Name: generation and assembly of virus-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus
Uploaded: 2021-07-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus at JoVE.com

I programmi di ricerca nel laboratorio Liang di Emory sono supportati dal National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) degli Stati Uniti, dal National Institutes of Health (NIH) con il numero di premio R01GM130950 e dal Research Start-Up Fund presso la Emory University School of Medicine. L'autore riconosce i membri del laboratorio Liang per il supporto utile e la discussione critica.

1. Clonazione molecolare
NOTA: La clonazione indipendente ligasi (LIC) è stata utilizzata per creare un costrutto di coespressione bi-cistronica RSV plasmide. Il LIC è un metodo sviluppato nei primi anni '90, che utilizza l'attività 3'-5' Exo della DNA polimerasi T4 per creare sporgenze con complementarietà tra il vettore e l'inserto del DNA21,22. I costrutti sono stati realizzati utilizzando il DNA vettoriale 2BT-10...

<ol>
	<li>Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+and+replication+of+nonsegmented+negative-strand+RNA+viruses.">Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).</li><li>Lamb, R. A., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields virology. , (2013).</li><li>Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+replication+by+respiratory+syncytial+virus+(RSV)+is+directed+by+the+N,+P,+and+L+proteins;+transcription+also+occurs+under+these+conditions+but+requires+RSV+superinfection+for+efficient+synthesis+of+full-length+mRNA.">RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA.</a> Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).</li><li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+metapneumovirus+polymerase+phosphoprotein+complex.">Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex.</a> Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).</li><li>Horwitz, J. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM.">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li><li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Staining+and+Image+Classification+-+Powerful+Tools+in+Modern+Electron+Microscopy.">Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy.</a> Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).</li><li>Aebi, U., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glow+discharge+unit+to+render+electron+microscope+grids+and+other+surfaces+hydrophilic.">A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic.</a> Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).</li><li>Green, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Access+to+RNA+encapsidated+in+the+nucleocapsid+of+vesicular+stomatitis+virus.">Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus.</a> Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).</li><li>Alvarez Paggi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conformational+switch+balances+viral+RNA+accessibility+and+protection+in+a+nucleocapsid+ring+model.">A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).</li><li>Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+vesicular+stomatitis+virus+nucleoprotein-RNA+complex.">Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex.</a> Science. 313 (5785), 357-360 (2006).</li><li>Tawar, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+nucleocapsid-like+nucleoprotein-RNA+complex+of+respiratory+syncytial+virus.">Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus.</a> Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).</li><li>Galloux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+viral+phosphoprotein+binding+site+on+the+surface+of+the+respiratory+syncytial+nucleoprotein.">Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein.</a> Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).</li><li>Milles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembly+of+Measles+Virus+Nucleocapsid-like+Particles:+Kinetics+and+RNA+Sequence+Dependence.">Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence.</a> Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).</li><li>Desfosses, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+cryo-EM+structures+of+RNA-specific+measles+virus+nucleocapsids+provide+mechanistic+insight+into+paramyxoviral+replication.">Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).</li></ol>

Le strutture note di particelle nucleocapside-simili (NCLP) dei virus RNA a senso negativo non commentati (NNS) mostrano che gli NLP assemblati sono il complesso N con RNA cellulari ospiti quando sovraespresso nei sistemi di espressione batterica o eucariotica15,16,17,18,19. Studi precedenti hanno tentato di ottenere l'N privo di RNA con una varietà di metodi...

I virus dell'RNA a senso negativo (NNS) non commentati includono molti agenti patogeni umani significativi, come rabbia, Ebola e virus respiratorio sincrezionale (RSV)1,2. Rsv è la principale causa di malattie respiratorie come bronchiolite e polmonite nei bambini piccoli e negli adulti più grandi in tutto ilmondo 3. Attualmente, non sono disponibili vaccini efficaci o terapie antivirali per prevenire o trattare RSV4. Come parte del ciclo di vita, il genoma RSV funge da modello per la replicazione da parte dell'RNA polimerasi dipendente dall'RNA RSV per produrre un antigenoma, che a sua volta funge da modello per generare un genoma di progenie. Sia il genoma che l'antigenoma RNA sono interamente racchiusi dalla nucleoproteina (N) per formare i nucleocapsidi (NC)3. Poiché gli NC fungono da modelli sia per la replicazione che per la trascrizione da parte della RSV polimerasi, un adeguato assemblaggio NC è fondamentale affinché la polimerasi ottenga l'accesso ai modelli per la sintesi dell'RNA5. È interessante notare che, sulla base delle analisi strutturali delle polimerasi virali NNS, si ipotizza che diverse N proteine si dissociano transitoriamente dagli NC per consentire l'accesso della polimerasi e ricombinate all'RNA dopo la sintesi dell'RNA6,7,8,9,10,11,12.
Attualmente, il test di polimerizzazione dell'RNA RSV è stato stabilito utilizzando polimerasi RSV purificata su brevi modelli di RNAnudo 13,14. Tuttavia, le attività della RSV polimerasi non raggiungono ottimale, come osservato nei prodotti non processivi e abortivi generati dalla RSV polimerasi quando si utilizzano modelli di RNA nudi. La mancanza di NC con RNA specifico del virus è una barriera primaria per l'ulteriore comprensione meccanicistica della sintesi dell'RNA RSV. Pertanto, l'utilizzo di un autentico modello di RNA diventa un'esigenza critica per far progredire la conoscenza fondamentale della sintesi dell'RNA RSV. Le strutture note delle particelle nucleocapside-simili (NCLP) da RSV e altri virus NNS RNA rivelano che gli RNA negli NCLP sono RNA cellulari casuali o RNA genomiche virali medie15,16,17,18,19. Insieme, l'ostacolo principale è che N si lega non specificamente agli RNA cellulari per formare NCLP quando N è sovraespresso nelle celle ospiti.
Per superare questo ostacolo, abbiamo stabilito un protocollo per ottenere prima RNA-free (N0) e assemblare N0 con autentico RNA genomico virale in NCLP20. Il principio di questo protocollo è quello di ottenere una grande quantità di N (N 0) ricombinare n (N0)co-esprimere N con un chaperone, il dominio N-terminale della fosfoproteina RSV (PNTD). L'N0P purificato potrebbe essere stimolato e assemblato in NCLP aggiungendo oligo di RNA specifici per RSV, e durante il processo di assemblaggio, il chaperone PNTD viene spostato dopo l'aggiunta di oligo di RNA.
Qui, dettagliamo un protocollo per la generazione e l'assemblaggio di NC specifici dell'RNA RSV. In questo protocollo, descriviamo la clonazione molecolare, la preparazione proteica, l'assemblaggio in vitro e la convalida dell'assemblaggio complesso. Evidenziamo la strategia di clonazione per generare costrutti bi-cistronici per la coespressione proteica per la clonazione molecolare. Per la preparazione delle proteine, descriviamo le procedure di coltura cellulare, estrazione proteica e purificazione del complesso proteico. Quindi discutiamo il metodo per l'assemblaggio in vitro degli NC specifici dell'RNA RSV. Infine, utilizziamo la cromatografia ad esclusione di dimensione (SEC) e la microscopia elettronica a macchia negativa (EM) per caratterizzare e visualizzare gli NCLP assemblati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1293px;" width="1293">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Agarose</td>
			<td style="width:302px;">SIgma</td>
			<td style="width:301px;">A9539-500G</td>
			<td style="width:319px;">making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>concentrate the protein sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Ampicillin sodium</td>
			<td style="width:302px;">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td style="width:301px;">5118.111317A</td>
			<td>antibiotic for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">AseI</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">R0526S</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cobalt (High Density) Agarose Beads</td>
			<td style="width:302px;">Gold Bio</td>
			<td>H-310-500</td>
			<td>For purification of His-tag protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Corning LSE Digital Dry Bath Heater</td>
			<td style="width:302px;">CORNING</td>
			<td style="width:301px;">6885-DB</td>
			<td>Heate the sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">dCTP</td>
			<td style="width:302px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:301px;">10217016</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">dGTP</td>
			<td style="width:302px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:301px;">10218014</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Glycerol</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">G5516-4L</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HEPES</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">H3375-100G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HiTrap Q HP</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">GE29-0513-25</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Imidazole</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">I5513-100G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)</td>
			<td style="width:302px;">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td style="width:301px;">1116.071717A</td>
			<td>induce the expression of protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:302px;">VWR</td>
			<td style="width:301px;">47730-598</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor</td>
			<td style="width:302px;">SpectraLab</td>
			<td style="width:301px;">MSX-XL-2020</td>
			<td>sonicator for lysing cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Negative stain grids</td>
			<td style="width:302px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:301px;">CF400-Cu-TH</td>
			<td>For making negative stain grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">New Brunswick Innova 44/44R</td>
			<td style="width:302px;">eppendorf</td>
			<td style="width:301px;">M1282-0000</td>
			<td>Shaker for culturing the cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Nonidet P 40 Substitute</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">74385-1L</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">OneTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">M0480L</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:302px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:301px;">28706</td>
			<td>Purify DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">SSPI-HF</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">R3132S</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td>GE29-0915-96</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">T4 DNA polymerase</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td>70099-3</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td style="width:302px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:301px;">36-101-0816</td>
			<td>Centrifuge, highest speed 20,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Trizma hydrochloride</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">T3253-250G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Uranyl Formate</td>
			<td style="width:302px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:301px;">22451</td>
			<td>making negative stain solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and assembly of virus-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus

L'uso di un autentico modello di RNA è fondamentale per far progredire la conoscenza fondamentale della sintesi dell'RNA virale che può guidare sia la scoperta meccanicistica che lo sviluppo di saggi in virologia. Il modello di RNA dei virus dell'RNA a senso negativo non commentati (NNS), come il virus respiratorio sincrezionale (RSV), non è una molecola di RNA da sola ma piuttosto un complesso di ribonucleoproteina encapsidata di nucleoproteina (N). Nonostante l'importanza dell'autentico modello di RNA, la generazione e l'assemblaggio di un tale complesso di ribonucleoproteina rimangono sofisticati e richiedono una spiegazione approfondita. La sfida principale è che l'RSV N sovraespresso si lega non specificamente agli RNA cellulari per formare particelle casuali simili a nucleocapside (NCLP). Qui, abbiamo stabilito un protocollo per ottenere N (N0)privo di RNA prima co-esprimendo N con una fosfoproteina chaperone (P), quindi assemblando N0 con oligo di RNA con la sequenza di RNA specifica della RSV per ottenere nucleocapsidi specifici del virus (NC). Questo protocollo mostra come superare la difficoltà nella preparazione di questo complesso di ribonucleoproteina virale tradizionalmente impegnativo.

Purificazione della proteina N0P priva di RNA Con questo protocollo, è possibile ottenere un complesso eterodimerico solubile RSV N0P su larga scala. L'intera lunghezza della parte terminale N e N delle proteine P è stata co-espressa con 10X His-Tag sulla proteina N in E. coli. N0P è stato purificato usando una colonna di cobalto, scambio ionico e cromatografia ad esclusione di dimensioni. N0P contiene sia il terminale N che N a tutta lunghezza P...

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Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

Per un'analisi meccanicistica approfondita della sintesi dell'RNA del virus respiratorio sincrezionale (RSV), segnalamo un protocollo di utilizzo della fosfoproteina chaperone (P) per la coespressione della nucleoproteina priva di RNA (N0)per il successivo assemblaggio in vitro dei nucleocapsidi specifici del virus (NC).

Generazione e assemblaggio di nucleocapsidi specifici del virus respiratorio

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

Questo metodo utilizza i vari modi per affrontare le sfide di espressione delle proteine virali ricombinanti usando una proteina virale P'come chaperone per un'altra proteina virale N'per ottenere proteine N senza RNA. La proteina RSV N priva di RNA si ottiene prima di assemblare l'RNA specifico del virus in nucleocapsid in vitro. Il metodo può anche essere utilizzato con altri virus dell'RNA a senso negativo non segmentati.Il metodo di clonazione indipendente dalla legatura è una tecnica rapida per acquisire costrutti di co-espressione. Perché o elettiva il microscopio elettronico a macchia è un metodo rapido per controllare l'assemblaggio di grandi dimensioni in celle grezze. Vogliamo darti due consigli.Innanzitutto, ottenere risultati elevati e solidi per ogni passaggio prima di passare al passaggio successivo. In secondo luogo, impostare programmi adeguati per la cromatografia e praticare il prelievo di griglie con forcep. Per la costruzione bi-cistronica della coesiezione N e P, far crescere quattro colture da un litro di cellule di deformazione E coli BL21DE3 in mezzo LB a 37 gradi Celsius.Quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge 0,6, abbassare la temperatura a 16 gradi Celsius. Dopo un'ora, indurre l'espressione proteica per trattamento con IPTG 0,5 millimolare durante la notte. La mattina seguente, raccogliere le cellule per centrifugazione e rimescolare i pellet in 200 millilitri di tampone di lisi.lizzare le cellule per sonicazione per 15 minuti, con tre secondi di su, tre secondi di disartimento degli impulsi. E raccogliere i lisati per centrifugazione. Caricare il supernatante in una colonna di gravità cobalto di 2,5 per 10 centimetri, con circa 10 millilitri di perline.Pre-equilibrato con volumi da 5 a 10 colonne di buffer di lysis. E lavare la colonna con cinque volumi di colonna di tampone B e cinque volumi di tampone C.Utilizzare due volumi di tampone D per elutare la proteina dalle perline. Ed equilibrare la colonna Q con cinque volumi millilitri di buffer QA.Utilizzare una pompa peristaltica per caricare il campione diluito sulla colonna. Sciogliere la colonna Q caricata sulla macchina HPLC, insieme a nuovi buffer QA e QB. Eseguire il lavaggio della pompa per lavare con successo la macchina con uno o due volumi di tamponi QB e QA.Dopo l'ultimo lavaggio, impostare la portata su un millilitro al minuto e impostare UV1 su 280 nanometri e UV2 su 260 nanometri, utilizzando una piastra di pozzo profonda 96 per raccogliere le frazioni. Quindi utilizzare un'applicazione gradiente graduale da tre a quattro volumi di ogni concentrazione di agente eluizione per eludere le proteine, a partire da una concentrazione di QB dello 0% e aumentando la percentuale del 5% ogni volta. Il complesso proteico N-0 P elude alla concentrazione tampone del 15%QB.Isolare la proteina mediante filtrazione in gel, in una colonna di purificazione su piccola scala di uno per 30 centimetri, equilibrata con tampone E.Quindi analizzare la proteina contenente frazioni per pagina SDS. Per l'assemblaggio nucleocapsid specifico del virus, mescolare e incubare il complesso N-0 P purificato con oligo di RNA ad un rapporto molecolare 1:1.5 a temperatura ambiente per un'ora. Pre-equilibrare una colonna di filtrazione del gel di purificazione su piccola scala con tampone E.E rimuovere qualsiasi precipitazione per centrifugazione.Caricare il supernatante nella colonna cromatografica di esclusione delle dimensioni. E confrontare le immagini cromatografiche di esclusione delle dimensioni della proteina con l'assemblaggio dell'RNA, e solo i campioni di controllo delle proteine, combinando i rapporti di purezza dell'acido nucleico, per identificare quali picchi sono l'N RNA assemblato, N-0 P e l'RNA libero. Per assemblare un complesso di N RNA, raccogliere tutte le frazioni di picco dell'RNA N, eseguire un'estrazione di RNA ed eseguire un gel di urea page per ricontrollare la lunghezza dell'RNA specifico.Per preparare una griglia di macchie negative per la microscopia elettronica a macchia negativa, utilizzare una piastra termica per riscaldare 5 mL di acqua distillata doppia all'ebollizione e aggiungere 37,5 milligrammi di formato uranile all'acqua per ottenere una soluzione di colorazione in formato 0,75%uranil. Trasferire la soluzione su un becher coperto di foglio di alluminio. E aggiungere quattro microlitri di 10 idrossido di sodio molare.Dopo 15 minuti di agitazione protetti dalla luce, filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 micron in una provetta. Per rendere idrofile le reti di microscopia elettronica rivestite di carbonio continuo, posizionare le griglie in una camera collegata a un alimentatore e applicare ioni caricati negativamente sulle griglie. Tagliare e piegare una striscia di parafilm da due per due pollici.Aggiungere due gocce da 40 microliter di acqua distillata a un'estremità del nastro. E due gocce di 40 microliter dello 0,75% di soluzione di colorazione in formato uro-uro all'altra estremità. Aggiungere tre microlitri di campione proteico a ciascuna griglia.Dopo un minuto, blocca le griglie contro la carta assorbente e imboschi le griglie due volte nelle goccioline d'acqua distillate. E una volta nella prima goccia di soluzione di colorazione. Quindi immergere la griglia nella seconda goccia di soluzione di colorazione per 30 secondi, prima di gonfiare le griglie contro la carta assorbente per rimuovere qualsiasi soluzione di macchia in eccesso e consentire alle griglie di asciugarsi all'aria prima dell'imaging.Utilizzando questo protocollo, è possibile ottenere un complesso N0 P del virus respiratorio etero dimerico solubile su larga scala. In E coli, l'intera lunghezza delle porzioni N e N-terminale delle proteine P è co-espressa con un tag 10 X His sulla proteina N. Basato sul rapporto di purezza dell'acido nucleico di assorbanza UV, N0 P conteneva sia la lunghezza intera N che N-terminale P, ma non conteneva RNA cellulare.L'N0 P purificato potrebbe quindi essere stimolato e assemblato in particelle nucleocapsidi come le particelle sulle griglie di microscopia elettronica attraverso l'incubazione con oligo di RNA specifici come dimostrato. Quando si purifica la proteina evitare bolle d'aria durante la purificazione della colonna e diluire il campione con tampone QA per regolare il pH e la concentrazione di sale prima di caricare il campione sulla colonna. Fare attenzione a tenere le griglie di microscopia elettronica sul bordo esterno per evitare di contaminare le griglie.Questo ci aiuterà a determinare le domande non positive sull'imballaggio del genoma rsv, che si tratti di struttura elicoiale mancina o destra. Seguendo queste procedure e autenticando un modello di RNA per il test di attività della polimerasi RSV può essere eseguito. E questo nucleocapside specifico virale RSV può essere utilizzato per l'analisi crio EM ad alta risoluzione.

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