Name: generation and assembly of virus-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus
Uploaded: 2021-07-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus at JoVE.com

Os programas de pesquisa no laboratório de Liang em Emory são apoiados pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos EUA (NIGMS), Institutos Nacionais de Saúde (NIH) sob o número de premiação R01GM130950 e o Research Start-Up Fund da Emory University School of Medicine. O autor reconhece os membros do laboratório Liang por apoio útil e discussão crítica.

1. Clonagem molecular
NOTA: A Clonagem Independente de Ligase (LIC) foi usada para fazer um plasmídeo de coexpressão bi-cistronic RSV. LIC é um método desenvolvido no início da década de 1990, que utiliza a atividade Exo 3'-5' da polimerase de DNA T4 para criar saliências com complementaridade entre o vetor e a inserção de DNA21,22. As construções foram feitas utilizando-se o DNA vetorial 2BT-10, que consiste ...

<ol>
	<li>Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+and+replication+of+nonsegmented+negative-strand+RNA+viruses.">Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).</li><li>Lamb, R. A., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields virology. , (2013).</li><li>Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+syncytial+virus:+virology,+reverse+genetics,+and+pathogenesis+of+disease.">Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).</li><li>Fearns, R., Deval, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+antiviral+approaches+for+respiratory+syncytial+virus+and+other+mononegaviruses:+Inhibiting+the+RNA+polymerase.">New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase.</a> Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).</li><li>Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+replication+by+respiratory+syncytial+virus+(RSV)+is+directed+by+the+N,+P,+and+L+proteins;+transcription+also+occurs+under+these+conditions+but+requires+RSV+superinfection+for+efficient+synthesis+of+full-length+mRNA.">RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA.</a> Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).</li><li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+metapneumovirus+polymerase+phosphoprotein+complex.">Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex.</a> Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).</li><li>Horwitz, J. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alphavirus+Nucleocapsid+Packaging+and+Assembly.">Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly.</a> Viruses. 10 (3), (2018).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+trackable+assembly+of+RNA-specific+nucleocapsids+of+the+respiratory+syncytial+virus.">In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).</li><li>Aslanidis, C., de Jong, P. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glow+discharge+unit+to+render+electron+microscope+grids+and+other+surfaces+hydrophilic.">A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic.</a> Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).</li><li>Green, T. 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W., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+vesicular+stomatitis+virus+nucleoprotein-RNA+complex.">Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex.</a> Science. 313 (5785), 357-360 (2006).</li><li>Tawar, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+nucleocapsid-like+nucleoprotein-RNA+complex+of+respiratory+syncytial+virus.">Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus.</a> Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).</li><li>Galloux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+viral+phosphoprotein+binding+site+on+the+surface+of+the+respiratory+syncytial+nucleoprotein.">Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein.</a> Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).</li><li>Milles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembly+of+Measles+Virus+Nucleocapsid-like+Particles:+Kinetics+and+RNA+Sequence+Dependence.">Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence.</a> Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).</li><li>Desfosses, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+cryo-EM+structures+of+RNA-specific+measles+virus+nucleocapsids+provide+mechanistic+insight+into+paramyxoviral+replication.">Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).</li></ol>

As conhecidas estruturas de partículas nucleocárides (NCLP) dos vírus RNA de sentido negativo não-esegmentado (NNS) mostram que os NCLPs montados são o complexo N com RNAs celulares hospedeiros quando superexpressos em sistemas de expressão bacteriana ou eucariótica15,16,17,18,19. Estudos anteriores tentaram obter o RNA free N com uma variedade de méto...

Os vírus de RNA de sentido negativo não-esegmentado (NNS) incluem muitos patógenos humanos significativos, como raiva, Ebola e vírus sincicial respiratório (RSV)1,2. O RSV é a principal causa de doenças respiratórias, como bronquiolite e pneumonia em crianças pequenas e idosos em todo o mundo3. Atualmente, não há vacinas efetivas ou terapias antivirais disponíveis para prevenir ou tratar o RSV4. Como parte do ciclo de vida, o genoma RSV serve como modelo para replicação pela polimerase RNA dependente do RSV RNA para produzir um antígeno, que por sua vez atua como modelo para gerar um genoma descendente. Tanto o genoma quanto o antígeno RNAs são inteiramente encapsidados pela nucleoproteína (N) para formar os nucleocapsídeos (NCs)3. Como os NCs servem como modelos para replicação e transcrição pela polimerase RSV, o conjunto NC adequado é crucial para que a polimerase tenha acesso aos modelos para síntese de RNA5. Curiosamente, com base nas análises estruturais das polmerases virais NNS, hipótese-se que várias proteínas N se dissociam transitoriamente das NCs para permitir o acesso da polimerase e rebinadas ao RNA após a síntese do RNA6,7,8,9,10,11,12.
Atualmente, o ensaio de polimerização RSV RNA foi estabelecido utilizando polimerase RSV purificada em modelos de RNA nus curtos13,14. No entanto, as atividades da polimerase RSV não alcançam o ideal, como observado nos produtos não processivos e abortivos gerados pela polimerase RSV ao usar modelos de RNA nus. A falta de NC com RNA específico do vírus é uma barreira primária para a compreensão mecanicista da síntese do RSV RNA. Portanto, o uso de um modelo de RNA autêntico torna-se uma necessidade crítica para avançar no conhecimento fundamental da síntese de RNA RSV. As estruturas conhecidas das partículas semelhantes a nucleocapsídeos (NCLPs) do RSV e de outros vírus NNS RNA revelam que os RNAs nos NCLPs são RNAs celulares aleatórios ou RNAs genômicas viraismédias 15,16,17,18,19. Juntos, o principal obstáculo é que N liga não especificamente aos RNAs celulares para formar NCLPs quando n é superexpresso nas células host.
Para superar esse obstáculo, estabelecemos um protocolo para obter o RNA sem RNA (N0) primeiro e montar o N0 com RNA genômico viral autêntico em NCLPs20. O princípio deste protocolo é obter uma grande quantidade de N (N) recombinante livre de RNA (N0)co-expressando N com um acompanhante, o domínio n-terminal de fosfoproteína RSV (PNTD). O N0P purificado poderia ser estimulado e montado em NCLPs adicionando oligos RNA específicos do RSV, e durante o processo de montagem, o acompanhante PNTD é deslocado após a adição de oligos RNA.
Aqui, detalhamos um protocolo para a geração e montagem de NCs específicos do RSV RNA. Neste protocolo, descrevemos a clonagem molecular, preparação de proteínas, montagem in vitro e validação da montagem complexa. Destacamos a estratégia de clonagem para gerar construções bi-cistrônicas para coexpressão de proteínas para clonagem molecular. Para a preparação de proteínas, descrevemos os procedimentos da cultura celular, extração de proteínas e a purificação do complexo proteico. Em seguida, discutimos o método de montagem in vitro dos NCs específicos do RSV RNA. Finalmente, usamos cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e microscopia eletrônica de manchas negativas (EM) para caracterizar e visualizar os NCLPs montados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1293px;" width="1293">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Agarose</td>
			<td style="width:302px;">SIgma</td>
			<td style="width:301px;">A9539-500G</td>
			<td style="width:319px;">making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>concentrate the protein sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Ampicillin sodium</td>
			<td style="width:302px;">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td style="width:301px;">5118.111317A</td>
			<td>antibiotic for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">AseI</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">R0526S</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cobalt (High Density) Agarose Beads</td>
			<td style="width:302px;">Gold Bio</td>
			<td>H-310-500</td>
			<td>For purification of His-tag protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Corning LSE Digital Dry Bath Heater</td>
			<td style="width:302px;">CORNING</td>
			<td style="width:301px;">6885-DB</td>
			<td>Heate the sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">dCTP</td>
			<td style="width:302px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:301px;">10217016</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">dGTP</td>
			<td style="width:302px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:301px;">10218014</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Glycerol</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">G5516-4L</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HEPES</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">H3375-100G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HiTrap Q HP</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">GE29-0513-25</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Imidazole</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">I5513-100G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)</td>
			<td style="width:302px;">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td style="width:301px;">1116.071717A</td>
			<td>induce the expression of protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:302px;">VWR</td>
			<td style="width:301px;">47730-598</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor</td>
			<td style="width:302px;">SpectraLab</td>
			<td style="width:301px;">MSX-XL-2020</td>
			<td>sonicator for lysing cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Negative stain grids</td>
			<td style="width:302px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:301px;">CF400-Cu-TH</td>
			<td>For making negative stain grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">New Brunswick Innova 44/44R</td>
			<td style="width:302px;">eppendorf</td>
			<td style="width:301px;">M1282-0000</td>
			<td>Shaker for culturing the cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Nonidet P 40 Substitute</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">74385-1L</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">OneTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">M0480L</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:302px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:301px;">28706</td>
			<td>Purify DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">SSPI-HF</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">R3132S</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td>GE29-0915-96</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">T4 DNA polymerase</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td>70099-3</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td style="width:302px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:301px;">36-101-0816</td>
			<td>Centrifuge, highest speed 20,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Trizma hydrochloride</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">T3253-250G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Uranyl Formate</td>
			<td style="width:302px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:301px;">22451</td>
			<td>making negative stain solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and assembly of virus-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus

O uso de um modelo de RNA autêntico é fundamental para avançar no conhecimento fundamental da síntese de RNA viral que pode guiar tanto a descoberta mecanicista quanto o desenvolvimento de ensaios em virologia. O modelo de RNA de vírus de RNA de sentido negativo não-esegmentado (NNS), como o vírus sincicial respiratório (RSV), não é apenas uma molécula de RNA, mas sim um complexo de ribonucleoproteína encapsidada por nucleoproteína. Apesar da importância do autêntico modelo de RNA, a geração e montagem de tal complexo ribonucleoproteína permanecem sofisticadas e requerem elucidação aprofundada. O principal desafio é que o RSV N superexpresso liga-se não especificamente às RNAs celulares para formar partículas aleatórias semelhantes a nucleocapsídeos (NCLPs). Aqui, estabelecemos um protocolo para obter N (N0)livre de RNA primeiro, co-expressando N com uma fosfoproteína acompanhante (P), depois montando n0 com oligos de RNA com a sequência de RNA específica do RSV para obter nucleocapsídeos específicos do vírus (NCs). Este protocolo mostra como superar a dificuldade na preparação desse complexo tradicionalmente desafiador de ribonucleoproteína viral.

Purificação da proteína N0P livre de RNA Com este protocolo, um complexo solúvel solúvel RSV N0P pode ser obtido em larga escala. A extensão total da parte terminal N e N das proteínas P foi co-expressa com 10X His-Tag na proteína N em E. coli. N0P foi purificado usando uma coluna de cobalto, troca de íons e cromatografia de exclusão de tamanho. O N0P contém o terminal N e N de comprimento completo P, mas não continha RNA celular baseado...

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Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

Para uma análise mecanicista aprofundada da síntese de RNA do vírus sincicial respiratório (RSV), relatamos um protocolo de utilização da fosfoproteína acompanhante (P) para coexpressão da nucleoproteína livre de RNA (N0) para posterior montagem in vitro dos nucleocapsídeos específicos do vírus (NCs).

Geração e montagem de nucleocapsídeos específicos do vírus do vírus sincicial respiratório

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

Este método utiliza as várias maneiras de enfrentar os desafios de expressão de proteína viral recombinante usando uma proteína viral P'as como acompanhante para outra proteína viral N'to obter proteínas N livres de RNA. A proteína RSV N livre de RNA é obtida antes de montar o RNA específico do vírus em nucleocapsídeo in vitro. O método também pode ser usado com outros vírus de RNA de sentido negativo não segmentado.O método de clonagem independente de ligadura é uma técnica rápida para adquirir construções de co-expressão. Por que ou microscópio eletrônico de manchas eletivas é um método rápido para verificar grande montagem em células brutas. Queremos te dar duas dicas.Primeiro, obtenha alto rendimento e resultados sólidos para cada passo antes de passar para o próximo passo. Em segundo lugar, configure programas adequados para cromatografia e prática de captação de grades com fórceps. Para a construção bi-cistrônica da co-expressão N e P, cresça quatro culturas de um litro de células de cepa E coli BL21DE3 em meio LB a 37 graus Celsius.Quando a densidade óptica em 600 nanômetros atingir 0,6, reduza a temperatura para 16 graus Celsius. Após uma hora, induza a expressão proteica por tratamento com IPTG de 0,5 mililitro durante a noite. Na manhã seguinte, colete as células por centrifugação e resuspense as pelotas em 200 mililitros de tampão de lise.Lise as células por sônica por 15 minutos, com três segundos ligados, três segundos fora dos pulsos. E recolher os lises por centrifugação. Carregue o supernaspe de 2,5 por 10 centímetros de coluna de gravidade de cobalto, com aproximadamente 10 mililitros de contas.Pré-equilibrado com 5 a 10 volumes de coluna de tampão de lise. E lave a coluna com cinco volumes de coluna de tampão B e cinco volumes de buffer C.Use dois volumes de buffer D para elutar a proteína das contas. E equilibre a coluna Q com cinco volumes mililitros de buffer qa.Use uma bomba peristáltica para carregar a amostra diluída na coluna. Derreta a coluna Q carregada na máquina HPLC, juntamente com buffers frescos de QA e QB. Execute a lavagem da bomba para lavar com sucesso a máquina com um a dois volumes de buffers de QB e QA.Após a última lavagem, defina a taxa de fluxo para um mililitro por minuto, e defina UV1 a 280 nanômetros e UV2 a 260 nanômetros, usando uma placa de poço de 96 profundidades para coletar as frações. Em seguida, use uma aplicação gradiente passo a passo de três a quatro volumes de cada concentração de agente de elução para elutar as proteínas, começando em uma concentração de 0% DE QB e aumentando a porcentagem em 5% cada vez. O complexo proteico N-0 P será eluto na concentração de buffer de 15%.Isole a proteína por filtragem de gel, em uma coluna de purificação de pequena escala por 30 centímetros, equilibrada com o buffer E.Em seguida, analise a proteína contendo frações pela página SDS. Para montagem nucleocáside específica do vírus, misture e incuba o complexo N-0 P purificado com oligo de RNA a uma razão molecular de 1:1,5 à temperatura ambiente por uma hora. Pré-equilibre uma coluna de filtragem de gel de purificação em pequena escala com e.buffer E.e remova qualquer precipitação por centrifugação.Carregue o supernante, para a coluna de cromatografia de exclusão de tamanho. E comparar as imagens de cromatografia de exclusão de tamanho da proteína com o conjunto de RNA, e amostras de controle somente de proteína, combinando as razões de pureza do ácido nucleico, para identificar quais são os picos montados N RNA, N-0 P e RNA livre. Para montar um complexo de RNA N, colete todas as frações de pico n RNA, realize uma extração de RNA e execute um gel de página de ureia para verificar novamente o comprimento do RNA específico.Para preparar uma grade de manchas negativas para microscopia eletrônica de manchas negativas, use uma placa de calor para aquecer 5 mL de água dupla destilada à ebulição e adicionar 37,5 miligramas de formação uranyl à água para obter uma solução de coloração formada de 0,75% uranyl. Transfira a solução para um béquer coberto de papel alumínio. E adicione quatro microliters de 10 hidróxido de sódio molar.Após 15 minutos de agitação protegido da luz, filtre a solução através de um filtro de 0,22 míccro em um tubo de ensaio. Para fazer as redes de microscopia eletrônica revestidas de carbono contínuas hidrofílicas, coloque as redes em uma câmara conectada a uma fonte de alimentação e aplique íons carregados negativamente nas redes. Corte e dobre uma tira de parafilme de duas por duas polegadas.Adicione duas gotas de 40 microliter de água destilada em uma extremidade da tira. E duas quedas de 40 microliter de 0,75% de uranyl formam solução de coloração para a outra extremidade. Adicione três microliters de amostra de proteína a cada grade.Após um minuto, bloqueie as grades contra papel manchador e mergulhe as grades duas vezes nas gotículas de água destiladas. E uma vez na primeira gota de solução de coloração. Em seguida, mergulhe a grade na segunda gota de solução de coloração por 30 segundos, antes de borrar as grades contra papel de mancha para remover qualquer solução de excesso de manchas e permitir que as grades sequem antes da imagem.Usando este protocolo, um complexo sincicial respiratório hetero dimeric solúvel em larga escala N0 P complexo pode ser obtido. Em E coli, a extensão total das porções N e N-terminal das proteínas P são co-expressas com uma etiqueta 10 X His na proteína N. Com base na razão de pureza nucleática de ácido nucleônico de absorção UV, n0 P continha tanto o comprimento completo N quanto o N-terminal P, mas não continha RNA celular.O N0 P purificado poderia então ser estimulado e montado em nucleocapsídeos como partículas em redes de microscopia eletrônica via incubação com oligos RNA específicos como demonstrado. Ao purificar a proteína evite bolhas de ar durante a purificação da coluna e dilua a amostra com tampão de QA para ajustar a concentração de pH e sal antes de carregar a amostra na coluna. Tome cuidado para manter as redes de microscopia eletrônica na borda externa para evitar contaminar as grades.Isso nos ajudará a determinar as questões não positivas de embalagem do genoma RSV, se é estrutura helicoidal canhota ou destro. Seguindo esses procedimentos e autenticando um modelo de RNA para o ensaio de atividade de polimerase RSV pode ser realizado. E este nucleocapsídeo específico viral RSV pode ser usado para a análise crio EM de alta resolução.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Examinando Assembleia proteosoma com recombinante Archaea proteasomas e não desnaturante PAGE: The Case for uma abordagem combinada

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

Bioquímica

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolamento e medições respiratória de mitocôndrias de Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Geração de nativos, sem marcas de formatação da huntingtina Exon1 monômero e fibrilas usando uma estratégia de fusão de sumô

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Manipulando células vivas para construir estável montagem celular 3D sem andaime Artificial

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project

Como estabilizar a proteína: telas de estabilidade Thermal turnos, ensaios e Nano diferencial digitalização fluorimétrico no projeto vírus-X

The Horizon2020 Virus-X project was established in 2015 to explore the virosphere of selected extreme biotopes and discover novel viral proteins. To ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Eletroforese nativa clara/azul híbrida para a separação e análise de supercomplexos de cadeia respiratória mitocondrial

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy

Estruturas de nível molecular interfacial de polímeros e biomacromoléculas reveladas através de espectroscopia vibracional de geração de frequência de soma

As a second-order nonlinear optical spectroscopy, sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy has widely been used in investigating various ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-tempo, semi-automatizado de medição fluorescente do pH líquido de superfície das vias aéreas das células epiteliais das vias aéreas humanas primárias

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Avançando a imagem de alta resolução de conjuntos de vírus em líquido e gelo

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...