Name: generation and assembly of virus-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus
Uploaded: 2021-07-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus at JoVE.com

Los programas de investigación en el laboratorio Liang en Emory son apoyados por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Estados Unidos (NIGMS), los Institutos Nacionales de Salud (NIH) bajo el número de premio R01GM130950 y el Fondo de Investigación inicial de la Facultad de Medicina de la Universidad de Emory. El autor reconoce a los miembros del laboratorio de Liang por su apoyo útil y su discusión crítica.

1. Clonación molecular
NOTA: La clonación independiente de ligasa (LIC) se utilizó para hacer un plásmido de construcción de coexpresión bi-cistrónica del VSR. LIC es un método desarrollado a principios de la década de 1990, que utiliza la actividad 3'-5' Exo de la ADN polimerasa T4 para crear voladizos con complementariedad entre el vector y el inserto de ADN21,22. Las construcciones se realizaron utilizando el...

<ol>
	<li>Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+and+replication+of+nonsegmented+negative-strand+RNA+viruses.">Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).</li><li>Lamb, R. A., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields virology. , (2013).</li><li>Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+syncytial+virus:+virology,+reverse+genetics,+and+pathogenesis+of+disease.">Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).</li><li>Fearns, R., Deval, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+antiviral+approaches+for+respiratory+syncytial+virus+and+other+mononegaviruses:+Inhibiting+the+RNA+polymerase.">New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase.</a> Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).</li><li>Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+replication+by+respiratory+syncytial+virus+(RSV)+is+directed+by+the+N,+P,+and+L+proteins;+transcription+also+occurs+under+these+conditions+but+requires+RSV+superinfection+for+efficient+synthesis+of+full-length+mRNA.">RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA.</a> Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).</li><li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+metapneumovirus+polymerase+phosphoprotein+complex.">Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex.</a> Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).</li><li>Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+rabies+virus+polymerase+complex+from+electron+cryo-microscopy.">Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).</li><li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+respiratory+syncytial+virus+RNA+polymerase.">Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase.</a> Nature Communications. 11 (1), 368 (2020).</li><li>Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. 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M., Plemper, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+organization+of+paramyxovirus+particles.">Structure and organization of paramyxovirus particles.</a> Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).</li><li>Desfosses, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+vesicular+stomatitis+virus+nucleocapsid+into+a+bullet+shape.">Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape.</a> Nature Communications. 4, 1429 (2013).</li><li>Green, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+mechanism+for+RNA+encapsidation+by+negative-strand+RNA+viruses.">Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses.</a> Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).</li><li>Jamin, M., Yabukarski, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsegmented+Negative-Sense+RNA+Viruses-Structural+Data+Bring+New+Insights+Into+Nucleocapsid+Assembly.">Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly.</a> Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).</li><li>Wan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+assembly+of+the+Ebola+virus+nucleocapsid.">Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid.</a> Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).</li><li>Mendes, A., Kuhn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alphavirus+Nucleocapsid+Packaging+and+Assembly.">Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly.</a> Viruses. 10 (3), (2018).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+trackable+assembly+of+RNA-specific+nucleocapsids+of+the+respiratory+syncytial+virus.">In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).</li><li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+(LIC-PCR).">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).</li><li>Li, C., Evans, R. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+chemically+competent+E.+coli.">Transformation of chemically competent E. coli.</a> Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).</li><li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM.">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li><li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Staining+and+Image+Classification+-+Powerful+Tools+in+Modern+Electron+Microscopy.">Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy.</a> Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).</li><li>Aebi, U., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glow+discharge+unit+to+render+electron+microscope+grids+and+other+surfaces+hydrophilic.">A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic.</a> Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).</li><li>Green, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Access+to+RNA+encapsidated+in+the+nucleocapsid+of+vesicular+stomatitis+virus.">Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus.</a> Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).</li><li>Alvarez Paggi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conformational+switch+balances+viral+RNA+accessibility+and+protection+in+a+nucleocapsid+ring+model.">A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).</li><li>Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+vesicular+stomatitis+virus+nucleoprotein-RNA+complex.">Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex.</a> Science. 313 (5785), 357-360 (2006).</li><li>Tawar, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+nucleocapsid-like+nucleoprotein-RNA+complex+of+respiratory+syncytial+virus.">Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus.</a> Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).</li><li>Galloux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+viral+phosphoprotein+binding+site+on+the+surface+of+the+respiratory+syncytial+nucleoprotein.">Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein.</a> Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).</li><li>Milles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembly+of+Measles+Virus+Nucleocapsid-like+Particles:+Kinetics+and+RNA+Sequence+Dependence.">Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence.</a> Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).</li><li>Desfosses, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+cryo-EM+structures+of+RNA-specific+measles+virus+nucleocapsids+provide+mechanistic+insight+into+paramyxoviral+replication.">Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).</li></ol>

Las estructuras conocidas de partículas similares a nucleópsides (NCLP) de los virus de ARN de sentido negativo no segmentado (NNS) muestran que los NCLPs ensamblados son el complejo N con ARN celulares del huésped cuando se sobreexpresan en sistemas de expresión bacterianos o eucariotas15,16,17,18,19. Estudios anteriores han intentado obtener el ARN libre...

Los virus de ARN de sentido negativo no segmentado (NNS) incluyen muchos patógenos humanos significativos, como la rabia, el ébola y el virus sincitial respiratorio (RSV)1,2. El RSV es la principal causa de enfermedades respiratorias como la bronquiolitis y la neumonía en niños pequeños y adultos mayores en todo el mundo3. Actualmente, no hay vacunas efectivas o terapias antivirales disponibles para prevenir o tratar el RSV4. Como parte del ciclo de vida, el genoma del RSV sirve como la plantilla para la replicación por la ARN polimerasa dependiente del ARN del RSV para producir un antigenoma, que a su vez actúa como la plantilla para generar un genoma de progenie. Tanto el genoma como el antigenoma RNAs son totalmente encapsidados por la nucleoproteína (N) para formar las nucleocápsides (NCs)3. Debido a que los CN sirven como plantillas tanto para la replicación como para la transcripción por la ARSV polimerasa, el ensamblaje adecuado de NC es crucial para que la polimerasa obtenga acceso a las plantillas para la síntesis de ARN5. Curiosamente, basándose en los análisis estructurales de las polimerasas virales NNS, se presume que varias proteínas N se disocian transitoriamente de las NCs para permitir el acceso de la polimerasa y reenlazarse al ARN después de la síntesis de ARN6,7,8,9,10,11,12.
Actualmente, el ensayo de polimerización de ARN del RSV se ha establecido utilizando la polimerasa purificada del RSV en plantillas cortas de ARN desnudo13,14. Sin embargo, las actividades de la RSV polimerasa no alcanzan el óptimo, como se observa en los productos no procesivos y abortivos generados por la RSV polimerasa cuando se utilizan plantillas de ARN desnudo. La carencia del NC con el ARN virus-específico es una barrera primaria para la comprensión mecanicista adicional de la síntesis del ARN de RSV. Por lo tanto, el uso de una plantilla de ARN auténtica se convierte en una necesidad crítica para avanzar en el conocimiento fundamental de la síntesis de ARN del RSV. Las estructuras conocidas de las partículas similares a nucleocáps (NCLPs) del RSV y otros virus de ARN del NNS revelan que los ARN en los NCLPs son ARN celulares aleatorios o ARN genómicos virales promedio15,16,17,18,19. Juntos, el principal obstáculo es que N se une no específicamente a los RNAs celulares para formar NCLPs cuando N se sobreexpresa en las células huésped.
Para superar este obstáculo, establecimos un protocolo para obtener primero RNA-libre (N0)y ensamblar N0 con ARN genómico viral auténtico en NCLPs20. El principio de este protocolo es obtener una gran cantidad de N libre de ARN recombinante (N0)coexpresando N con una chaperona, el dominio N-terminal de la fosfoproteína del VSR (PNTD). El N0P purificado podría ser estimulado y ensamblado en NCLPs mediante la adición de oligos de ARN específicos del RSV, y durante el proceso de ensamblaje, la chaperona PNTD se desplaza tras la adición de oligos de ARN.
Aquí, detallamos un protocolo para la generación y el montaje de RSV ARN-específico NCs. En este protocolo, se describe la clonación molecular, la preparación de proteínas, el ensamblaje in vitro y la validación del ensamblaje complejo. Destacamos la estrategia de clonación para generar construcciones bi-cistrónicas para la coexpresión de proteínas para la clonación molecular. Para la preparación de proteínas, se describen los procedimientos de cultivo celular, extracción de proteínas, y la purificación del complejo proteico. A continuación, discutimos el método para el montaje in vitro de los NCs específicos de ARN del RSV. Finalmente, utilizamos la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) y la microscopía electrónica de manchas negativas (EM) para caracterizar y visualizar los NCLPs ensamblados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1293px;" width="1293">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Agarose</td>
			<td style="width:302px;">SIgma</td>
			<td style="width:301px;">A9539-500G</td>
			<td style="width:319px;">making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>concentrate the protein sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Ampicillin sodium</td>
			<td style="width:302px;">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td style="width:301px;">5118.111317A</td>
			<td>antibiotic for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">AseI</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">R0526S</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cobalt (High Density) Agarose Beads</td>
			<td style="width:302px;">Gold Bio</td>
			<td>H-310-500</td>
			<td>For purification of His-tag protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Corning LSE Digital Dry Bath Heater</td>
			<td style="width:302px;">CORNING</td>
			<td style="width:301px;">6885-DB</td>
			<td>Heate the sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">dCTP</td>
			<td style="width:302px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:301px;">10217016</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">dGTP</td>
			<td style="width:302px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:301px;">10218014</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Glycerol</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">G5516-4L</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HEPES</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">H3375-100G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HiTrap Q HP</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">GE29-0513-25</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Imidazole</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">I5513-100G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)</td>
			<td style="width:302px;">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td style="width:301px;">1116.071717A</td>
			<td>induce the expression of protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:302px;">VWR</td>
			<td style="width:301px;">47730-598</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor</td>
			<td style="width:302px;">SpectraLab</td>
			<td style="width:301px;">MSX-XL-2020</td>
			<td>sonicator for lysing cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Negative stain grids</td>
			<td style="width:302px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:301px;">CF400-Cu-TH</td>
			<td>For making negative stain grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">New Brunswick Innova 44/44R</td>
			<td style="width:302px;">eppendorf</td>
			<td style="width:301px;">M1282-0000</td>
			<td>Shaker for culturing the cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Nonidet P 40 Substitute</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">74385-1L</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">OneTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">M0480L</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:302px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:301px;">28706</td>
			<td>Purify DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">SSPI-HF</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">R3132S</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td>GE29-0915-96</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">T4 DNA polymerase</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td>70099-3</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td style="width:302px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:301px;">36-101-0816</td>
			<td>Centrifuge, highest speed 20,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Trizma hydrochloride</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">T3253-250G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Uranyl Formate</td>
			<td style="width:302px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:301px;">22451</td>
			<td>making negative stain solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and assembly of virus-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus

El uso de una plantilla de ARN auténtica es fundamental para avanzar en el conocimiento fundamental de la síntesis de ARN viral que puede guiar tanto el descubrimiento mecanicista como el desarrollo de ensayos en virología. La plantilla del ARN de los virus nonsegmented del ARN del negativo-sentido (NNS), tales como el virus sincitial respiratorio (RSV), no es una molécula del ARN solamente sino algo un complejo encapsidated de la ribonucleoprotein de la nucleoproteína (N). A pesar de la importancia de la plantilla auténtica del ARN, la generación y el montaje de tal complejo del ribonucleoprotein siguen siendo sofisticados y requieren la aclaración profundizada. El principal desafío es que el RSV N sobreexpresado se une no específicamente a los ARN celulares para formar partículas aleatorias similares a nucleocáps (NCLPs). Aquí, establecimos un protocolo para obtener N libre de ARN (N0)primero co-expresando N con una fosfoproteína chaperona (P), luego ensamblando N0 con oligos de ARN con la secuencia de ARN específica del RSV para obtener nucleocápsides específicas del virus (NCs). Este protocolo muestra cómo superar la dificultad en la preparación de este complejo viral tradicionalmente desafiando del ribonucleoprotein.

Purificación de la proteína N0P libre de ARN Con este protocolo, se puede obtener un complejo heterodmérico soluble A gran escala RSV N0P. La longitud completa de la parte terminal N y N de las proteínas P se co-expresó con 10X His-Tag en la proteína N en E. coli. N0P fue purificado usando una columna del cobalto, un intercambio iónico, y una cromatografía de la exclusión del tamaño. N0P contiene tanto el terminal N de longitud completa co...

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Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

Para el análisis mecánico profundizado de la síntesis sincitial respiratoria del ARN del virus (RSV), divulgamos un protocolo de utilizar la fosfoproteína de la chaperona (p) para el coexpression de la nucleoproteína ARN-libre (N0)para el montaje in vitro subsecuente de las nucleocápsides virus-específicas (NCs).

Generación Y Ensamblaje De Nucleocápsides Específicas Del Virus Respiratorio Sincitial

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

Este método utiliza la diversa manera de abordar los desafíos de expresión de proteínas virales recombinantes utilizando una proteína viral P'as una chaperona para otra proteína viral N'para obtener proteínas N libres de ARN. La proteína N del RSV libre de ARN se obtiene antes de ensamblar el ARN específico del virus en nucleocáppsida in vitro. El método también se puede utilizar con otros virus de ARN de sentido negativo no segmentados.El método de clonación independiente de la ligadura es una técnica rápida para adquirir construcciones de coexpresión. ¿Por qué o electivas manchan el microscopio electrónico es un método rápido para comprobar el montaje grande en la célula cruda. Queremos darte dos consejos.Primero, obtenga resultados sólidos y de alto rendimiento para cada paso antes de pasar al siguiente paso. En segundo lugar, establezca programas adecuados para la cromatografía y practique la recolección de rejillas con tórceps. Para la construcción bi-cistrónica de la co-expresión N y P, cultivar cuatro cultivos de un litro de células de cepa E coli BL21DE3 en medio LB a 37 grados Celsius.Cuando la densidad óptica a 600 nanómetros alcance los 0,6, baje la temperatura a 16 grados centígrados. Después de una hora, induzca la expresión de proteínas mediante tratamiento con 0,5 milimolares IPTG durante la noche. A la mañana siguiente, recoger las células por centrifugación y resuspend los pellets en 200 mililitros de tampón de lisis.lyse las células por sonicación durante 15 minutos, con tres segundos en, tres segundos de pulsos. Y recoger los lysates por centrifugación. Cargue el sobrenadante en una columna de gravedad de cobalto de 2,5 por 10 centímetros, con aproximadamente 10 mililitros de perlas.Preequilibrado con volúmenes de 5 a 10 columnas de búfer de lisis. Y lave la columna con cinco volúmenes de columna de tampón B y cinco volúmenes de tampón C.Use dos volúmenes de tampón D para eluir la proteína de las perlas. Y equilibre la columna Q con cinco volúmenes de un mililitro de búfer de control de calidad.Utilice una bomba peristáltica para cargar la muestra diluida en la columna. Derrita la columna Q cargada en la máquina de HPLC, junto con los búferes de control de calidad y QB frescos. Ejecute el lavado de la bomba para lavar con éxito la máquina con uno o dos volúmenes de búferes QB y QA.Después del último lavado, establezca el caudal en un mililitro por minuto y establezca UV1 en 280 nanómetros y UV2 en 260 nanómetros, utilizando una placa de pozo de 96 profundidades para recoger las fracciones. A continuación, utilice una aplicación de gradiente escalonado de tres a cuatro volúmenes de cada concentración de agente de elución para eluir las proteínas, comenzando con una concentración de 0% QB y aumentando el porcentaje en un 5% cada vez. El complejo de la proteína de N-0 P elute en la concentración del almacenador intermediario del 15%QB.Aislar la proteína por filtración de gel, en una columna de purificación a pequeña escala de uno por 30 centímetros, equilibrada con tampón E.A continuación, analizar la proteína que contiene fracciones por sds página. Para el ensamblaje de nucleocápsides específicas del virus, mezcle e incube el complejo purificado N-0 P con RNA oligo a una relación molecular de 1:1.5 a temperatura ambiente durante una hora. Preequilibrar una columna de filtración de gel de purificación a pequeña escala con tampón E.Y eliminar cualquier precipitación por centrifugación.Cargue el sobrenadante, a la columna de cromatografía de exclusión de tamaño. Y compare las imágenes de cromatografía de exclusión de tamaño de la proteína con el ensamblaje de ARN, y las muestras de control de proteína sola, combinando las relaciones de pureza de ácidos nucleicos, para identificar qué picos son el ARN N ensamblado, N-0 P y ARN libre. Para ensamblar un complejo de ARN N, recoja todas las fracciones máximas de ARN N, realice una extracción de ARN y ejecute un gel de página de urea para verificar la longitud del ARN específico.Para preparar una rejilla de tinción negativa para microscopía electrónica de manchas negativas, use una placa de calor para calentar 5 mL de agua destilada doble a ebullición y agregue 37.5 miligramos de formiato de uranilo al agua para obtener una solución de tinción de formiato de uranilo al 0.75%. Transfiera la solución a un beaker cubierto de papel de aluminio. Y añadir cuatro microlitros de 10 molares de hidróxido de sodio.Después de 15 minutos de agitación protegidos de la luz, filtre la solución a través de un filtro de 0,22 micras en un tubo de ensayo. Para hacer que las rejillas de microscopía electrónica recubiertas de carbono continuo sean hidrofílicas, coloque las rejillas en una cámara conectada a una fuente de alimentación y aplique iones cargados negativamente a las redes. Corte y doble una tira de parafilm de dos por dos pulgadas.Agregue dos gotas de 40 microlitro de agua destilada a un extremo de la tira. Y dos 40 gotas de microlitro de 0.75% solución de tinción de formiato de uranilo en el otro extremo. Agregue tres microlitros de muestra de proteína a cada cuadrícula.Después de un minuto, bloquee las rejillas contra el papel secante y sumerja las rejillas dos veces en las gotas de agua destiladas. Y una vez en la primera gota de solución de tinción. Luego sumerja la rejilla en la segunda gota de la solución de tinción durante 30 segundos, antes de borrar las rejillas contra el papel secante para eliminar cualquier exceso de solución de manchas y permitir que las rejillas se sequen al aire antes de la toma de imágenes.Usando este protocolo, un complejo sincitial respiratorio hetero dimérico soluble en grande del virus N0 P puede ser obtenido. En E coli, la longitud completa de las porciones N y N-terminales de las proteínas P se co-expresan con una etiqueta 10 X His en la proteína N. De acuerdo con el ratio del ácido nucleico de la absorbancia ULTRAVIOLETA, N0 P contuvo la longitud completa N y el N-terminal P, pero no contuvo el ARN celular.El N0 P purificado podría entonces ser estimulado y ensamblado en nucleópsidas como partículas en rejillas de microscopía electrónica vía la incubación con oligos específicos del ARN según lo demostrado. Al purificar la proteína evitar burbujas de aire durante la purificación de la columna y diluir la muestra con tampón de QA para ajustar el pH y la concentración de sal antes de cargar la muestra en la columna. Tenga cuidado de mantener las rejillas de microscopía electrónica en el borde exterior para evitar contaminar las rejillas.Esto nos ayudará a determinar las preguntas no positivas del empaquetamiento del genoma del RSV, si se trata de la estructura helicoidal zurda o derecha. Siguiendo esos procedimientos y auténticos se puede realizar una plantilla de ARN para el ensayo de actividad de la POLIMERASA del RSV. Y esta nucleocáppsida específica viral del VR se puede utilizar para el análisis crio EM de alta resolución.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

El examen de la Asamblea proteasoma con recombinante arqueano Proteasomas y desnaturalizante PÁGINA: El Caso de un enfoque combinado

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

Investigación

Bioquímica

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Aislamiento y medidas respiratoria de las mitocondrias de Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Generación de monómero Exon1 huntingtina nativo, sin etiquetar y fibrillas utilizando una estrategia de fusión de SUMO

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Manipulación de células vivas para construir estable montaje celular 3D sin andamio Artificial

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project

Cómo estabilizar proteínas: pantallas estabilidad térmica cambio ensayos y diferencial de Nano fluorimetría en el proyecto de Virus X

The Horizon2020 Virus-X project was established in 2015 to explore the virosphere of selected extreme biotopes and discover novel viral proteins. To ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Híbrido claro/azul electroforesis nativa para la separación y análisis de Supercomplejos de cadenas respiratorias mitocondriales

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy

Estructuras interfaciales a nivel molecular de polímeros y biomacromoléculas reveladas a través de la espectroscopia vibratoria de generación de frecuencia de suma

As a second-order nonlinear optical spectroscopy, sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy has widely been used in investigating various ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

En tiempo real, semi-automatizado de medición fluorescente de la superficie de las vías respiratorias pH líquido de las células epiteliales de las vías respiratorias humanas primarias

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Avance de imágenes de alta resolución de ensamblajes de virus en líquido y hielo

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...