Name: generation and assembly of virus-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus
Uploaded: 2021-07-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus at JoVE.com

Forskningsprogram i Liang-laboratoriet vid Emory stöds av US National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), National Institutes of Health (NIH) under tilldelningsnummer R01GM130950 och Research Start-Up Fund vid Emory University School of Medicine. Författaren erkänner medlemmarna i Liang-laboratoriet för hjälpsamt stöd och kritisk diskussion.

1. Molekylär kloning
OBS: Ligase Independent Cloning (LIC) användes för att göra en RSV bi-cistronic coexpression konstruktion plasmid. LIC är en metod som utvecklades i början av 1990-talet och som använder 3'-5' Exo-aktiviteten hos T4 DNA-polymerasen för att skapa överhäng med komplementaritet mellan vektorn och DNA-insatsen21,22. Konstruktionerna gjordes med 2BT-10 vektor-DNA, som består av en 10x Hans tagg...

<ol>
	<li>Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+and+replication+of+nonsegmented+negative-strand+RNA+viruses.">Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).</li><li>Lamb, R. A., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields virology. , (2013).</li><li>Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+syncytial+virus:+virology,+reverse+genetics,+and+pathogenesis+of+disease.">Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).</li><li>Fearns, R., Deval, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+antiviral+approaches+for+respiratory+syncytial+virus+and+other+mononegaviruses:+Inhibiting+the+RNA+polymerase.">New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase.</a> Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).</li><li>Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+replication+by+respiratory+syncytial+virus+(RSV)+is+directed+by+the+N,+P,+and+L+proteins;+transcription+also+occurs+under+these+conditions+but+requires+RSV+superinfection+for+efficient+synthesis+of+full-length+mRNA.">RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA.</a> Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).</li><li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+metapneumovirus+polymerase+phosphoprotein+complex.">Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex.</a> Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).</li><li>Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+rabies+virus+polymerase+complex+from+electron+cryo-microscopy.">Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).</li><li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+respiratory+syncytial+virus+RNA+polymerase.">Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase.</a> Nature Communications. 11 (1), 368 (2020).</li><li>Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+paramyxovirus+polymerase+complex+reveals+a+unique+methyltransferase-CTD+conformation.">Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).</li><li>Gilman, M. S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Respiratory+Syncytial+Virus+Polymerase+Complex.">Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex.</a> Cell. 179 (1), 193-204 (2019).</li><li>Liang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+L+Protein+of+Vesicular+Stomatitis+Virus+from+Electron+Cryomicroscopy.">Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy.</a> Cell. 162 (2), 314-327 (2015).</li><li>Jenni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Vesicular+Stomatitis+Virus+L+Protein+in+Complex+with+Its+Phosphoprotein+Cofactor.">Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor.</a> Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).</li><li>Renner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocapsid+assembly+in+pneumoviruses+is+regulated+by+conformational+switching+of+the+N+protein.">Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein.</a> Elife. 5, 12627 (2016).</li><li>Cox, R. M., Plemper, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+organization+of+paramyxovirus+particles.">Structure and organization of paramyxovirus particles.</a> Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).</li><li>Desfosses, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+vesicular+stomatitis+virus+nucleocapsid+into+a+bullet+shape.">Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape.</a> Nature Communications. 4, 1429 (2013).</li><li>Green, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+mechanism+for+RNA+encapsidation+by+negative-strand+RNA+viruses.">Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses.</a> Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).</li><li>Jamin, M., Yabukarski, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsegmented+Negative-Sense+RNA+Viruses-Structural+Data+Bring+New+Insights+Into+Nucleocapsid+Assembly.">Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly.</a> Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).</li><li>Wan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+assembly+of+the+Ebola+virus+nucleocapsid.">Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid.</a> Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).</li><li>Mendes, A., Kuhn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alphavirus+Nucleocapsid+Packaging+and+Assembly.">Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly.</a> Viruses. 10 (3), (2018).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+trackable+assembly+of+RNA-specific+nucleocapsids+of+the+respiratory+syncytial+virus.">In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).</li><li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+(LIC-PCR).">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).</li><li>Li, C., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation+independent+cloning+irrespective+of+restriction+site+compatibility.">Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility.</a> Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).</li><li>Green, R., Rogers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+chemically+competent+E.+coli.">Transformation of chemically competent E. coli.</a> Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).</li><li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM.">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li><li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Staining+and+Image+Classification+-+Powerful+Tools+in+Modern+Electron+Microscopy.">Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy.</a> Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).</li><li>Aebi, U., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glow+discharge+unit+to+render+electron+microscope+grids+and+other+surfaces+hydrophilic.">A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic.</a> Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).</li><li>Green, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Access+to+RNA+encapsidated+in+the+nucleocapsid+of+vesicular+stomatitis+virus.">Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus.</a> Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).</li><li>Alvarez Paggi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conformational+switch+balances+viral+RNA+accessibility+and+protection+in+a+nucleocapsid+ring+model.">A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).</li><li>Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+vesicular+stomatitis+virus+nucleoprotein-RNA+complex.">Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex.</a> Science. 313 (5785), 357-360 (2006).</li><li>Tawar, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+nucleocapsid-like+nucleoprotein-RNA+complex+of+respiratory+syncytial+virus.">Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus.</a> Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).</li><li>Galloux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+viral+phosphoprotein+binding+site+on+the+surface+of+the+respiratory+syncytial+nucleoprotein.">Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein.</a> Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).</li><li>Milles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembly+of+Measles+Virus+Nucleocapsid-like+Particles:+Kinetics+and+RNA+Sequence+Dependence.">Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence.</a> Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).</li><li>Desfosses, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+cryo-EM+structures+of+RNA-specific+measles+virus+nucleocapsids+provide+mechanistic+insight+into+paramyxoviral+replication.">Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).</li></ol>

De kända nukleocapsidliknande partikelstrukturerna (NCLP) av de icke-segmenterade negativa RNA-virusen (NNS) visar att de monterade NCLPs är det komplexa N med värdulära RNAs när de överuttrycks i bakteriella eller eukaryota uttryckssystem15,16,17,18,19. Tidigare studier har försökt få RNA gratis N med en mängd olika metoder, såsom RNase A matsmält...

Icke-segmenterade NNS-RNA-virus (Negative Sense) inkluderar många signifikanta mänskliga patogener, såsom rabies, ebola och respiratoriskt syncytial virus (RSV)1,2. RSV är den främsta orsaken till luftvägssjukdom som bronkiolit och lunginflammation hos små barn och äldre vuxna över helavärlden 3. För närvarande finns inga effektiva vacciner eller antivirala behandlingar tillgängliga för att förebygga eller behandla RSV4. Som en del av livscykeln fungerar RSV-genomet som mall för replikering av RSV RNA-beroende RNA-polymeras för att producera ett antigenom, som i sin tur fungerar som mall för att generera ett avkommagenom. Både genom- och antigenom-RNAs är helt inkapslade av nukleoproteinet (N) för att bilda nukleokapslarna (NCs)3. Eftersom NCs fungerar som mallar för både replikering och transkription av RSV-polymerasen, är korrekt NC-sammansättning avgörande för att polymerasen ska få tillgång till mallarna för RNA-syntes5. Intressant nog, baserat på de strukturella analyserna av NNS virala polymeraser, är det hypotetiskt att flera N-proteiner övergående dissocierar från NCs för att tillåta tillgång till polymeras och återbindas till RNA efter RNA-syntesen6,7,8,9,10,11,12.
För närvarande har RSV RNA polymerisationsanalys etablerats med renad RSV-polymeras på korta nakna RNA-mallar13,14. RSV-polymerasens aktiviteter når dock inte optimalt, vilket observerats i de icke-processiva och abortiva produkter som genereras av RSV-polymerasen vid användning av nakna RNA-mallar. Bristen på NC med virusspecifikt RNA är en primär barriär för ytterligare mekanistisk förståelse av RSV RNA-syntesen. Därför blir användning av en autentisk RNA-mall ett kritiskt behov av att främja den grundläggande kunskapen om RSV RNA-syntes. De kända strukturerna hos nukleocapsidliknande partiklar (NCLPs) från RSV och andra NNS RNA-virus avslöjar att RNAs i NCLPs antingen är slumpmässiga cellulära RNAs eller genomsnittliga virala genomiska RNAs15,16,17,18,19. Tillsammans är det största hindret att N binder icke-specifikt till cellulära RNAs för att bilda NCLPs när N är överuttryckt i värdcellerna.
För att övervinna detta hinder etablerade vi ett protokoll för att få RNA-fri (N0)först och montera N0 med autentiskt viralt genomiskt RNA i NCLPs20. Principen för detta protokoll är att erhålla en stor mängd rekombinant RNA-fritt N (N0)genom att samremonera N med ett förkläde, N-terminaldomänen för RSV fosfoprotein (PNTD). Den renade N0P kunde stimuleras och monteras i NCLPs genom att lägga till RSV-specifika RNA oligos, och under monteringsprocessen förskjuts förkläde PNTD vid tillsats av RNA oligos.
Här beskriver vi ett protokoll för generering och montering av RSV RNA-specifika NCs. I detta protokoll beskriver vi molekylär kloning, proteinberedning, in vitro-montering och validering av den komplexa sammansättningen. Vi lyfter fram kloningsstrategin för att generera bi-cistronic konstruktioner för protein coexpression för molekylär kloning. För proteinberedning beskriver vi förfarandena för cellkultur, proteinutvinning och rening av proteinkomplexet. Sedan diskuterar vi metoden för in vitro-montering av de RSV RNA-specifika NCs. Slutligen använder vi storleksuteslutning kromatografi (SEC) och negativ fläck elektronmikroskopi (EM) för att karakterisera och visualisera de monterade NCLPs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1293px;" width="1293">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Agarose</td>
			<td style="width:302px;">SIgma</td>
			<td style="width:301px;">A9539-500G</td>
			<td style="width:319px;">making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>concentrate the protein sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Ampicillin sodium</td>
			<td style="width:302px;">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td style="width:301px;">5118.111317A</td>
			<td>antibiotic for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">AseI</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">R0526S</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cobalt (High Density) Agarose Beads</td>
			<td style="width:302px;">Gold Bio</td>
			<td>H-310-500</td>
			<td>For purification of His-tag protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Corning LSE Digital Dry Bath Heater</td>
			<td style="width:302px;">CORNING</td>
			<td style="width:301px;">6885-DB</td>
			<td>Heate the sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">dCTP</td>
			<td style="width:302px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:301px;">10217016</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">dGTP</td>
			<td style="width:302px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:301px;">10218014</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Glycerol</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">G5516-4L</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HEPES</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">H3375-100G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HiTrap Q HP</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">GE29-0513-25</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Imidazole</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">I5513-100G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)</td>
			<td style="width:302px;">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td style="width:301px;">1116.071717A</td>
			<td>induce the expression of protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:302px;">VWR</td>
			<td style="width:301px;">47730-598</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor</td>
			<td style="width:302px;">SpectraLab</td>
			<td style="width:301px;">MSX-XL-2020</td>
			<td>sonicator for lysing cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Negative stain grids</td>
			<td style="width:302px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:301px;">CF400-Cu-TH</td>
			<td>For making negative stain grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">New Brunswick Innova 44/44R</td>
			<td style="width:302px;">eppendorf</td>
			<td style="width:301px;">M1282-0000</td>
			<td>Shaker for culturing the cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Nonidet P 40 Substitute</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">74385-1L</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">OneTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">M0480L</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:302px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:301px;">28706</td>
			<td>Purify DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">SSPI-HF</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">R3132S</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td>GE29-0915-96</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">T4 DNA polymerase</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td>70099-3</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td style="width:302px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:301px;">36-101-0816</td>
			<td>Centrifuge, highest speed 20,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Trizma hydrochloride</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">T3253-250G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Uranyl Formate</td>
			<td style="width:302px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:301px;">22451</td>
			<td>making negative stain solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and assembly of virus-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus

Användningen av en autentisk RNA-mall är avgörande för att främja den grundläggande kunskapen om viral RNA-syntes som kan vägleda både mekanistisk upptäckt och analysutveckling inom virologi. RNA-mallen för icke-segmenterade NNS-RNA-virus (negative-sense), såsom respiratoriskt syncytial virus (RSV), är inte en RNA-molekyl ensam utan snarare ett nukleoprotein (N) inkapslat ribonukleoproteinkomplex. Trots vikten av den autentiska RNA mallen, generation och montering av en sådan ribonucleoprotein komplex förblir sofistikerad och kräver djupgående klargörande. Den största utmaningen är att den överuttryckta RSV N binder icke-specifikt till cellulära RNAs för att bilda slumpmässiga nukleocapsidliknande partiklar (NCLPs). Här etablerade vi ett protokoll för att erhålla RNA-fria N (N0) först genom att samreage uttrycka N med ett förkläde fosfoprotein (P), sedan montera N0 med RNA oligos med den RSV-specifika RNA-sekvensen för att erhålla virusspecifika nukleocapsids (NCs). Detta protokoll visar hur man kan övervinna svårigheten vid beredningen av detta traditionellt utmanande virala ribonukleoproteinkomplex.

Rening av RNA-fritt N0P-protein Med detta protokoll kan ett storskaligt lösligt heterodimeriskt RSV N0P-komplex erhållas. Hela längden på N och N terminal del av P proteiner uttrycktes tillsammans med 10X His-Tag på N proteinet i E. coli. N0P renades med hjälp av en kobolt kolumn, jon utbyte och storlek uteslutning kromatografi. N0P innehåller både N- och N-plint i full längd men innehöll inte cellulärt RNA baserat på UV-absorbansen A<su...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus at JoVE.com

Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

För djupgående mekanistisk analys av respiratoriska syncytial virus (RSV) RNA syntes, rapporterar vi ett protokoll om att använda förkläde fosfoprotein (P) för coexpression av RNA-fria nukleoprotein (N0)för efterföljande in vitro montering av virus-specifika nucleocapsids (NCs).

Generering och montering av virusspecifika nukleokapslar av respiratoriskt synytialvirus

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

Denna metod använder det olika sättet att ta itu med de rekombinanta virusproteinuttrycksutmaningarna med ett viralt protein P'as a förkläde för ett annat viralt protein N'to obtain RNA-fria N-proteiner. Det RNA-fria RSV N-proteinet erhålls innan det virusspecifika RNA monteras i nukleocapsid in vitro. Metoden kan också användas med andra icke-segmenterade RNA-virus med negativ känsla.Ligationsoberoende kloningsmetod är en snabb teknik för att förvärva co-expression-konstruktioner. Varför eller valbara färg elektronmikroskop är en snabb metod för att kontrollera stora monteringar i rå cell. Vi vill ge dig två tips.Få först hög avkastning och solida resultat för varje steg innan du går vidare till nästa steg. För det andra, ställ in lämpliga program för kromatografi och öva på att plocka upp rutnät med tång. För bi-cistronic konstruktion av N och P co-uttryck, växa fyra en liter kulturer av E coli BL21DE3 stamceller i LB medium vid 37 grader Celsius.När den optiska densiteten vid 600 nanometer når 0,6, sänk temperaturen till 16 grader Celsius. Efter en timme, inducera protein uttryck genom behandling med 0,5 millimolar IPTG över natten. Nästa morgon, samla cellerna genom centrifugation och återanvänd pelletsen i 200 milliliter lysbuffert.lysa cellerna genom ultraljudsbehandling i 15 minuter, med tre sekunder på, tre sekunders pulser. Och samla lysates genom centrifugation. Ladda supernatanten i en 2,5 av 10 centimeter koboltgravitationskolonn, med cirka 10 milliliter pärlor.Förjämfört med 5 till 10 kolumnvolymer lysbuffert. Och tvätta kolonnen med fem kolumnvolymer buffert B och fem volymer buffert C.Använd två volymer buffert D för att eluera proteinet från pärlorna. Och balansera Q-kolumnen med fem en milliliter volymer QA-buffert.Använd en peristaltisk pump för att ladda det utspädda provet på kolonnen. Smält den laddade Q-kolumnen på HPLC-maskinen tillsammans med färska QA- och QB-buffertar. Kör pumptvätten för att framgångsrikt tvätta maskinen med en till två volymer QB- och QA-buffertar.Efter den senaste tvätten ställer du in flödeshastigheten på en milliliter per minut och ställer in UV1 på 280 nanometer och UV2 till 260 nanometer, med en 96 djup brunnsplatta för att samla fraktionerna. Använd sedan en stegvis gradientapplikation av tre till fyra volymer av varje koncentration av elueringsmedel för att eluera proteinerna, från en 0%QB-koncentration och öka procentandelen med 5%varje gång. N-0 P proteinkomplexet kommer att eluera vid 15%QB buffertkoncentrationen.Isolera proteinet genom gelfiltrering, i en en av 30 centimeter småskalig rening kolumn, jämvikt med buffert E.Then analysera proteinet som innehåller fraktioner av SDS sida. För virusspecifik nukleocapsidmontering, blanda och inkubera det renade N-0 P-komplexet med RNA-oligo vid ett 1:1,5 molekylärt förhållande vid rumstemperatur i en timme. Förjämför en småskalig reningsgelfiltreringskolonn med buffert E.And remove any precipitation by centrifugation.Läs in supernaten till kolumnen för storleksuteslutning av kromatografi. Och jämför storleksuteslutningskromatografibilderna av proteinet med RNA-sammansättningen, och proteinet ensamt kontrollerar prover, kombinerar nukleinsyrans renhetsförhållanden, för att identifiera vilka toppar som är det monterade N RNA, N-0 P och gratis RNA. För att montera ett N RNA-komplex, samla alla N RNA toppfraktioner, utföra en RNA-extraktion och kör en urea sida gel för att dubbelkolla längden på det specifika RNA.För att förbereda ett negativt fläcknät för negativ fläckelektronmikroskopi, Använd en värmeplatta för att värma 5 ml dubbeldestillerat vatten till kokning och tillsätt 37,5 milligram uranylformat till vattnet för att få en 0,75% uranylformatfärgningslösning. Överför lösningen till en aluminiumfolie täckt bägare. Och tillsätt fyra mikroliter av 10 molar natriumhydroxid.Efter 15 minuters omrörning skyddad mot ljus filtrerar du lösningen genom ett 0,22 mikronfilter till ett provrör. För att göra de kontinuerliga kolbelagda elektronmikroskopinäten hydrofila, placera näten i en kammare ansluten till en strömförsörjning och applicera negativt laddade joner på näten. Klipp och vik en två gånger två tums parafilmsremsa.Tillsätt två 40 mikroliterdroppar destillerat vatten i ena änden av remsan. Och två 40 mikroliterdroppar på 0,75% uranylformat färglösning i andra änden. Tillsätt tre mikroliter proteinprov till varje rutnät.Efter en minut, blockera gallren mot blottingpapper och doppa gallren två gånger i de destillerade vattendroppar. Och en gång i den första färgningslösningen droppe. Sänk sedan ned gallret i den andra färgningslösningsdropparen i 30 sekunder innan du blottar gallret mot blottingpapper för att ta bort eventuell överflödig fläcklösning och låta gallret lufttorka före avbildning.Med hjälp av detta protokoll kan en storskalig löslig hetero dimeric respiratory syncytial virus N0 P komplex erhållas. I E coli samförs hela N- och N-terminaldelarna av P-proteinerna med en 10 X Hans tagg på N-proteinet. Baserat på UV-absorbanskärnans renhetsförhållande innehöll N0 P både full längd N och N-terminal P, men innehöll inte cellulärt RNA.Den renade N0 P kunde sedan stimuleras och monteras i nukleocapsid som partiklar på elektronmikroskopinät via inkubation med specifika RNA-oligos som visats. Vid rening av proteinet undvik luftbubblor under kolonnrening och späd provet med QA-buffert för att justera pH- och saltkoncentrationen innan provet lastas på kolonnen. Var noga med att hålla elektronmikroskopinäten i ytterkanten för att undvika att förorena gallret.Detta kommer att hjälpa oss att avgöra de icke-positiva RSV-genomförpackningsfrågorna, oavsett om det är vänsterhänt eller högerhänt spiralstruktur. Efter dessa procedurer och autentiska en RNA mall för RSV polymeras aktivitetsanalys kan utföras. Och denna RSV virusspecifika nukleocapsid kan användas för högupplöst cryo EM-analys.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Undersöka Proteasome Montering med rekombinant archaeal proteasomerna och Nondenaturing SIDA: Fallet för ett kombinerat tillvägagångssätt

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolering och respiratoriska mätningar av mitokondrier från Arabidopsis thaliana.

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Generation av infödda, otaggade Huntingtin Exon1 Monomer och fibriller med en SUMO Fusion strategi

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Manipulera levande celler att bygga stabila 3D cellulära montering utan konstgjorda byggnadsställning

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project

Hur man stabilisera Protein: stabilitet skärmar för termiska skifta analyser och Nano Differential Scanning Fluorimetry i projektet Virus-X

The Horizon2020 Virus-X project was established in 2015 to explore the virosphere of selected extreme biotopes and discover novel viral proteins. To ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Hybrid Clear/blå Native Electrophoresis för separation och analys av mitokondriella respiratoriska kedjan Superkomplex

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy

Interfacial molekylär nivå strukturer av polymerer och Biomacromolecules avslöjade via sum Frequency generation vibrational spektroskopi

As a second-order nonlinear optical spectroscopy, sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy has widely been used in investigating various ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-Time, semi-automatiserad fluorescerande mätning av luftvägarna yta flytande pH i primära humana luftvägs epitelceller

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Främja högupplöst avbildning av virusaggregat i vätska och is

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...