Name: generation and assembly of virus-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus
Uploaded: 2021-07-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus at JoVE.com

エモリーの梁研究室の研究プログラムは、米国国立一般医学研究所(NIGMS)、国立衛生研究所(NIH)の賞番号R01GM130950、エモリー大学医学部の研究スタートアップ基金によって支援されています。著者は、梁研究室のメンバーが有益なサポートと批判的な議論を行っていることを認めています。

1. 分子クローニング
注:リガーゼ独立クローニング(LIC)は、RSVビシストロニック共発現コンストラクトプラスミドを作るために使用されました。LICは、1990年代初頭に開発された方法であり、T4 DNAポリメラーゼの3'-5'Exo活性を使用して、ベクターとDNAインサート21,22との相補性を持つオーバーハングを作成する。構築物?...

<ol>
	<li>Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+and+replication+of+nonsegmented+negative-strand+RNA+viruses.">Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).</li><li>Lamb, R. A., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields virology. , (2013).</li><li>Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+syncytial+virus:+virology,+reverse+genetics,+and+pathogenesis+of+disease.">Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).</li><li>Fearns, R., Deval, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+antiviral+approaches+for+respiratory+syncytial+virus+and+other+mononegaviruses:+Inhibiting+the+RNA+polymerase.">New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase.</a> Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).</li><li>Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+replication+by+respiratory+syncytial+virus+(RSV)+is+directed+by+the+N,+P,+and+L+proteins;+transcription+also+occurs+under+these+conditions+but+requires+RSV+superinfection+for+efficient+synthesis+of+full-length+mRNA.">RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA.</a> Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).</li><li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+metapneumovirus+polymerase+phosphoprotein+complex.">Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex.</a> Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).</li><li>Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+rabies+virus+polymerase+complex+from+electron+cryo-microscopy.">Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).</li><li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+respiratory+syncytial+virus+RNA+polymerase.">Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase.</a> Nature Communications. 11 (1), 368 (2020).</li><li>Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+paramyxovirus+polymerase+complex+reveals+a+unique+methyltransferase-CTD+conformation.">Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).</li><li>Gilman, M. S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Respiratory+Syncytial+Virus+Polymerase+Complex.">Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex.</a> Cell. 179 (1), 193-204 (2019).</li><li>Liang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+L+Protein+of+Vesicular+Stomatitis+Virus+from+Electron+Cryomicroscopy.">Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy.</a> Cell. 162 (2), 314-327 (2015).</li><li>Jenni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Vesicular+Stomatitis+Virus+L+Protein+in+Complex+with+Its+Phosphoprotein+Cofactor.">Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor.</a> Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).</li><li>Renner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocapsid+assembly+in+pneumoviruses+is+regulated+by+conformational+switching+of+the+N+protein.">Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein.</a> Elife. 5, 12627 (2016).</li><li>Cox, R. M., Plemper, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+organization+of+paramyxovirus+particles.">Structure and organization of paramyxovirus particles.</a> Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).</li><li>Desfosses, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+vesicular+stomatitis+virus+nucleocapsid+into+a+bullet+shape.">Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape.</a> Nature Communications. 4, 1429 (2013).</li><li>Green, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+mechanism+for+RNA+encapsidation+by+negative-strand+RNA+viruses.">Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses.</a> Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).</li><li>Jamin, M., Yabukarski, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsegmented+Negative-Sense+RNA+Viruses-Structural+Data+Bring+New+Insights+Into+Nucleocapsid+Assembly.">Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly.</a> Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).</li><li>Wan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+assembly+of+the+Ebola+virus+nucleocapsid.">Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid.</a> Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).</li><li>Mendes, A., Kuhn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alphavirus+Nucleocapsid+Packaging+and+Assembly.">Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly.</a> Viruses. 10 (3), (2018).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+trackable+assembly+of+RNA-specific+nucleocapsids+of+the+respiratory+syncytial+virus.">In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).</li><li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+(LIC-PCR).">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).</li><li>Li, C., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation+independent+cloning+irrespective+of+restriction+site+compatibility.">Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility.</a> Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).</li><li>Green, R., Rogers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+chemically+competent+E.+coli.">Transformation of chemically competent E. coli.</a> Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).</li><li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM.">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li><li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Staining+and+Image+Classification+-+Powerful+Tools+in+Modern+Electron+Microscopy.">Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy.</a> Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).</li><li>Aebi, U., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glow+discharge+unit+to+render+electron+microscope+grids+and+other+surfaces+hydrophilic.">A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic.</a> Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).</li><li>Green, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Access+to+RNA+encapsidated+in+the+nucleocapsid+of+vesicular+stomatitis+virus.">Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus.</a> Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).</li><li>Alvarez Paggi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conformational+switch+balances+viral+RNA+accessibility+and+protection+in+a+nucleocapsid+ring+model.">A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).</li><li>Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+vesicular+stomatitis+virus+nucleoprotein-RNA+complex.">Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex.</a> Science. 313 (5785), 357-360 (2006).</li><li>Tawar, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+nucleocapsid-like+nucleoprotein-RNA+complex+of+respiratory+syncytial+virus.">Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus.</a> Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).</li><li>Galloux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+viral+phosphoprotein+binding+site+on+the+surface+of+the+respiratory+syncytial+nucleoprotein.">Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein.</a> Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).</li><li>Milles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembly+of+Measles+Virus+Nucleocapsid-like+Particles:+Kinetics+and+RNA+Sequence+Dependence.">Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence.</a> Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).</li><li>Desfosses, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+cryo-EM+structures+of+RNA-specific+measles+virus+nucleocapsids+provide+mechanistic+insight+into+paramyxoviral+replication.">Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).</li></ol>

非セグメント化陰性感覚(NNS)RNAウイルスの既知のヌクレオカプシド様粒子(NCLP)構造は、細菌または真核生物発現系15、16、17、18、19において過剰発現した場合に、組み立てられたNCLPsが宿主細胞RNAを有する複合体Nであることを示す。これまでの研究では、RNase A消化、高塩?...

非セグメント化負感覚(NNS)RNAウイルスは、狂犬病、エボラ出血熱、および呼吸器間質ウイルス(RSV)1、2のような多くの重要なヒト病原体を含む。RSVは、世界中の幼児および高齢者における気管支炎および肺炎などの呼吸器疾患の主な原因である。現在、RSV4を予防または治療するための有効なワクチンや抗ウイルス療法は利用できません。ライフサイクルの一環として、RSVゲノムは、RSV RNA依存性RNAポリメラーゼによる複製の鋳型として、抗ゲノムを産生し、その結果、子孫ゲノムを生成する鋳型として機能します。ゲノムおよび抗ゲノムRNAはいずれも、核タンパク質(N)によって完全に封入され、ヌクレオキャプシド(NC)3を形成する。NCはRSVポリメラーゼによる複製と転写の両方のテンプレートとして機能するため、ポリメラーゼがRNA合成用テンプレートにアクセスするには適切なNCアセンブリが不可欠です。興味深いことに、NNSウイルスポリメラーゼの構造解析に基づいて、いくつかのNタンパク質が一過性にNCから解離して、RNA合成後にRNAに対してポリメラーゼのアクセスを可能にし、RNAに再結合することを仮説する6、7、8、9、10、11、12。
現在、RSV RNA重合アッセイは、短裸RNAテンプレート13,14に精製されたRSVポリメラーゼを用いて確立されている。しかし、裸のRNAテンプレートを使用する場合、RSVポリメラーゼによって生成された非プロセスおよび中止産物に観察されるように、RSVポリメラーゼの活動は最適に達しない。ウイルス特異的なRNAを用いるNCの欠如は、RSV RNA合成のさらなる機械化的理解のための主要な障壁である。したがって、本物のRNAテンプレートを使用することは、RSV RNA合成の基礎知識を進めるために重要な必要性になります。RSVおよび他のNNS RNAウイルスからのヌクレオカプシド様粒子(NCLPs)の既知の構造は、NCLPs中のRNAがランダムな細胞RNAまたは平均ウイルスゲノムRNA15、16、17、18、19であることを明らかにする。一緒に、主なハードルは、Nが宿主細胞で過剰発現したときにNCLPsを形成するために非特異的に細胞RNAにNが結合することです。
このハードルを克服するために、まずRNAフリー(N0)を取得し、本物のウイルスゲノムRNAをNCLP20に組み立てるプロトコルを確立しました。このプロトコルの原理は、Nをシャペロンと共発現させることにより組換えRNAフリーN(N0)を大量に得る、RSVホスフォタンパク質のN末端ドメイン(PNTD)である。精製されたN0Pは、RSV特異的なRNAオリゴを添加することによってNCLPに刺激され、組み立てることができ、そして組立プロセス中に、シャペロンPNTDはRNAオリゴの添加時に変位する。
ここでは、RSV RNA特異的なNCの生成と組み立てのためのプロトコルについて詳しく説明します。本プロトコルでは、分子クローニング、タンパク質調製、 インビトロ アセンブリ、および複合アセンブリの検証について説明する。我々は、分子クローニングのためのタンパク質共発現のためのバイシストロニック構築物を生成するためのクローニング戦略を強調する。タンパク質調製については、細胞培養、タンパク質抽出、タンパク質複合体の精製の手順について説明します。次に、RSV RNA特異的NCの インビトロ アセンブリの方法について検討する。最後に、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)と負染色電子顕微鏡(EM)を使用して、組み立てられたNCLPを特徴付け、可視化します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1293px;" width="1293">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Agarose</td>
			<td style="width:302px;">SIgma</td>
			<td style="width:301px;">A9539-500G</td>
			<td style="width:319px;">making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>concentrate the protein sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Ampicillin sodium</td>
			<td style="width:302px;">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td style="width:301px;">5118.111317A</td>
			<td>antibiotic for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">AseI</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">R0526S</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cobalt (High Density) Agarose Beads</td>
			<td style="width:302px;">Gold Bio</td>
			<td>H-310-500</td>
			<td>For purification of His-tag protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Corning LSE Digital Dry Bath Heater</td>
			<td style="width:302px;">CORNING</td>
			<td style="width:301px;">6885-DB</td>
			<td>Heate the sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">dCTP</td>
			<td style="width:302px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:301px;">10217016</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">dGTP</td>
			<td style="width:302px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:301px;">10218014</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Glycerol</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">G5516-4L</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HEPES</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">H3375-100G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HiTrap Q HP</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">GE29-0513-25</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Imidazole</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">I5513-100G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)</td>
			<td style="width:302px;">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td style="width:301px;">1116.071717A</td>
			<td>induce the expression of protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:302px;">VWR</td>
			<td style="width:301px;">47730-598</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor</td>
			<td style="width:302px;">SpectraLab</td>
			<td style="width:301px;">MSX-XL-2020</td>
			<td>sonicator for lysing cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Negative stain grids</td>
			<td style="width:302px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:301px;">CF400-Cu-TH</td>
			<td>For making negative stain grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">New Brunswick Innova 44/44R</td>
			<td style="width:302px;">eppendorf</td>
			<td style="width:301px;">M1282-0000</td>
			<td>Shaker for culturing the cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Nonidet P 40 Substitute</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">74385-1L</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">OneTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">M0480L</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:302px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:301px;">28706</td>
			<td>Purify DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">SSPI-HF</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">R3132S</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td>GE29-0915-96</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">T4 DNA polymerase</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td>70099-3</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td style="width:302px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:301px;">36-101-0816</td>
			<td>Centrifuge, highest speed 20,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Trizma hydrochloride</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">T3253-250G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Uranyl Formate</td>
			<td style="width:302px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:301px;">22451</td>
			<td>making negative stain solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and assembly of virus-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus

本物のRNAテンプレートの使用は、ウイルス学における機械学的発見とアッセイの開発の両方を導くことができるウイルスRNA合成の基本的な知識を進めるために重要です。非セグメント化陰性感覚(NNS)RNAウイルスのRNAテンプレートは、呼吸間核ウイルス(RSV)のような、RNA分子のみではなく、むしろ核タンパク質(N)を封入したリボヌクレオタンパク質複合体である。本物のRNAテンプレートの重要性にもかかわらず、このようなリボヌクレオタンパク質複合体の生成および組立は洗練されたままであり、詳細な解明を必要とします。主な課題は、過剰発現したRSV Nが細胞RNAに非特異的に結合してランダムなヌクレオキャプシド様粒子(NCLPs)を形成することである。ここでは、まずNをシャペロンホスホ蛋白質(P)と共発現させ、次にRSV特異的RNA配列を用いてN0を組み立ててウイルス特異的ヌクレオキャプシド(NC)を得ることでRNAフリーN(N0)を得るプロトコルを確立した。このプロトコルは、この伝統的に挑戦的なウイルスリボヌクレオタンパク質複合体の調製における困難を克服する方法を示しています。

RNAフリーN0Pタンパク質の精製 このプロトコルにより、大規模な可溶性ヘテロダイマーRSVN0P複合体が得られる。Pタンパク質のNおよびN末端部分の全長は、大腸菌のNタンパク質上の10X His-Tagと共に発現した。N0Pをコバルトカラム、イオン交換、およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。N0Pは全長NとN末端Pの両方を含むが、UV吸...

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Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

呼吸合体ウイルス(RSV)RNA合成の詳細な機械分析のために、RNA非含核タンパク質(N0)をウイルス特異的ヌクレオキャプシド(NC)のその後のインビトロ集合体に対するRNAフリー核タンパク質(N0)の共発現にシャペロンホスホタンパク質(P)を利用するプロトコルを報告する。

呼吸器間性ウイルスのウイルス特異的ヌクレオカプシドの生成と組み立て

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

この方法は、RNAフリーNタンパク質を得るために、1つのウイルスタンパク質P'をシャペロンとして別のウイルスタンパク質を用いて組換えウイルスタンパク質発現課題に取り組む様々な方法を利用する。RNAフリーのRSV Nタンパク質は、ウイルス特異的なRNAをインビトロでヌクレオキャプシドに組み立てる前に得られる。この方法は、他の非セグメントネガティブセンスRNAウイルスでも使用できる。ライゲーション独立クローニング法は、共発現構築物を取得するための迅速な技術である。なぜまたは選択性は、電子顕微鏡を染色し、生細胞で大規模な組み立てをチェックするための迅速な方法です。私たちはあなたに2つのヒントを与えたいと思います。まず、次のステップに移動する前に、各ステップの高い収率と固体の結果を取得します。第二に、クロマトグラフィーのための適切なプログラムを設定し、鉗子でグリッドを拾う練習。NおよびP共発現のバイシストロニック構造の場合、摂氏37度でLB培地中の大腸菌BL21DE3株細胞の4つの1リットル培養を成長させる。600ナノメートルの光学濃度が0.6に達したら、温度を16°Cに下げます。1時間後、一晩0.5ミリモルIPTGで処理することによりタンパク質発現を誘導する。翌朝、遠心分離によって細胞を収集し、200ミリリットルのリシスバッファーでペレットを再懸濁する。3秒間、パルスから3秒オフで、15分間超音波処理によって細胞をlyseします。遠心分離によりライセートを回収する。上清を2.5 x 10センチメートルのコバルト重力柱に積み込み、約10ミリリットルのビーズを使用します。5~10カラムのリシスバッファーで事前平衡化。そして、バッファーBの5カラムボリュームと5つのバッファCのボリュームでカラムを洗います。そしてQAバッファーの5つの1ミリリットルの量とQカラムを平衡化する。蠕動ポンプを使用して、希釈したサンプルをカラムに積み込みます。ロードされた Q カラムを、新鮮な QA および QB バッファとともに HPLC マシンに溶かします。ポンプ洗浄を実行して、QBおよびQAバッファの1~2ボリュームで機械を洗浄します。最後の洗浄後、流量を1分あたり1ミリリットルに設定し、UV1を280ナノメートル、UV2を260ナノメートルに設定し、96の深いウェルプレートを使用して分数を収集します。次に、溶出剤の各濃度の3〜4体積の段階的な勾配適用を使用して、タンパク質を溶出し、0%QB濃度から始まり、その割合を毎回5%増加させる。N-0 Pタンパク質複合体は、15%QB緩衝液濃度で溶出する。ゲル濾過によりタンパク質を単離し、1×30センチメートルの小規模精製カラムで、バッファーE.SDSページで画分を含むタンパク質を分析する。ウイルス特異的ヌクレオキャプシドアセンブリの場合、精製されたN-0 P複合体をRNAオリゴと共に、室温で1:1.5分子比で1時間混合してインキュベートします。バッファーE.と小スケール精製ゲル濾過カラムを事前平衡化し、遠心分離により任意の沈殿物を除去する。上清を、サイズ排除クロマトグラフィーカラムにロードする。そして、タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー画像をRNAアセンブリと比較し、タンパク質単独の対照サンプルを核酸純度比を組み合わせて、組み立てられたNRNA、N-0 Pおよび遊離RNAであるピークを同定する。N RNA複合体を組み立てるには、NRNAのピーク画分をすべて収集し、RNA抽出を行い、尿素ページゲルを実行して特定のRNAの長さを再確認します。負染色電子顕微鏡用の負染色グリッドを作成するには、ヒートプレートを使用して5mLの二重蒸留水を沸騰させ、37.5ミリグラムのウラニル定量を水に加えて0.75%ウラニル定染色溶液を得ます。溶液をアルミホイルで覆われたビーカーに移します。そして、10モル水酸化ナトリウムの4マイクロリットルを追加します。光から保護された15分間撹拌した後、0.22ミクロンのフィルターを通して溶液を試験管にフィルター処理します。連続カーボン被覆電子顕微鏡グリッドを親水性にするには、電源に接続されたチャンバーにグリッドを配置し、負に荷電したイオンをグリッドに適用します。2インチのパラフィルムストリップを2枚切って折ります。ストリップの一端に蒸留水を2滴加えます。そして、もう一方の端に0.75%ウラニルの形成染色液の2つの40マイクロリットル滴。各グリッドに3マイクロリットルのタンパク質サンプルを加えます。1分後、ブロッティングペーパーに対してグリッドをブロックし、蒸留水滴にグリッドを2回浸します。そして、最初の染色液滴に一度。次に、2番目の染色液の液滴にグリッドを30秒間浸し、ブロッティングペーパーに対してグリッドをブロッティングして余分な汚れ溶液を除去し、イメージング前にグリッドを空気乾燥させます。このプロトコルを用いて、大規模な可溶性二量体呼吸合体ウイルスN0P複合体が得られる。大腸菌では、Pタンパク質のN及びN末端部分の全長がNタンパク質上の10XHisタグと共発現される。UV吸光度核酸純度比に基づいて、N0Pは全長NとN末端Pの両方を含んでいたが、細胞RNAは含まれなかった。精製されたN0 Pは、その後、刺激され、実証された特定のRNAオリゴとのインキュベーションを介して電子顕微鏡グリッド上の粒子のような核組み立てに組み立てることができます。タンパク質を精製する場合は、カラム精製中に気泡を避け、QAバッファーでサンプルを希釈してpHと塩濃度を調整してから、サンプルをカラムにロードします。グリッドを汚染しないように、電子顕微鏡グリッドを外側の端に保持するように注意してください。これは、それが左利きまたは右利きのヘリカル構造であるかどうか、非陽性RSVゲノムパッキングの質問を決定するのに役立ちます。これらの手順に従い、RSVポリメラーゼ活性アッセイのためのRNAテンプレートを認証して行うことができる。そして、このRSVウイルス特異的ヌクレオキャプシドは、高解像度のクライオEM分析に使用することができる。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

組換え古細菌プロテアソームおよび非変性PAGEでプロテアソームアセンブリを調べる：複合的アプローチのためのケースを

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

分離とシロイヌナズナ由来のミトコンドリアの呼吸測定

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

ネイティブ、タグなしの Huntingtin Exon1 モノマーと相撲の融合戦略を使用して線維の生成

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

人工足場なしの安定した 3 D 携帯電話アセンブリを構築する細胞を操作します。

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project

タンパク質を安定化する方法: 熱安定性画面シフト試金およびナノ示差走査 X ウイルス プロジェクト/蛍光定量

The Horizon2020 Virus-X project was established in 2015 to explore the virosphere of selected extreme biotopes and discover novel viral proteins. To ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

ミトコンドリアの呼吸鎖 Supercomplexes の分離と分析のためのハイブリッドクリア/ブルーネイティブ電気泳動

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy

サム周波数生成振動分光法で明らかになったポリマーと生体マクロ分子の界面分子レベル構造

As a second-order nonlinear optical spectroscopy, sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy has widely been used in investigating various ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

初代ヒト気道上皮細胞の気道表面液 pH をリアルタイムで半自動で蛍光測定

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

液体および氷中のウイルス集合体の高解像度イメージングの進歩

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...