सिंक्सिटियल वायरस (आरएसवी), अकेले आरएनए अणु नहीं बल्कि एक न्यूक्लियोप्रोटीन (एन) एनकैप्सीडेटेड रिबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स है । प्रामाणिक आरएनए टेम्पलेट के महत्व के बावजूद, इस तरह के राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन परिसर की पीढ़ी और असेंबली परिष्कृत रहती है और गहराई से स्पष्ट करने की आवश्यकता होती है। मुख्य चुनौती यह है कि अतिव्यक्त आरएसवी एन यादृच्छिक न्यूक्लियोकैप्सिड जैसे कणों (एनसीएलआरपीएस) बनाने के लिए गैर-विशेष रूप से सेलुलर आरएनए को बांधता है। यहां, हमने आरएनए-फ्री एन (एन0)को प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित किया, जो पहले एक चैपरवन फॉस्फोप्रोटीन (पी) के साथ एन को सह-व्यक्त करता है, फिर वायरस-विशिष्ट न्यूकॉकैप्सिड (एनसी) प्राप्त करने के लिए आरएसवी-विशिष्ट आरएनए अनुक्रम के साथ आरएनए ओलिगोस के साथ एन0 को इकट्ठा करता है। इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कि इस पारंपरिक रूप से चुनौतीपूर्ण वायरल रिबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स की तैयारी में कठिनाई को कैसे दूर किया जाए।

आरएनए-मुक्त एन0पी प्रोटीन का शुद्धिकरण इस प्रोटोकॉल के साथ, बड़े पैमाने पर घुलनशील विषमता आरएसवी एन0पी परिसर प्राप्त किया जा सकता है। पी प्रोटीन के एन और एन टर्मिनल भाग की पूरी लंबाई ई. ...

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Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

श्वसन सिंकिटियल वायरस (आरएसवी) आरएनए संश्लेषण के गहन यंत्रवादी विश्लेषण के लिए, हम वायरस-विशिष्ट न्यूक्लियोकैप्सिड्स (एनसीएस) के विट्रो असेंबली में बाद में आरएनए-मुक्त न्यूकोप्रोटीन (एन0)के सह-प्रसार के लिए चैपरवन फॉस्फोप्रोटीन (पी) का उपयोग करने के प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं।

श्वसन सिंकिटियल वायरस के वायरस-विशिष्ट न्यूक्लियोकैप्सिड्स की पीढ़ी और असेंबली

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

यह विधि आरएनए-मुक्त एन प्रोटीन प्राप्त करने के लिए एक वायरल प्रोटीन के लिए एक चपरवन के रूप में एक वायरल प्रोटीन पी का उपयोग करके पुनर्संयोजन वायरल प्रोटीन अभिव्यक्ति चुनौतियों से निपटने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग करती है। आरएनए-मुक्त आरएसवी एन प्रोटीन वायरस विशिष्ट आरएनए को विट्रो में न्यूक्लियोकैप्सिड में कोडांतरण करने से पहले प्राप्त किया जाता है। विधि का उपयोग अन्य गैर-खंडित नकारात्मक भावना आरएनए वायरस के साथ भी किया जा सकता है।लिगेशन स्वतंत्र क्लोनिंग विधि सह-अभिव्यक्ति निर्माण प्राप्त करने के लिए एक त्वरित तकनीक है। क्यों या ऐच्छिक दाग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप कच्चे सेल में बड़े इकट्ठा की जांच के लिए एक त्वरित विधि है। हम आपको दो टिप्स देना चाहते हैं।सबसे पहले, अगले कदम पर जाने से पहले प्रत्येक चरण के लिए उच्च उपज और ठोस परिणाम प्राप्त करें। दूसरा, क्रोमेटोग्राफी के लिए उचित कार्यक्रम स्थापित करना और संदंश के साथ ग्रिड उठा अभ्यास। एन और पी सह अभिव्यक्ति के द्वि-सिस्ट्रोनिक निर्माण के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर एलबी माध्यम में ई कोलाई BL21DE3 तनाव कोशिकाओं की चार एक लीटर संस्कृतियों को विकसित करें।जब 600 नैनोमीटर पर ऑप्टिकल घनत्व 0.6 तक पहुंच जाता है, तो तापमान को 16 डिग्री सेल्सियस तक कम करता है। एक घंटे के बाद, रात भर 0.5 मिलीमोलर आईपीटीजी के साथ उपचार द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करें। अगली सुबह, अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें और लाइसिस बफर के 200 मिलीलीटर में छर्रों को फिर से खर्च करें।कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए सोनीसेशन द्वारा lyse, पर तीन सेकंड के साथ, दालों से तीन सेकंड । और सेंट्रलाइजेशन करके लाइट्स को इकट्ठा करें। लगभग 10 मिलीलीटर मोतियों के साथ, 2.5 बाय 10 सेंटीमीटर कोबाल्ट गुरुत्वाकर्षण स्तंभ में सुपरनैट लोड करें।लाइसिस बफर के 5 से 10 कॉलम वॉल्यूम के साथ प्री-समतुल्य। और बफर बी के पांच कॉलम वॉल्यूम और बफर सी के पांच वॉल्यूम के साथ कॉलम को धोएं मोतियों से प्रोटीन को एल्यूट करने के लिए बफर डी के दो वॉल्यूम का इस्तेमाल करें । और क्यूए बफर के ५ १ मिलीलीटर मात्रा के साथ क्यू कॉलम को बराबर करें ।कॉलम पर पतला नमूना लोड करने के लिए एक पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग करें। ताजा क्यूए और क्यूबी बफ़र्स के साथ-साथ एचपीएलसी मशीन पर लोड किए गए क्यू कॉलम को पिघलाएं। क्यूबी और क्यूए बफ़र्स के एक से दो वॉल्यूम के साथ मशीन को सफलतापूर्वक धोने के लिए पंप वॉश चलाएं।अंतिम धोने के बाद, प्रति मिनट एक मिलीलीटर के लिए प्रवाह दर निर्धारित करें, और अंशों को इकट्ठा करने के लिए 96 गहरी अच्छी प्लेट का उपयोग करके यूवी 1 से 280 नैनोमीटर और यूवी 2 से 260 नैनोमीटर सेट करें। फिर प्रोटीन को स्पष्ट करने के लिए एल्यूशन एजेंट की प्रत्येक एकाग्रता के तीन से चार खंडों के एक स्टेपवाइज ढाल आवेदन का उपयोग करें, जो 0% QB एकाग्रता से शुरू होता है और हर बार प्रतिशत में 5% की वृद्धि करता है। एन-0 पी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स 15% क्यूबी बफर एकाग्रता पर एल्यूट होगा ।जेल निस्पंदन द्वारा प्रोटीन को अलग करें, एक बाय 30 सेंटीमीटर छोटे पैमाने पर शुद्धिकरण कॉलम में, बफर ई के साथ समतुल्य एसडीएस पृष्ठ द्वारा अंश युक्त प्रोटीन का विश्लेषण करें। वायरस विशिष्ट न्यूक्लियोकैप्सिड असेंबली के लिए, एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 1:1.5 आणविक अनुपात में आरएनए ओलिगो के साथ शुद्ध एन-0 पी परिसर को मिलाएं और इनक्यूबेट करें। बफर ई. के साथ एक छोटे पैमाने पर शुद्धिकरण जेल छानने का काम कॉलम पूर्व समतुल्य और अपकेंद्रित्र द्वारा किसी भी वर्षा को हटा दें।सुपरनेट को आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी कॉलम में लोड करें। और आरएनए असेंबली के लिए प्रोटीन के आकार बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी छवियों की तुलना करें, और प्रोटीन अकेले नियंत्रण नमूनों, नाभिक एसिड शुद्धता अनुपात के संयोजन, जो चोटियों इकट्ठे एन आरएनए, एन-0 पी और मुक्त आरएनए हैं की पहचान करने के लिए । एन आरएनए परिसर को इकट्ठा करने के लिए, एन आरएनए पीक अंशों के सभी इकट्ठा करें, एक आरएनए निष्कर्षण करें, और विशिष्ट आरएनए की लंबाई को डबल-चेक करने के लिए एक यूरिया पेज जेल चलाएं।नकारात्मक दाग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए एक नकारात्मक दाग ग्रिड तैयार करने के लिए, उबलते करने के लिए डबल आसुत पानी के 5 एमएल गर्म करने के लिए एक गर्मी की थाली का उपयोग करें और पानी के लिए 37.5 मिलीग्राम यूरेरियल फोरमेट जोड़ें ताकि 0.75% यूरिल फोर्टमेट धुंधला समाधान प्राप्त किया जा सके। एक एल्यूमीनियम पन्नी कवर बीकर के लिए समाधान स्थानांतरित करें। और 10 मोलर सोडियम हाइड्रोक्साइड के चार माइक्रोलीटर जोड़ें।प्रकाश से संरक्षित सरगर्मी के 15 मिनट के बाद, एक टेस्ट ट्यूब में एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर करें। सतत कार्बन कोटेड इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड हाइड्रोफिलिक बनाने के लिए, ग्रिड को बिजली की आपूर्ति से जुड़े एक कक्ष में रखें और ग्रिडों पर नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए आयनों को लागू करें। कट और दो इंच पैराफिल्म पट्टी से एक दो गुना।पट्टी के एक छोर पर आसुत पानी की दो 40 माइक्रोलीटर बूंदें जोड़ें। और 0.75% यूरेरियल फोरमेट धुंधला समाधान के दो 40 माइक्रोलीटर दूसरे छोर के लिए बूंदें। प्रत्येक ग्रिड में प्रोटीन नमूने के तीन माइक्रोलीटर जोड़ें।एक मिनट के बाद, ब्लॉटिंग पेपर के खिलाफ ग्रिड को ब्लॉक करें और ग्रिड को डिस्टिल्ड पानी की बूंदों में दो बार डुबोएं। और एक बार पहले धुंधला समाधान बूंद में। फिर ग्रिड को 30 सेकंड के लिए दूसरे धुंधला समाधान बूंद में विसर्जित करें, किसी भी अतिरिक्त दाग समाधान को हटाने के लिए कागज के खिलाफ ग्रिड को दागने से पहले और इमेजिंग से पहले ग्रिड को हवा-शुष्क करने की अनुमति दें।इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, बड़े पैमाने पर घुलनशील हेटेरो डाइमेरिक श्वसन सिंक्टियल वायरस एन0 पी कॉम्प्लेक्स प्राप्त किया जा सकता है। ई कोलाई में, पी प्रोटीन के एन और एन-टर्मिनल भागों की पूरी लंबाई एन प्रोटीन पर 10 एक्स अपने टैग के साथ सह-व्यक्त की जाती है। यूवी अवशोषण न्यूक्लिक एसिड शुद्धता अनुपात के आधार पर, N0 P में पूर्ण लंबाई एन और एन-टर्मिनल पी दोनों शामिल थे, लेकिन इसमें सेलुलर आरएनए शामिल नहीं था।शुद्ध N0 पी तो उत्तेजित किया जा सकता है और विशिष्ट आरएनए ओलिगोस के साथ इनक्यूबेशन के माध्यम से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड पर कणों की तरह न्यूक्लियोकैप्सिड में इकट्ठा के रूप में प्रदर्शन किया । प्रोटीन को शुद्ध करते समय कॉलम शुद्धिकरण के दौरान हवा के बुलबुले से बचें और कॉलम पर नमूना लोड करने से पहले पीएच और नमक एकाग्रता को समायोजित करने के लिए क्यूए बफर के साथ नमूना को पतला करें। ग्रिडों को दूषित करने से बचने के लिए बाहरी किनारे पर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड को पकड़ने का ध्यान रखें।इससे हमें गैर-सकारात्मक आरएसवी जीनोम पैकिंग प्रश्नों को निर्धारित करने में मदद मिलेगी, चाहे वह बाएं हाथ का हो या दाएं हाथ की पेचिक संरचना। उन प्रक्रियाओं का पालन करना और आरएसवी पॉलीमरेज गतिविधि परख के लिए एक आरएनए टेम्पलेट को प्रामाणिक किया जा सकता है। और इस आरएसवी वायरल विशिष्ट न्यूक्लियोकैप्सिड का उपयोग उच्च रिज़ॉल्यूशन क्रायो ईएम विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

एक संयुक्त दृष्टिकोण के लिए प्रकरण: संयोजक अर्चेअल Proteasomes और Nondenaturing पेज के साथ Proteasome विधानसभा की जांच

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

अलगाव और Arabidopsis थालियाना से Mitochondria की श्वसन माप

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

देशी की पीढ़ी, untagged Huntingtin Exon1 मोनोमर और तंतुओं एक सूमो संलयन रणनीति का उपयोग

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

कृत्रिम पाड़ के बिना स्थिर 3 डी सेलुलर विधानसभा का निर्माण करने के लिए जीवित कोशिकाओं को जोड़ तोड़

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project

कैसे प्रोटीन को स्थिर करने के लिए: थर्मल शिफ्ट परख और वायरस एक्स परियोजना में नैनो अंतर स्कैनिंग Fluorimetry के लिए स्थिरता स्क्रीन

The Horizon2020 Virus-X project was established in 2015 to explore the virosphere of selected extreme biotopes and discover novel viral proteins. To ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

हाइब्रिड स्पष्ट/माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन श्रृंखला Supercomplexes के पृथक्करण और विश्लेषण के लिए प्राकृतिक इलेक्ट्रोफोरेसिस

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy

सम आवृत्ति जनरेशन कंपन स्पेक्ट्रोस्कोपी के माध्यम से पता चला पॉलिमर और बायोमैक्रो अणुओं के अंतरामुखीय आण्विक स्तर की संरचनाएं

As a second-order nonlinear optical spectroscopy, sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy has widely been used in investigating various ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

वास्तविक समय, अर्ध-स्वचालित वायुमार्ग की सतह तरल प्राथमिक मानव Airway उपकला कोशिकाओं के pH का मापन

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

तरल और बर्फ में वायरस असेंबली की उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को आगे बढ़ाना

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...