Name: generation and assembly of virus-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus
Uploaded: 2021-07-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus at JoVE.com

Исследовательские программы в лаборатории Лян в Эмори поддерживаются Национальным институтом общих медицинских наук США (NIGMS), Национальными институтами здравоохранения (NIH) под номером R01GM130950 и Фондом исследовательских стартапов в Медицинской школе Университета Эмори. Автор благодарит членов лаборатории Лян за полезную поддержку и критическое обсуждение.

1. Молекулярное клонирование
ПРИМЕЧАНИЕ: Независимое клонирование лигазы (LIC) использовалось для создания плазмиды бицистронной коэкспрессии RSV. LIC - это метод, разработанный в начале 1990-х годов, который использует активность 3'-5' Экзо ДНК-полимеразы Т4 для создания ...

<ol>
	<li>Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+and+replication+of+nonsegmented+negative-strand+RNA+viruses.">Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).</li><li>Lamb, R. A., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields virology. , (2013).</li><li>Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+syncytial+virus:+virology,+reverse+genetics,+and+pathogenesis+of+disease.">Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).</li><li>Fearns, R., Deval, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+antiviral+approaches+for+respiratory+syncytial+virus+and+other+mononegaviruses:+Inhibiting+the+RNA+polymerase.">New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase.</a> Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).</li><li>Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+replication+by+respiratory+syncytial+virus+(RSV)+is+directed+by+the+N,+P,+and+L+proteins;+transcription+also+occurs+under+these+conditions+but+requires+RSV+superinfection+for+efficient+synthesis+of+full-length+mRNA.">RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA.</a> Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).</li><li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+metapneumovirus+polymerase+phosphoprotein+complex.">Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex.</a> Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).</li><li>Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+rabies+virus+polymerase+complex+from+electron+cryo-microscopy.">Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).</li><li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+respiratory+syncytial+virus+RNA+polymerase.">Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase.</a> Nature Communications. 11 (1), 368 (2020).</li><li>Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+paramyxovirus+polymerase+complex+reveals+a+unique+methyltransferase-CTD+conformation.">Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).</li><li>Gilman, M. S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Respiratory+Syncytial+Virus+Polymerase+Complex.">Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex.</a> Cell. 179 (1), 193-204 (2019).</li><li>Liang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+L+Protein+of+Vesicular+Stomatitis+Virus+from+Electron+Cryomicroscopy.">Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy.</a> Cell. 162 (2), 314-327 (2015).</li><li>Jenni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Vesicular+Stomatitis+Virus+L+Protein+in+Complex+with+Its+Phosphoprotein+Cofactor.">Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor.</a> Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).</li><li>Renner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocapsid+assembly+in+pneumoviruses+is+regulated+by+conformational+switching+of+the+N+protein.">Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein.</a> Elife. 5, 12627 (2016).</li><li>Cox, R. M., Plemper, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+organization+of+paramyxovirus+particles.">Structure and organization of paramyxovirus particles.</a> Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).</li><li>Desfosses, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+vesicular+stomatitis+virus+nucleocapsid+into+a+bullet+shape.">Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape.</a> Nature Communications. 4, 1429 (2013).</li><li>Green, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+mechanism+for+RNA+encapsidation+by+negative-strand+RNA+viruses.">Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses.</a> Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).</li><li>Jamin, M., Yabukarski, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsegmented+Negative-Sense+RNA+Viruses-Structural+Data+Bring+New+Insights+Into+Nucleocapsid+Assembly.">Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly.</a> Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).</li><li>Wan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+assembly+of+the+Ebola+virus+nucleocapsid.">Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid.</a> Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).</li><li>Mendes, A., Kuhn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alphavirus+Nucleocapsid+Packaging+and+Assembly.">Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly.</a> Viruses. 10 (3), (2018).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+trackable+assembly+of+RNA-specific+nucleocapsids+of+the+respiratory+syncytial+virus.">In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).</li><li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+(LIC-PCR).">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).</li><li>Li, C., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation+independent+cloning+irrespective+of+restriction+site+compatibility.">Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility.</a> Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).</li><li>Green, R., Rogers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+chemically+competent+E.+coli.">Transformation of chemically competent E. coli.</a> Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).</li><li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM.">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li><li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Staining+and+Image+Classification+-+Powerful+Tools+in+Modern+Electron+Microscopy.">Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy.</a> Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).</li><li>Aebi, U., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glow+discharge+unit+to+render+electron+microscope+grids+and+other+surfaces+hydrophilic.">A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic.</a> Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).</li><li>Green, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Access+to+RNA+encapsidated+in+the+nucleocapsid+of+vesicular+stomatitis+virus.">Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus.</a> Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).</li><li>Alvarez Paggi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conformational+switch+balances+viral+RNA+accessibility+and+protection+in+a+nucleocapsid+ring+model.">A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).</li><li>Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+vesicular+stomatitis+virus+nucleoprotein-RNA+complex.">Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex.</a> Science. 313 (5785), 357-360 (2006).</li><li>Tawar, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+nucleocapsid-like+nucleoprotein-RNA+complex+of+respiratory+syncytial+virus.">Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus.</a> Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).</li><li>Galloux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+viral+phosphoprotein+binding+site+on+the+surface+of+the+respiratory+syncytial+nucleoprotein.">Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein.</a> Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).</li><li>Milles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembly+of+Measles+Virus+Nucleocapsid-like+Particles:+Kinetics+and+RNA+Sequence+Dependence.">Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence.</a> Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).</li><li>Desfosses, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+cryo-EM+structures+of+RNA-specific+measles+virus+nucleocapsids+provide+mechanistic+insight+into+paramyxoviral+replication.">Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).</li></ol>

Известные структуры нуклеокапсидоподобных частиц (NCLP) несегментированных РНК-вирусов отрицательного смысла (NNS) показывают, что собранные NCLP представляют собой комплекс N с клеточными РНК хозяина при сверхэкспрессии в бактериальных или эукариотических системах экспрессии15,...

Несегментированные РНК-вирусы отрицательного смысла (NNS) включают в себя многие значимые патогены человека, такие как бешенство, Эбола и респираторно-синцитиальный вирус (RSV)1,2. РСВ является основной причиной респираторных заболеваний, таких как бронхиолит и пневмония у маленьких детей и пожилых людей во всем мире3. В настоящее время нет эффективных вакцин или противовирусных препаратов для профилактики или лечения RSV4. Как часть жизненного цикла, геном RSV служит шаблоном для репликации RSV-РНК-зависимой РНК-полимеразой для получения антигенома, который, в свою очередь, действует как шаблон для генерации генома потомства. Как геномные, так и антигеномные РНК полностью инкапсированы нуклеопротеином (N) с образованием нуклеокапсидов(НК) 3. Поскольку НК служат шаблонами как для репликации, так и для транскрипции полимеразой RSV, правильная сборка NC имеет решающее значение для полимеразы, чтобы получить доступ к шаблонам синтеза РНК5. Интересно, что на основе структурного анализа вирусных полимераз NNS предполагается, что несколько N-белков временно диссоциируют от НК, чтобы обеспечить доступ полимеразы и повторно привязываться к РНК после синтеза РНК6,7,8,9,10,11,12.
В настоящее время установлен анализ полимеризации РНК РСВ с использованием очищенной РСВ-полимеразы на коротких голых РНК-шаблонах13,14. Однако активность РСВ-полимеразы не достигает оптимального, как это наблюдается в необрабатывающих и абортивных продуктах, образующихся RSV-полимеразой при использовании голых шаблонов РНК. Отсутствие NC с вирус-специфической РНК является основным барьером для дальнейшего механистического понимания синтеза РНК RSV. Поэтому использование аутентичного шаблона РНК становится критической необходимостью для продвижения фундаментальных знаний о синтезе РНК RSV. Известные структуры нуклеокапсидоподобных частиц (NCLP) из RSV и других РНК-вирусов NNS показывают, что РНК в NCLP являются либо случайными клеточными РНК, либо средними вирусными геномными РНК15,16,17,18,19. В совокупности основное препятствие заключается в том, что N связывается не специфически с клеточными РНК, образуя NCLP, когда N чрезмерно экспрессируется в клетках-хозяевах.
Чтобы преодолеть это препятствие, мы установили протокол для получения без РНК (N0)и сборки N0 с подлинной вирусной геномной РНК в NCLP20. Принцип этого протокола заключается в получении большого количества рекомбинантного РНК-свободного N(N0)путем совместной экспрессии N с шапероном, N-концевым доменом RSV фосфопротеина (PNTD). Очищенный N 0 P можетбытьстимулирован и собран в NCLP путем добавления RSV-специфических олигов РНК, и во время процесса сборки шаперон PNTD смещается при добавлении ОлигоС РНК.
Здесь мы подробно описываем протокол для генерации и сборки РНК-специфических для RSV НК. В этом протоколе мы описываем молекулярное клонирование, подготовку белка, сборку in vitro и валидацию сложной сборки. Выделена стратегия клонирования для создания бицистронных конструкций для коэкспрессии белка для молекулярного клонирования. Для приготовления белка мы описываем процедуры клеточной культуры, экстракции белка и очистки белкового комплекса. Затем мы обсудим метод сборки in vitro РНК-специфических НК RSV. Наконец, мы используем хроматографию исключения размеров (SEC) и электронную микроскопию с отрицательным пятном (EM) для характеристики и визуализации собранных NCLP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1293px;" width="1293">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Agarose</td>
			<td style="width:302px;">SIgma</td>
			<td style="width:301px;">A9539-500G</td>
			<td style="width:319px;">making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>concentrate the protein sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Ampicillin sodium</td>
			<td style="width:302px;">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td style="width:301px;">5118.111317A</td>
			<td>antibiotic for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">AseI</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">R0526S</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cobalt (High Density) Agarose Beads</td>
			<td style="width:302px;">Gold Bio</td>
			<td>H-310-500</td>
			<td>For purification of His-tag protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Corning LSE Digital Dry Bath Heater</td>
			<td style="width:302px;">CORNING</td>
			<td style="width:301px;">6885-DB</td>
			<td>Heate the sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">dCTP</td>
			<td style="width:302px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:301px;">10217016</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">dGTP</td>
			<td style="width:302px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:301px;">10218014</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Glycerol</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">G5516-4L</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HEPES</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">H3375-100G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HiTrap Q HP</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">GE29-0513-25</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Imidazole</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">I5513-100G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)</td>
			<td style="width:302px;">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td style="width:301px;">1116.071717A</td>
			<td>induce the expression of protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:302px;">VWR</td>
			<td style="width:301px;">47730-598</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor</td>
			<td style="width:302px;">SpectraLab</td>
			<td style="width:301px;">MSX-XL-2020</td>
			<td>sonicator for lysing cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Negative stain grids</td>
			<td style="width:302px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:301px;">CF400-Cu-TH</td>
			<td>For making negative stain grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">New Brunswick Innova 44/44R</td>
			<td style="width:302px;">eppendorf</td>
			<td style="width:301px;">M1282-0000</td>
			<td>Shaker for culturing the cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Nonidet P 40 Substitute</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">74385-1L</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">OneTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">M0480L</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:302px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:301px;">28706</td>
			<td>Purify DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">SSPI-HF</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">R3132S</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td>GE29-0915-96</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">T4 DNA polymerase</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td>70099-3</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td style="width:302px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:301px;">36-101-0816</td>
			<td>Centrifuge, highest speed 20,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Trizma hydrochloride</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">T3253-250G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Uranyl Formate</td>
			<td style="width:302px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:301px;">22451</td>
			<td>making negative stain solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and assembly of virus-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus

Использование аутентичного шаблона РНК имеет решающее значение для продвижения фундаментальных знаний о синтезе вирусной РНК, которые могут направлять как механистическое открытие, так и разработку анализов в вирусологии. РНК-шаблон несегментированных РНК-вирусов с отрицательным смыслом (NNS), таких как респираторно-синцитиальный вирус (RSV), представляет собой не только молекулу РНК, а скорее инкапсидированный комплекс рибонуклеопротеинов нуклеопротеинов (N). Несмотря на важность аутентичного шаблона РНК, генерация и сборка такого рибонуклеопротеинового комплекса остаются сложными и требуют глубокого выяснения. Основная проблема заключается в том, что сверхэкспрессированный RSV N связывается не зреть с клеточными РНК с образованием случайных нуклеокапсидоподобных частиц (NCLP). Здесь мы установили протокол для полученияN(N0)без РНК сначала путем совместной экспрессии N с шапероном фосфопротеином (P), затем сборки N0 с олигосами РНК с RSV-специфической последовательностью РНК для получения вирус-специфических нуклеокапсидов (НК). Этот протокол показывает, как преодолеть трудности в приготовлении этого традиционно сложного вирусного рибонуклеопротеинового комплекса.

Очистка не-РНК-свободного N0P белка С помощью этого протокола можно получить крупномасштабный растворимый гетеродимерный комплекс RSV N0P. Полная длина N и N концевой части P-белков была совместно экспрессирована с 10X His-Tag на N-белке в E. coli. N0P очищали с помощью...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus at JoVE.com

Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

Для углубленного механистического анализа синтеза РНК респираторно-синцитиального вируса (RSV) мы сообщаем протокол использования шаперон-фосфопротеина (P) для коэкспрессии свободного от РНК нуклеопротеина (N0)для последующей сборки in vitro вирус-специфических нуклеокапсидов (НК).

Генерация и сборка вирус-специфических нуклеокапсидов респираторно-синцитиального вируса

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

Этот метод использует различные способы решения проблем экспрессии рекомбинантного вирусного белка с использованием одного вирусного белка P'as шаперона для другого вирусного белка N', чтобы получить N-белки без РНК. Белок RSV N, не свободный от РНК, получают перед сборкой вирус-специфической РНК в нуклеокапсид in vitro. Метод также может быть использован с другими несегментарными вирусами отрицательной смысловой РНК.Независимый метод лигирования является быстрым методом получения конструкций коэкспрессии. Почему или факультативы окрашивают электронный микроскоп является быстрым методом проверки крупной сборки в сырой клетке. Мы хотим дать вам два совета.Во-первых, получите высокую урожайность и солидные результаты для каждого шага, прежде чем переходить к следующему шагу. Во-вторых, настройте правильные программы для хроматографии и попрактикуйтесь в подборе сеток щипцами. Для бицистронной конструкции коэкспрессии N и P вырастите четыре однолитровые культуры штаммовых клеток E coli BL21DE3 в среде LB при 37 градусах Цельсия.Когда оптическая плотность на 600 нанометров достигнет 0,6, понизьте температуру до 16 градусов Цельсия. Через один час индуцируют экспрессию белка путем лечения 0,5 миллимолярным IPTG в течение ночи. На следующее утро соберите клетки путем центрифугирования и повторно суспендировать гранулы в 200 миллилитрах лизисного буфера.лизей клеток ультразвуком в течение 15 минут, с тремя секундами вкл. и тремя секундами выключения импульсов. И соберите лизаты путем центрифугирования. Загрузите супернатант в гравитационный столб кобальта 2,5 на 10 сантиметров с примерно 10 миллилитрами бусин.Предварительно уравновешивается от 5 до 10 столбцов объемов лизисного буфера. И промыть колонну с пятью колоннами объемов буфера B и пятью объемами буфера C. Используйте два объема буфера D для элюдировать белок из шариков. И уравновешивайте столбец Q пятью одном миллилитрными объемами буфера QA.Используйте перистальтический насос для загрузки разбавленного образца на колонну. Расплавите загруженную колонну Q на машине HPLC вместе со свежими буферами QA и QB. Запустите мойку насоса, чтобы успешно вымыть машину с одним-двумя объемами буферов QB и QA.После последней промывки установите скорость потока на один миллилитр в минуту и установите UV1 на 280 нанометров, а UV2 на 260 нанометров, используя пластину скважины глубиной 96 для сбора фракций. Затем используйте ступенчатое градиентное применение трех-четырех объемов каждой концентрации элюдионного агента для элюирования белков, начиная с концентрации 0% QB и увеличивая процент на 5% каждый раз. Белковый комплекс N-0 P элюирован при 15% буферной концентрации QB.Выделяют белок путем гелевой фильтрации, в одну на 30 сантиметров мелкомасштабную очистительной колонну, уравновешенную буфером Е. Затем проанализируйте белок, содержащий фракции, по странице SDS. Для сборки специфического для вируса нуклеокапсида смешайте и инкубируем очищенный комплекс N-0 P с Олиго РНК в молекулярном соотношении 1:1,5 при комнатной температуре в течение одного часа. Предварительно уравновешивайте небольшую фильтрующую колонну гелевого очистителя с буфером E. И удалите любые осадки центрифугированием.Загрузите супернатант, к размеру исключив хроматографическую колонку. И сравните размерные хроматографические изображения белка с сборкой РНК и только контрольные образцы белка, комбинируя соотношения чистоты нуклеиновых кислот, чтобы определить, какими пиками являются собранные N РНК, N-0 P и свободная РНК. Чтобы собрать комплекс N РНК, соберите все пиковые фракции N РНК, выполните экстракцию РНК и запустите гель с мочевиной, чтобы дважды проверить длину конкретной РНК.Чтобы подготовить сетку отрицательных пятен для электронной микроскопии отрицательного пятна, используйте тепловую пластину для нагревания 5 мл двойной дистиллированной воды до кипения и добавьте 37,5 миллиграмма уранилформиата в воду для получения 0,75% раствора для окрашивания уранилформиата. Переложите раствор на покрытый алюминиевой фольгой мукер. И добавьте четыре микролитра 10 молярного гидроксида натрия.После 15 минут перемешивания, защищенного от света, процедить раствор через фильтр 0,22 мкм в пробирку. Чтобы сделать сетки непрерывной электронной микроскопии с углеродным покрытием гидрофильными, поместите решетки в камеру, подключенную к источнику питания, и примените отрицательно заряженные ионы к сетям. Вырежьте и сложите полоску парапленки два на два дюйма.Добавьте две 40 микролитровой капли дистиллированной воды на один конец полоски. И две 40 микролитровые капли 0,75% раствора для окрашивания уранилформата на другой конец. Добавьте три микролитра образца белка в каждую сетку.Через минуту заблокируйте сетки от промокающей бумаги и дважды окуните сетки в дистиллированные капли воды. И один раз в первом окрашивающем растворе капельки. Затем погрузите сетку во вторую каплю окрашивающего раствора на 30 секунд, прежде чем смать сетки на промокатурной бумаге, чтобы удалить лишний раствор пятен и дать сеткам высохнуть на воздухе перед визуализацией.С помощью этого протокола можно получить крупномасштабный растворимый гетеродимерный респираторно-синцитиальный комплекс вируса N0 P. В E coli полная длина N и N-концевой частей P-белков совместно экспрессируется с 10 X Его меткой на N-белке. Основываясь на коэффициенте чистоты поглощения УФ-излучения нуклеиновых кислот, N0 P содержал как N полной длины, так и N-концевой P, но не содержал клеточной РНК.Очищенный N0 P затем может быть стимулирован и собран в нуклеокапсидоподобные частицы на сетках электронной микроскопии путем инкубации со специфическими олигосами РНК, как показано на демонстрации. При очистке белка избегайте пузырьков воздуха во время очистки колонны и разбавьте образец буфером QA для регулировки pH и концентрации соли перед загрузкой образца на колонну. Позаботьтесь о том, чтобы держать сетки электронной микроскопии на внешнем краю, чтобы избежать заражения сеток.Это поможет нам определить неположительный rsV-геном упаковочный вопрос, будь то левосторонняя или правосторонняя спиральная структура. Следуя этим процедурам и аутентичному шаблону РНК для анализа активности RSV-полимеразы, можно выполнить. И этот rsV вирусный специфический нуклеокапсид может быть использован для криоЭМ-анализа высокого разрешения.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Изучение протеасоме Ассамблею с рекомбинантным архейных Протеасомы и нативных ПААГ: Случай для комбинированного подхода

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Изоляция и дыхательных измерения митохондрий от Резуховидка Таля

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Поколения родной, расставленными гентингтина Exon1 мономера и фибрилл, используя стратегию Fusion сумо

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Манипулируя живых клеток для построения стабильной 3D сотовой Ассамблеи без искусственных лесов

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project

Как для стабилизации белка: стабильность экраны для тепловых сдвиг анализов и Nano дифференциальная сканирующая флуориметрия в проекте вирус X

The Horizon2020 Virus-X project was established in 2015 to explore the virosphere of selected extreme biotopes and discover novel viral proteins. To ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Гибридный ясный/синий родной электрофорез для разделения и анализа митохондриальных Сверхкомплексов дыхательной цепи

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy

Межфамальные молекулярные структуры полимеров и биомакромолекул, выявленные с помощью вибрационной спектроскопии генерации Sum

As a second-order nonlinear optical spectroscopy, sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy has widely been used in investigating various ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

В режиме реального времени, полуавтоматические флуоресцентные измерения воздуха поверхности жидкости рН первичных человеческих дыхательных путей эпителиальных клеток

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Усовершенствование визуализации вирусных сборок с высоким разрешением в жидкости и льду

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...