Name: generation and assembly of virus-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus
Uploaded: 2021-07-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus at JoVE.com

에모리의 리앙 연구소의 연구 프로그램은 미국 국립 일반 의학 연구소(NIGMS), 국립 보건원(NIH)이 수상 번호 R01GM130950에 따라 지원되며, 에모리 대학 의과 대학의 연구 스타트업 기금이 지원됩니다. 저자는 도움이 지원과 비판적 토론을 위해 Liang 연구소의 구성원을 인정한다.

1. 분자 복제
참고: 리가제 독립 복제(LIC)는 RSV 바이시스트로닉 공동발현 생성물 플라스미드를 만드는 데 사용되었습니다. LIC는 1990년대 초에 개발된 방법으로, T4 DNA 폴리머라제의 3'-5' 엑소 활성을 사용하여 벡터와 DNA인서트(21,22)사이의 상호 보완성을 가진 오버행을 생성한다. 구조는 오픈 리딩 프레임(ORF)(도 1)의 N 단말?...

<ol>
	<li>Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+and+replication+of+nonsegmented+negative-strand+RNA+viruses.">Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).</li><li>Lamb, R. A., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields virology. , (2013).</li><li>Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+syncytial+virus:+virology,+reverse+genetics,+and+pathogenesis+of+disease.">Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).</li><li>Fearns, R., Deval, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+antiviral+approaches+for+respiratory+syncytial+virus+and+other+mononegaviruses:+Inhibiting+the+RNA+polymerase.">New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase.</a> Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).</li><li>Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+replication+by+respiratory+syncytial+virus+(RSV)+is+directed+by+the+N,+P,+and+L+proteins;+transcription+also+occurs+under+these+conditions+but+requires+RSV+superinfection+for+efficient+synthesis+of+full-length+mRNA.">RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA.</a> Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).</li><li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+metapneumovirus+polymerase+phosphoprotein+complex.">Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex.</a> Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).</li><li>Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+rabies+virus+polymerase+complex+from+electron+cryo-microscopy.">Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).</li><li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+respiratory+syncytial+virus+RNA+polymerase.">Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase.</a> Nature Communications. 11 (1), 368 (2020).</li><li>Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+paramyxovirus+polymerase+complex+reveals+a+unique+methyltransferase-CTD+conformation.">Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).</li><li>Gilman, M. S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Respiratory+Syncytial+Virus+Polymerase+Complex.">Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex.</a> Cell. 179 (1), 193-204 (2019).</li><li>Liang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+L+Protein+of+Vesicular+Stomatitis+Virus+from+Electron+Cryomicroscopy.">Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy.</a> Cell. 162 (2), 314-327 (2015).</li><li>Jenni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Vesicular+Stomatitis+Virus+L+Protein+in+Complex+with+Its+Phosphoprotein+Cofactor.">Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor.</a> Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).</li><li>Renner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocapsid+assembly+in+pneumoviruses+is+regulated+by+conformational+switching+of+the+N+protein.">Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein.</a> Elife. 5, 12627 (2016).</li><li>Cox, R. M., Plemper, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+organization+of+paramyxovirus+particles.">Structure and organization of paramyxovirus particles.</a> Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).</li><li>Desfosses, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+vesicular+stomatitis+virus+nucleocapsid+into+a+bullet+shape.">Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape.</a> Nature Communications. 4, 1429 (2013).</li><li>Green, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+mechanism+for+RNA+encapsidation+by+negative-strand+RNA+viruses.">Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses.</a> Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).</li><li>Jamin, M., Yabukarski, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsegmented+Negative-Sense+RNA+Viruses-Structural+Data+Bring+New+Insights+Into+Nucleocapsid+Assembly.">Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly.</a> Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).</li><li>Wan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+assembly+of+the+Ebola+virus+nucleocapsid.">Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid.</a> Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).</li><li>Mendes, A., Kuhn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alphavirus+Nucleocapsid+Packaging+and+Assembly.">Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly.</a> Viruses. 10 (3), (2018).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+trackable+assembly+of+RNA-specific+nucleocapsids+of+the+respiratory+syncytial+virus.">In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).</li><li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+(LIC-PCR).">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).</li><li>Li, C., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation+independent+cloning+irrespective+of+restriction+site+compatibility.">Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility.</a> Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).</li><li>Green, R., Rogers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+chemically+competent+E.+coli.">Transformation of chemically competent E. coli.</a> Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).</li><li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM.">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li><li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Staining+and+Image+Classification+-+Powerful+Tools+in+Modern+Electron+Microscopy.">Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy.</a> Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).</li><li>Aebi, U., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glow+discharge+unit+to+render+electron+microscope+grids+and+other+surfaces+hydrophilic.">A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic.</a> Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).</li><li>Green, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Access+to+RNA+encapsidated+in+the+nucleocapsid+of+vesicular+stomatitis+virus.">Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus.</a> Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).</li><li>Alvarez Paggi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conformational+switch+balances+viral+RNA+accessibility+and+protection+in+a+nucleocapsid+ring+model.">A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).</li><li>Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+vesicular+stomatitis+virus+nucleoprotein-RNA+complex.">Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex.</a> Science. 313 (5785), 357-360 (2006).</li><li>Tawar, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+nucleocapsid-like+nucleoprotein-RNA+complex+of+respiratory+syncytial+virus.">Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus.</a> Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).</li><li>Galloux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+viral+phosphoprotein+binding+site+on+the+surface+of+the+respiratory+syncytial+nucleoprotein.">Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein.</a> Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).</li><li>Milles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembly+of+Measles+Virus+Nucleocapsid-like+Particles:+Kinetics+and+RNA+Sequence+Dependence.">Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence.</a> Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).</li><li>Desfosses, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+cryo-EM+structures+of+RNA-specific+measles+virus+nucleocapsids+provide+mechanistic+insight+into+paramyxoviral+replication.">Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).</li></ol>

비분할 음성 감지(NNS) RNA 바이러스의 공지된 뉴클레오캡시드 형 입자(NCLP) 구조는 조립된 NCLP가 세균성 또는 진핵발현시스템(15,16,17,18,19)에서과발현될 때 숙주 세포 RNA를 가진 복잡한 N임을 보여준다. 이전 연구는 RNase A 소화, 높은 염분 세척, 또는 비특이적 세포...

비분할 음성 감각(NNS) RNA 바이러스는 광견병, 에볼라 및 호흡 싱크바이러스(RSV)1,2와같은 많은 중요한 인간 병원균을 포함한다. RSV는 전 세계3명의어린이와 노인의 기관지염 및 폐렴과 같은 호흡기 질환의 주요 원인입니다. 현재, RSV4를예방하거나 치료하기 위해 효과적인 백신이나 항바이러스 요법을 사용할 수 없다. 수명 주기의 일환으로, RSV 게놈은 RSV RNA 의존RNA 폴리머라제에 의한 복제를 위한 템플릿으로서 작용하여 항게놈을 생성하며, 이는 차례로 자손 게놈을 생성하는 템플릿으로서 작용한다. 게놈 및 항게놈 RNA는 뉴클레오캡시드(N)를 형성하기 위해 뉴클레오프로틴(N)에 의해 완전히 캡슐화되어3. NC는 RSV 폴리머라제에 의한 복제 및 전사 모두에 대한 템플릿역할을 하기 때문에, 적절한 NC 어셈블리는 중합체가 RNA 합성5에대한 템플릿에 접근하는 것이 중요하다. 흥미롭게도, NNS 바이러스 성 중합체의 구조적 분석에 기초하여, 몇몇 N 단백질이 RNA 합성 후 RNA에 중합효소의 접근을 허용하고 RNA에 재결합하기 위해여러 N 단백질이 과도하게 해리되고 RNA6,7,8,9,10,11,12가가설된다.
현재, RSV RNA 중합 분석은 짧은 알몸 RNA템플릿(13,14)에정제된 RSV 폴리머라제를 사용하여 확립되었다. 그러나, RSV 폴리머라제의 활동은 알몸 RNA 템플릿을 사용할 때 RSV 폴리머라제에 의해 생성된 비공정 및 중단 성 제품에서 관찰된 바와 같이 최적에 도달하지 못한다. 바이러스 특이적 RNA를 가진 NC의 부족은 RSV RNA 합성의 추가 기계론적인 이해를 위한 1 차적인 장벽입니다. 따라서, 본격적인 RNA 템플릿을 사용하는 것은 RSV RNA 합성의 근본적인 지식을 발전시키기 위하여 중요한 필요가 된다. RSV 및 기타 NNS RNA 바이러스로부터뉴클레오캡시드 유사 입자(NCLPs)의 공지된 구조는 NCLP내의 RNA가 임의의 세포 RNA 또는 평균 바이러스 게놈 RNA15,16,17,18,19임을드러낸다. 함께, 주요 장애물은 N이 호스트 세포에서 과발현될 때 N이 NCLP를 형성하기 위하여 세포 RNA에 비특이적 결합한다는 것입니다.
이러한 장애물을 극복하기 위해, 우리는 먼저 RNA가없는 (N0)을얻고 NCLPs20에정통 바이러스 게놈 RNA와 N0을 조립하는 프로토콜을 설립했다. 이 프로토콜의 원리는 RSV 인포프로틴(PNTD)의N-단자 도메인인 샤페론과 N을 공동 발현함으로써 다량의 재조합 RNA-free N(N0)을획득하는 것이다. 정제된 N0P는 RSV 특이적 RNA 올리고를 첨가하여 NCLPs로 자극및 조립될 수 있으며, 조립 과정에서, 샤페론 PNTD는 RNA 올리고스의 첨가시 변위된다.
여기서는 RSV RNA 특이적 NC의 생성 및 조립을 위한 프로토콜을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 분자 복제, 단백질 제제, 시험관 내 조립 및 복잡한 조립의 유효성검사를 설명합니다. 분자 복제를 위한 단백질 공동발현을 위한 바이-시스트로닉 구조를 생성하는 복제 전략을 강조합니다. 단백질 제제를 위해, 우리는 세포 배양, 단백질 추출 및 단백질 복합체의 정제의 절차를 설명합니다. 그런 다음 RSV RNA 특이적 종크의 체외 조립 방법을 논의합니다. 마지막으로, 당사는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)와 음수 얼룩 전자 현미경(EM)을 사용하여 조립된 NCLP의 특성화 및 시각화를 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1293px;" width="1293">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Agarose</td>
			<td style="width:302px;">SIgma</td>
			<td style="width:301px;">A9539-500G</td>
			<td style="width:319px;">making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>concentrate the protein sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Ampicillin sodium</td>
			<td style="width:302px;">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td style="width:301px;">5118.111317A</td>
			<td>antibiotic for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">AseI</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">R0526S</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cobalt (High Density) Agarose Beads</td>
			<td style="width:302px;">Gold Bio</td>
			<td>H-310-500</td>
			<td>For purification of His-tag protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Corning LSE Digital Dry Bath Heater</td>
			<td style="width:302px;">CORNING</td>
			<td style="width:301px;">6885-DB</td>
			<td>Heate the sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">dCTP</td>
			<td style="width:302px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:301px;">10217016</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">dGTP</td>
			<td style="width:302px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:301px;">10218014</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Glycerol</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">G5516-4L</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HEPES</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">H3375-100G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HiTrap Q HP</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">GE29-0513-25</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Imidazole</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">I5513-100G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)</td>
			<td style="width:302px;">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td style="width:301px;">1116.071717A</td>
			<td>induce the expression of protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:302px;">VWR</td>
			<td style="width:301px;">47730-598</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor</td>
			<td style="width:302px;">SpectraLab</td>
			<td style="width:301px;">MSX-XL-2020</td>
			<td>sonicator for lysing cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Negative stain grids</td>
			<td style="width:302px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:301px;">CF400-Cu-TH</td>
			<td>For making negative stain grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">New Brunswick Innova 44/44R</td>
			<td style="width:302px;">eppendorf</td>
			<td style="width:301px;">M1282-0000</td>
			<td>Shaker for culturing the cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Nonidet P 40 Substitute</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">74385-1L</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">OneTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">M0480L</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:302px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:301px;">28706</td>
			<td>Purify DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">SSPI-HF</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">R3132S</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td>GE29-0915-96</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">T4 DNA polymerase</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td>70099-3</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td style="width:302px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:301px;">36-101-0816</td>
			<td>Centrifuge, highest speed 20,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Trizma hydrochloride</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">T3253-250G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Uranyl Formate</td>
			<td style="width:302px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:301px;">22451</td>
			<td>making negative stain solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and assembly of virus-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus

본격적인 RNA 템플릿의 사용은 바이러스학의 기계성 발견과 분석 개발을 모두 안내 할 수있는 바이러스 RNA 합성의 기본 지식을 발전시키는 데 중요합니다. 호흡기 싱크로바이러스(RSV)와 같은 비분할 음성감각(NNS) RNA 바이러스의 RNA 템플릿은 RNA 분자만이 아니라 오히려 리보뉴클레오단백질 복합체를 캡슐화한 뉴클레오단백질(N)이다. 본격적인 RNA 템플릿의 중요성에도 불구하고, 이러한 리보뉴클레오단백질 복합체의 생성 및 조립은 정교하게 유지되고 심층적인 용해가 필요합니다. 주요 과제는 과발현된 RSV N이 임의의 뉴클레오캡시드 와 같은 입자(NCLPs)를 형성하기 위해 세포 RNA에 비특이적 결합한다는 것입니다. 여기서, 먼저 n을 샤페론 인포단(P)으로 공동 발현한 다음, RNA 올리고스와 함께N0을 조립하여 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드(NC)를 획득하는 프로토콜을 확립하였다. 이 프로토콜은 이 전통적으로 도전적인 바이러스성 리보뉴클레오단백질 복합체의 준비에 있는 어려움을 극복하는 방법을 보여줍니다.

RNA 가 없는 N0P 단백질의 정제 이 프로토콜을 사용하면 대규모 용해성 RSV N0P 복합체를 얻을 수 있습니다. P 단백질의 N 및 N 말단 부분의 전체 길이는 대장균에서N 단백질에 대한 10배 의 His-Tag로 공동 발현되었다. N0P는 코발트 컬럼, 이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. N0P는 전길이 N 및 N 단자 P를 모두 포함하지만 UV ?...

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Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

호흡기 싱크량 바이러스(RSV) RNA 합성의 심층 기계분석의 경우, 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드(NC)의 후속 체외 조립을 위해 RNA-프리 뉴클레오프로틴(N0)의 공동발현을 위해 샤페론 인포단(P)을 활용하는 프로토콜을 보고한다.

호흡기 싱크량 바이러스의 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드의 생성 및 조립

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

이 방법은 RNA가 없는 N 단백질을 얻기 위해 또 다른 바이러스 단백질 N'을 위한 샤페론으로서 하나의 바이러스 성 단백질 P'를 사용하여 재조합 바이러스 단백질 발현 문제를 해결하는 다양한 방법을 활용합니다. RNA-free RSV N 단백질은 바이러스 특이적 RNA를 체외에서 뉴클레오캡시드로 조립하기 전에 수득된다. 이 방법은 또한 다른 비분할 음성 감각 RNA 바이러스와 함께 사용될 수 있다.리칭 독립적 복제 방법은 공동 식 구문 수집을 위한 빠른 기술입니다. 왜 또는 선택 얼룩 전자 현미경은 원시 세포에서 큰 어셈블리를 확인하는 빠른 방법입니다. 우리는 당신에게 두 가지 팁을 제공하고 싶습니다.먼저 다음 단계로 이동하기 전에 각 단계에 대해 높은 수율과 견고한 결과를 얻을 수 있습니다. 둘째, 크로마토그래피를 위한 적절한 프로그램을 설정하고 집게로 그리드를 픽업하는 연습을 실시합니다. N 및 P 공동 발현의 바이-시스트로닉 시공의 경우, LB 배지에서 E coli BL21DE3 균주 세포의 4리터 배양을 섭씨 37도에서 성장시킵니다.600 나노미터의 광학 밀도가 0.6에 도달하면 온도를 섭씨 16도로 낮춥니다. 1 시간 후, 하룻밤 0.5 밀리머 IPTG로 치료에 의해 단백질 발현을 유도한다. 다음 아침, 원심분리에 의해 세포를 수집하고 리시스 버퍼의 200 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단.3초, 펄스에서 3초 동안 초음파 처리로 셀을 lyse합니다. 그리고 원심분리에 의해 용액을 수집합니다. 상체를 2.5~10센티미터 코발트 중력 기둥에 적재하고 약 10밀리리터의 구슬을 장착합니다.리시스 버퍼의 5 ~10 열 볼륨으로 미리 평형. 그리고 5개의 컬럼 부피의 완충B와 5권의 완충C로 컬럼을 세척하여 2량의 완충제 D를 사용하여 구슬에서 단백질을 엘로우트한다. 그리고 QA 버퍼의 5 밀리리터 볼륨으로 Q 열을 평형화합니다.연동 펌프를 사용하여 희석된 샘플을 컬럼에 로드합니다. 로드된 Q 컬럼을 HPLC 기계에 녹여 신선한 QA 및 QB 버퍼를 사용할 수 있습니다. 펌프 세척을 실행하여 1~2권의 QB 및 QA 버퍼로 기계를 성공적으로 세척합니다.마지막 세척 후, 분당 1 밀리리터로 유량을 설정하고 UV1을 280 나노미터 및 UV2내지 260 나노미터로 설정하고, 96 개의 깊은 우물 판을 사용하여 분획을 수집합니다. 그런 다음 용출제의 각 농도의 3 ~4 권의 단계적 그라데이션 응용 을 사용하여 단백질을 엘로우고 0 %QB 농도에서 시작하여 매번 비율을 5 %씩 증가시면 됩니다. N-0 P 단백질 복합체는 15% QB 완충농도로 응루된다.젤 여과에 의해 단백질을 분리하고, 완충E로 평형화된 30센티미터 의 작은 스케일 정제 컬럼으로 SDS 페이지에 의해 분획을 함유한 단백질을 분석한다. 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드 어셈블리의 경우, 1시간 동안 실온에서 1:1.5 분자 비에서 RNA 올리고를 가진 정제된 N-0 P 콤플렉스를 혼합 및 배양한다. 버퍼 E.와 작은 규모의 정화 젤 여과 열을 미리 평형 및 원심분리에 의해 어떤 침전물을 제거합니다.상체를 제외 크로마토그래피 컬럼 크기로 로드합니다. 그리고 단백질의 크기 배제 크로마토그래피 이미지를 RNA 어셈블리및 단백질 단독 대조시와 비교하여 핵산 순도 비율을 결합하여, 조립된 N RNA, N-0 P 및 자유 RNA의 피크를 식별한다. N RNA 복합체를 조립하기 위해, 모든 N RNA 피크 분획을 수집하고 RNA 추출을 수행하며, 특정 RNA의 길이를 다시 확인하기 위해 우레아 페이지 젤을 실행한다.음의 얼룩 전자 현미경 검사법을 위한 음극그리드를 준비하려면 열판을 사용하여 5mL의 이중 증류수를 가열하여 끓이고 물에 37.5 밀리그램의 소라일 포메이트를 추가하여 0.75%의 uranyl 포메이트 염색 용액을 얻습니다. 용액을 알루미늄 호일 덮인 비커로 옮기. 그리고 10 개의 어금니 나트륨 수산화나트륨의 4 개의 마이크로 리터를 추가합니다.빛으로부터 보호되는 15분 의 교반 후 0.22 미크론 필터를 통해 용액을 테스트 튜브로 필터링합니다. 연속 탄소 코팅 전자 현미경 그리드를 친성하게 만들기 위해 전력 공급 장치에 연결된 챔버에 그리드를 배치하고 음하전이 온기를 그리드에 적용합니다. 잘라 2 인치 파라필름 스트립으로 두 개를 접습니다.스트립의 한쪽 끝에 증류수 40방울을 넣습니다. 그리고 다른 쪽 끝에 0.75%의 우라일 퍼메이트 스테인딩 용액의 2개의 40 마이크로리터 방울. 각 그리드에 3개의 마이크로리터단백질 샘플을 추가합니다.1분 후, 그리드를 블로팅 용지에 대고 증류수 물방울에 두 번 담급하십시오. 그리고 첫 번째 염색 용액 방울에 한 번. 그런 다음 그리드를 두 번째 염색 솔루션 액적액에 30초 동안 담그고, 그리드를 블로팅 페이퍼에 대고 과도한 얼룩 용액을 제거하고 이미징 전에 그리드가 공기 건조하도록 합니다.이 프로토콜을 이용하여, 대규모 수용성 이종염 기질 호흡기 동기화 바이러스 N0 P 복합체를 얻을 수 있다. 대장균에서는, P 단백질의 N 및 N단 부분의 전체 길이는 N 단백질에 대한 10 X His 태그로 공동 발현된다. UV 흡광도 핵산 순도비에 기초하여, N0 P는 전체 길이 N 및 N 단말 P를 모두 포함하지만 세포 RNA를 포함하지 않았다.정제된 N0 P는 특정 RNA 올리고를 통해 배양을 통해 전자 현미경 그리드의 입자와 같은 뉴클레오캡시드로 자극되고 조립될 수 있다. 단백질을 정화할 때 컬럼 정화 시 기포를 피하고 샘플을 QA 버퍼로 희석하여 샘플을 컬럼에 적재하기 전에 pH 및 염 농도를 조절한다. 그리드를 오염하지 않도록 외부 가장자리에 전자 현미경 검사격자를 고정하십시오.이것은 우리가 왼손잡이 또는 오른손잡이 발등 구조인지, 비 양성 RSV 게놈 포장 질문을 결정하는 것을 도울 것입니다. 이러한 절차및 RSV 중합효소 활성 분석법에 대한 RNA 템플릿을 본시 수행할 수 있다. 그리고 이러한 RSV 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드는 고분해능 극저온 EM 분석을 위해 사용될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

재조합 고세균 프로 테아과 비 변성 페이지로 프로 테아 조립 검사 : 케이스를 결합 접근에 대한

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

연구

생화학

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

절연 및 호흡 측정의 미토 콘 드리 아 애기 thaliana 에서

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

네이티브, 태그 Huntingtin Exon1 모노 머와 스모 융합 전략을 사용 하 여 소의 생성

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

인공 비 계 없이 안정적인 3D 셀룰러 어셈블리를 생성 하는 살아있는 세포를 조작

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project

단백질을 안정화 하는 방법: 열에 대 한 안정성 화면 이동 분석 및 나노 시차 바이러스 X 프로젝트에서 Fluorimetry

The Horizon2020 Virus-X project was established in 2015 to explore the virosphere of selected extreme biotopes and discover novel viral proteins. To ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

미토 콘 드리 아 호흡기 사슬 슈퍼 복합체의 분리 및 분석을 위한 하이브리드 클리어/블루 천연 전기 영동

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy

합계 주파수 생성 진동 분광법을 통해 밝혀진 중합체 및 생체 거력의 계면 분자 수준 구조

As a second-order nonlinear optical spectroscopy, sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy has widely been used in investigating various ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

1 차 인간 기도 상피 세포의 기도 표면 액체 pH의 실시간 반 자동화 형광 측정

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

액체와 얼음에서 바이러스 어셈블리의 고해상도 이미징 향상

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...