Name: generation and assembly of virus-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus
Uploaded: 2021-07-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus at JoVE.com

Emory'deki Liang laboratuvarındaki araştırma programları, ABD Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (NIGMS), Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından R01GM130950 ödül numarası altında ve Emory Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeki Araştırma Başlangıç Fonu tarafından desteklenmektedir. Yazar, Liang laboratuvarı üyelerini yararlı destek ve eleştirel tartışma için kabul eder.

1. Moleküler klonlama
NOT: Ligase Bağımsız Klonlama (LIC), RSV bi-cistronic coexpression yapı plazmid yapmak için kullanılmıştır. LIC, 1990'ların başında geliştirilen ve vektör ile DNA kesici ucu 21 , 22 arasında tamamlayıcılık ile çıkıntılar oluşturmak için T4 DNA polimerazının3'-5'Exo aktivitesini kullanan bir yöntemdir. Yapılar, Açık Okuma Çerçevesinin (ORF) N-terminalini 10x His etike...

<ol>
	<li>Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+and+replication+of+nonsegmented+negative-strand+RNA+viruses.">Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).</li><li>Lamb, R. A., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields virology. , (2013).</li><li>Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+syncytial+virus:+virology,+reverse+genetics,+and+pathogenesis+of+disease.">Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).</li><li>Fearns, R., Deval, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+antiviral+approaches+for+respiratory+syncytial+virus+and+other+mononegaviruses:+Inhibiting+the+RNA+polymerase.">New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase.</a> Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).</li><li>Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+replication+by+respiratory+syncytial+virus+(RSV)+is+directed+by+the+N,+P,+and+L+proteins;+transcription+also+occurs+under+these+conditions+but+requires+RSV+superinfection+for+efficient+synthesis+of+full-length+mRNA.">RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA.</a> Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).</li><li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+metapneumovirus+polymerase+phosphoprotein+complex.">Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex.</a> Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).</li><li>Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+rabies+virus+polymerase+complex+from+electron+cryo-microscopy.">Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).</li><li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+respiratory+syncytial+virus+RNA+polymerase.">Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase.</a> Nature Communications. 11 (1), 368 (2020).</li><li>Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+paramyxovirus+polymerase+complex+reveals+a+unique+methyltransferase-CTD+conformation.">Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).</li><li>Gilman, M. S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Respiratory+Syncytial+Virus+Polymerase+Complex.">Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex.</a> Cell. 179 (1), 193-204 (2019).</li><li>Liang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+L+Protein+of+Vesicular+Stomatitis+Virus+from+Electron+Cryomicroscopy.">Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy.</a> Cell. 162 (2), 314-327 (2015).</li><li>Jenni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Vesicular+Stomatitis+Virus+L+Protein+in+Complex+with+Its+Phosphoprotein+Cofactor.">Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor.</a> Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).</li><li>Renner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocapsid+assembly+in+pneumoviruses+is+regulated+by+conformational+switching+of+the+N+protein.">Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein.</a> Elife. 5, 12627 (2016).</li><li>Cox, R. M., Plemper, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+organization+of+paramyxovirus+particles.">Structure and organization of paramyxovirus particles.</a> Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).</li><li>Desfosses, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+vesicular+stomatitis+virus+nucleocapsid+into+a+bullet+shape.">Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape.</a> Nature Communications. 4, 1429 (2013).</li><li>Green, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+mechanism+for+RNA+encapsidation+by+negative-strand+RNA+viruses.">Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses.</a> Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).</li><li>Jamin, M., Yabukarski, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsegmented+Negative-Sense+RNA+Viruses-Structural+Data+Bring+New+Insights+Into+Nucleocapsid+Assembly.">Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly.</a> Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).</li><li>Wan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+assembly+of+the+Ebola+virus+nucleocapsid.">Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid.</a> Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).</li><li>Mendes, A., Kuhn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alphavirus+Nucleocapsid+Packaging+and+Assembly.">Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly.</a> Viruses. 10 (3), (2018).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+trackable+assembly+of+RNA-specific+nucleocapsids+of+the+respiratory+syncytial+virus.">In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).</li><li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+(LIC-PCR).">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).</li><li>Li, C., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation+independent+cloning+irrespective+of+restriction+site+compatibility.">Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility.</a> Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).</li><li>Green, R., Rogers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+chemically+competent+E.+coli.">Transformation of chemically competent E. coli.</a> Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).</li><li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM.">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li><li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Staining+and+Image+Classification+-+Powerful+Tools+in+Modern+Electron+Microscopy.">Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy.</a> Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).</li><li>Aebi, U., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glow+discharge+unit+to+render+electron+microscope+grids+and+other+surfaces+hydrophilic.">A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic.</a> Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).</li><li>Green, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Access+to+RNA+encapsidated+in+the+nucleocapsid+of+vesicular+stomatitis+virus.">Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus.</a> Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).</li><li>Alvarez Paggi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conformational+switch+balances+viral+RNA+accessibility+and+protection+in+a+nucleocapsid+ring+model.">A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).</li><li>Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+vesicular+stomatitis+virus+nucleoprotein-RNA+complex.">Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex.</a> Science. 313 (5785), 357-360 (2006).</li><li>Tawar, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+nucleocapsid-like+nucleoprotein-RNA+complex+of+respiratory+syncytial+virus.">Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus.</a> Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).</li><li>Galloux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+viral+phosphoprotein+binding+site+on+the+surface+of+the+respiratory+syncytial+nucleoprotein.">Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein.</a> Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).</li><li>Milles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembly+of+Measles+Virus+Nucleocapsid-like+Particles:+Kinetics+and+RNA+Sequence+Dependence.">Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence.</a> Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).</li><li>Desfosses, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+cryo-EM+structures+of+RNA-specific+measles+virus+nucleocapsids+provide+mechanistic+insight+into+paramyxoviral+replication.">Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).</li></ol>

Nonsegmented negatif duyu (NNS) RNA virüslerinin bilinen nükleocapsid benzeri parçacık (NCLP) yapıları, birleştirilmiş NCLP'lerin bakteriyel veya ökaryotik ifade sistemlerinde aşırı ifade edildiğinde konak hücresel RNA'lara sahip karmaşık N olduğunu göstermektedir15,16,17,18,19. Önceki çalışmalar, RNase A sindirimi, yüksek tuz yıkama ve...

Nonsegmented negatif duyu (NNS) RNA virüsleri kuduz, Ebola ve solunum senksiyal virüs (RSV)1,2gibi birçok önemli insan patojenini içerir. RSV, dünya çapında küçük çocuklarda ve yaşlı yetişkinlerde bronşiolit ve zatürre gibi solunum yolu hastalıklarının önde gelen nedenidir3. Şu anda, RSV4'üönlemek veya tedavi etmek için etkili bir aşı veya antiviral tedavi bulunmamaktadır. Yaşam döngüsünün bir parçası olarak, RSV genomu, RSV RNA bağımlı RNA polimerazının bir antigenom üretmek için çoğaltma şablonu olarak hizmet eder ve bu da bir soy genomu oluşturmak için şablon görevi görür. Hem genom hem de antigenom RNA'ları, nükleocapsidleri (NC' ler) oluşturmak için tamamen nükleoprotein (N) tarafından kapsüllenir3. NC'ler RSV polimeraz tarafından hem çoğaltma hem de transkripsiyon için şablonlar olarak hizmet verdiğinden, polimerazın RNA sentezi 5 şablonlarına erişmesi için uygunNCmontajı çok önemlidir. İlginçtir ki, NNS viral polimerazlarının yapısal analizlerine dayanarak, birkaç N proteininin, RNA sentezi 6 ,7,8,9,10,11,12'densonra polimerazın erişimine izin vermek için NC'lerden geçici olarak ayrıştıği varsayılıyor.
Şu anda, RSV RNA polimerizasyon tahlilleri, kısa çıplak RNA şablonları13 , 14üzerinde saflaştırılmış RSV polimeraz kullanılarak kurulmuştur. Bununla birlikte, RSV polimerazının faaliyetleri, çıplak RNA şablonları kullanılırken RSV polimeraz tarafından üretilen işlemsel olmayan ve iptal edici ürünlerde gözlendiği gibi optimale ulaşmaz. Virüse özgü RNA ile NC eksikliği, RSV RNA sentezinin daha fazla mekanistik anlaşılması için birincil engeldir. Bu nedenle, özgün bir RNA şablonu kullanmak, RSV RNA sentezinin temel bilgisini ilerletmek için kritik bir ihtiyaç haline gelir. RSV ve diğer NNS RNA virüslerinden gelen nükleapsid benzeri parçacıkların (NCLP' ler) bilinen yapıları, NCLP'lerdeki RNA'ların rastgele hücresel RNA'lar veya ortalama viral genomikRNA'lar 15 , 16,17,18,19olduğunu ortaya koymaktadır. Birlikte, ana engel, N ana hücrelerde aşırı ifade edildiğinde N'nin NCLP'leri oluşturmak için özellikle hücresel RNA'lara bağlanmamasıdır.
Bu engeli aşmak için, önce RNA içermeyen (N0)elde etmek ve N0'ı otantik viral genomik RNA ile NCLPs20'ye monte etmek için bir protokol oluşturduk. Bu protokolün prensibi, RSV fosfoprotein (PNTD)N-terminal etki alanı olan N'yi bir refakatçi ile birlikte ifade ederek büyük miktarda rekombinant RNA içermeyen N (N0)elde etmektir. Saflaştırılmış N0P, RSV'ye özgü RNA oligos eklenerek UYARılabilir ve NCLP'lere monte edilebilir ve montaj işlemi sırasında, RNA oligos ilavesi üzerine refakatçi PNTD yer değiştirir.
Burada, RSV RNA'ya özgü NC'lerin üretimi ve montajı için bir protokol detaylandırıyoruz. Bu protokolde moleküler klonlama, protein hazırlama, in vitro montaj ve karmaşık montajın doğrulanmasını tarif ediyoruz. Moleküler klonlama için protein koexpressyonu için bi-cistronic yapılar oluşturmak için klonlama stratejisini vurguluyoruz. Protein hazırlama için hücre kültürü, protein ekstraksiyonu ve protein kompleksinin saflaştırılması prosedürlerini açıklıyoruz. Daha sonra RSV RNA'ya özgü NC'lerin in vitro montajı yöntemini tartışıyoruz. Son olarak, monte edilen NCLP'leri karakterize etmek ve görselleştirmek için boyut dışlama kromatografisi (SEC) ve negatif leke elektron mikroskopisi (EM) kullanıyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1293px;" width="1293">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Agarose</td>
			<td style="width:302px;">SIgma</td>
			<td style="width:301px;">A9539-500G</td>
			<td style="width:319px;">making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>concentrate the protein sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Ampicillin sodium</td>
			<td style="width:302px;">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td style="width:301px;">5118.111317A</td>
			<td>antibiotic for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">AseI</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">R0526S</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cobalt (High Density) Agarose Beads</td>
			<td style="width:302px;">Gold Bio</td>
			<td>H-310-500</td>
			<td>For purification of His-tag protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Corning LSE Digital Dry Bath Heater</td>
			<td style="width:302px;">CORNING</td>
			<td style="width:301px;">6885-DB</td>
			<td>Heate the sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">dCTP</td>
			<td style="width:302px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:301px;">10217016</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">dGTP</td>
			<td style="width:302px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:301px;">10218014</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Glycerol</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">G5516-4L</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HEPES</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">H3375-100G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HiTrap Q HP</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">GE29-0513-25</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Imidazole</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">I5513-100G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)</td>
			<td style="width:302px;">GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td style="width:301px;">1116.071717A</td>
			<td>induce the expression of protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:302px;">VWR</td>
			<td style="width:301px;">47730-598</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor</td>
			<td style="width:302px;">SpectraLab</td>
			<td style="width:301px;">MSX-XL-2020</td>
			<td>sonicator for lysing cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Negative stain grids</td>
			<td style="width:302px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:301px;">CF400-Cu-TH</td>
			<td>For making negative stain grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">New Brunswick Innova 44/44R</td>
			<td style="width:302px;">eppendorf</td>
			<td style="width:301px;">M1282-0000</td>
			<td>Shaker for culturing the cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Nonidet P 40 Substitute</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">74385-1L</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">OneTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">M0480L</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:302px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:301px;">28706</td>
			<td>Purify DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">SSPI-HF</td>
			<td style="width:302px;">NEB</td>
			<td style="width:301px;">R3132S</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td>GE29-0915-96</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">T4 DNA polymerase</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td>70099-3</td>
			<td>making construct using LIC method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td style="width:302px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:301px;">36-101-0816</td>
			<td>Centrifuge, highest speed 20,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Trizma hydrochloride</td>
			<td style="width:302px;">Sigma</td>
			<td style="width:301px;">T3253-250G</td>
			<td>making solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Uranyl Formate</td>
			<td style="width:302px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:301px;">22451</td>
			<td>making negative stain solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and assembly of virus-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus

Özgün bir RNA şablonunun kullanımı, virolojide hem mekanistik keşif hem de tahlil gelişimine rehberlik edebilecek viral RNA sentezinin temel bilgisini ilerletmek için kritik öneme sahiptir. Solunum sinsitial virüsü (RSV) gibi nonsegmented negatif duyu (NNS) RNA virüslerinin RNA şablonu, tek başına bir RNA molekülü değil, nükleoprotein (N) kapsüllenmiş ribonikötoprotein kompleksidir. Otantik RNA şablonunun önemine rağmen, böyle bir ribonükleoprotein kompleksinin üretimi ve montajı sofistike kalır ve derinlemesine aydınlatma gerektirir. Asıl zorluk, aşırı ifade edilen RSV N'nin rastgele nükleocapsid benzeri parçacıklar (NCLP'ler) oluşturmak için özellikle hücresel RNA'lara bağlanmamasıdır. Burada, önce N'yi bir refakatçi fosfoprotein (P) ile birlikte ifade ederek RNA içermeyen N (N0)elde etmek için bir protokol oluşturduk, daha sonra virüse özgü nükleokapsidler (NC' ler) elde etmek için RSV'ye özgü RNA dizisi ile RNA oligos ile N0'ı birleştirdik. Bu protokol, geleneksel olarak zorlu olan bu viral riboniklioprotein kompleksinin hazırlanmasındaki zorluğun nasıl üstesinden gelindiğini göstermektedir.

RNA içermeyen N0P proteininin saflaştırılması Bu protokol ile büyük ölçekli çözünür heterodimerik RSV N0P kompleksi elde edilebilir. P proteinlerinin N ve N terminal kısmının tam uzunluğu, E. coli'dekiN proteini üzerinde 10X His-Tag ile birlikte ifade edildi. N0P kobalt kolonu, iyon değişimi ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak saflaştırılmıştır. N0P hem tam uzunlukta N hem de N terminali P içerir, ancak UV emic...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus at JoVE.com

Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

Solunum sinsitial virüsünün (RSV) RNA sentezinin derinlemesine mekanistik analizi için, virüse özgü nükleokapsidlerin (NC) sonraki in vitro montajı için RNA içermeyen nükleoproteinin (N0)birlikte ifade edilmesi için refakatçi fosfoprotein (P) kullanma protokolünü rapor ediyoruz.

Solunum Sinsitial Virüsünün Virüse Özgü Nükleopapsidlerinin Üretimi ve Montajı

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

Bu yöntem, RNA içermeyen N proteinleri elde etmek için başka bir viral protein N'için refakatçi olarak bir viral protein P'kullanarak rekombinant viral protein ifade zorluklarıyla başa çıkmanın çeşitli yolunu kullanır. RNA içermeyen RSV N proteini, virüse özgü RNA'yı nükleapsid in vitro içine monte etmeden önce elde edilir. Yöntem diğer segmentsiz negatif duyu RNA virüsleri ile de kullanılabilir.Ligasyon bağımsız klonlama yöntemi, birlikte ifade yapıları elde etmek için hızlı bir tekniktir. Neden veya seçmeli leke elektron mikroskobu ham hücrede büyük montajı kontrol etmek için hızlı bir yöntemdir. Size iki ipucu vermek istiyoruz.İlk olarak, bir sonraki adıma geçmeden önce her adım için yüksek verim ve sağlam sonuçlar alın. İkincisi, kromatografi için uygun programlar kurun ve forsepsli ızgaraları toplama alıştırması yapın. N ve P ortak ekspresyonunun çift cistronic yapısı için, LB ortamında 37 santigrat derecede dört bir litrelik E coli BL21DE3 gerinim hücresi kültürü yetiştirin.600 nanometredeki optik yoğunluk 0,6'ya ulaştığında, sıcaklığı 16 santigrat dereceye düşürin. Bir saat sonra, bir gecede 0,5 milimolar IPTG ile tedavi ile protein ekspresyonunda indüklenir. Ertesi sabah, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peletleri 200 mililitre lizis tamponunda yeniden biriktirin.Hücreleri sonication ile 15 dakika boyunca 3 saniye açık, 3 saniye nabız yoklayalım. Ve santrifüjleme ile lysates toplamak. Süpernatantı yaklaşık 10 mililitre boncuklu 2,5 ila 10 santimetre kobalt yerçekimi sütununa yükleyin.5 ila 10 sütun hacmi lizis arabelleği ile önceden dengelenmiştir. Ve sütunu beş sütun B tamponu ve beş birim tampon C ile yıkayın.Proteini boncuklardan çıkarmak için iki birim tampon D kullanın. Ve Q sütununu beş bir mililitre hacimli QA tamponu ile dengele.Seyreltilmiş numuneyi sütuna yüklemek için peristaltik bir pompa kullanın. Yüklenen Q sütununu taze QA ve QB tamponlarıyla birlikte HPLC makinesine eritin. Makineyi bir ila iki hacimli QB ve QA tamponlarıyla başarılı bir şekilde yıkamak için pompa yıkamayı çalıştırın.Son yıkamadan sonra, akış hızını dakikada bir mililitreye ayarlayın ve fraksiyonları toplamak için 96 derin kuyu plakası kullanarak UV1'i 280 nanometreye ve UV2'yi 260 nanometreye ayarlayın. Daha sonra proteinleri elute etmek için her bir elüasyon maddesi konsantrasyonunun üç ila dört cildinden oluşan adım adım bir gradyan uygulaması kullanın, % 0 QB konsantrasyondan başlayarak ve yüzdeyi her seferinde% 5 artırın. N-0 P protein kompleksi %15 QB tampon konsantrasyonunda elüte olacaktır.Proteini jel filtrasyonu ile izole edin, bire 30 santimetre küçük ölçekli arıtma kolonunda, E tamponu ile dengelenmiş.Daha sonra kesirleri içeren proteini SDS sayfası ile analiz edin. Virüse özgü nükleopapsit montajı için, saflaştırılmış N-0 P kompleksini bir saat boyunca oda sıcaklığında 1:1,5 moleküler oranda RNA oligo ile karıştırın ve kuluçkaya yatırın. Küçük ölçekli bir arıtma jeli filtrasyon kolonunu E. tamponu ile önceden dengele ve santrifüjleme ile herhangi bir yağışı ortadan kaldırın.Üstnatant,boyut dışlama kromatografi sütununa yükleyin. Ve proteinin boyut dışlama kromatografi görüntülerini RNA montajı ile karşılaştırın ve hangi tepelerin birleştirilmiş N RNA, N-0 P ve serbest RNA olduğunu belirlemek için nükleik asit saflık oranlarını birleştiren protein tek başına kontrol örneklerini kontrol edin. Bir N RNA kompleksini birleştirmek için, tüm N RNA tepe kesirlerini toplayın, bir RNA ayıklama gerçekleştirin ve belirli RNA'nın uzunluğunu iki kez kontrol etmek için bir üre sayfası jeli çalıştırın.Negatif leke elektron mikroskopisi için negatif bir leke ızgarası hazırlamak için, kaynatmak için 5 mL çift damıtılmış suyu ısıtmak için bir ısı plakası kullanın ve% 0.75 uranil formatlı boyama çözeltisi elde etmek için suya 37.5 miligram uranil formatında ekleyin. Çözeltiyi alüminyum folyo kaplı bir behere aktarın. Ve 10 molar sodyum hidroksit dört mikrolitre ekleyin.Işıktan korunan 15 dakikalık karıştırmadan sonra, çözeltiyi 0,22 mikron filtreden bir test tüpüne filtreleyin. Sürekli karbon kaplı elektron mikroskopi ızgaralarını hidrofilik hale getirmek için, ızgaraları bir güç kaynağına bağlı bir odaya yerleştirin ve ızgaralara negatif yüklü iyonlar uygulayın. İkiye iki parafilm şeridini kesin ve katlayın.Şeridin bir ucuna iki adet 40 mikroliter damıtılmış su damlası ekleyin. Ve diğer uca %0.75 uranil formatlı boyama çözeltisi iki adet 40 mikroliter damlası. Her ızgaraya üç mikrolitre protein örneği ekleyin.Bir dakika sonra, ızgaraları şişirme kağıdına karşı engelleyin ve ızgaraları damıtılmış su damlacıklarına iki kez batırın. Ve ilk boyama çözeltisi damlacıkta bir kez. Daha sonra ızgaraları, fazla leke çözeltisini çıkarmak için ızgaraları şişkin kağıda karşı şişirmeden ve görüntülemeden önce ızgaraların havayla kurumasını izin vermeden önce, ızgarayı 30 saniye boyunca ikinci boyama çözeltisi damlacığına batırın.Bu protokol kullanılarak, büyük ölçekli çözünür bir hetero dimerik solunum yolu senksiyal virüs N0 P kompleksi elde edilebilir. E coli'de, P proteinlerinin N ve N-terminal bölümlerinin tam uzunluğu, N proteini üzerindeki 10 X His etiketi ile birlikte ifade edilir. UV absorbansı nükleik asit saflık oranına dayanarak, N0 P hem tam uzunlukta N hem de N-terminal P içeriyordu, ancak hücresel RNA içermİyordu.Saflaştırılmış N0 P daha sonra uyarılabilir ve gösterildiği gibi belirli RNA oligos ile inkübasyon yoluyla elektron mikroskopi ızgaralarındaki parçacıklar gibi nükleapsid içine monte edilebilir. Proteini arındırırken, kolon saflaştırması sırasında hava kabarcıklarından kaçının ve numuneyi sütuna yüklemeden önce pH ve tuz konsantrasyonunu ayarlamak için QA tamponu ile seyreltin. Izgaraların kirlenmesini önlemek için elektron mikroskopi ızgaralarını dış kenarda tutmaya özen göster.Bu, ister solak ister sağ el sarmal yapı olsun, pozitif olmayan RSV genom paketleme sorularını belirlememize yardımcı olacaktır. Bu prosedürlerin ardından ve RSV polimeraz aktivitesi için bir RNA şablonu gerçekleştirilmesi gerçekleştirilebilir. Ve bu RSV viral spesifik nükleocapsid yüksek çözünürlüklü kriyo EM analizi için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Rekombinant Archaeal proteazomlar ve Nondenaturing PAGE ile Proteozom Meclisi İncelenmesi: Durum bir Kombine Yaklaşım

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Yalıtım ve solunum ölçümleri mitokondri Arabidopsis thaliana üzerinden

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Yerli, etiketsiz Huntingtin Exon1 Monomer ve SUMO Fusion strateji kullanarak liflerinde nesil

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Canlı hücreler yapay iskele olmayan istikrarlı 3D hücresel derleme oluşturmak için değiştirme

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project

Protein dengelemek nasıl: istikrar ekranlar için termal kayması deneyleri ve Nano diferansiyel Fluorimetry virüs-X projede tarama

The Horizon2020 Virus-X project was established in 2015 to explore the virosphere of selected extreme biotopes and discover novel viral proteins. To ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Mitokondriyal solunum zinciri Süperkompleksleri ayrımı ve analizi için hibrid Clear/mavi yerli Elektroforez

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy

Toplam Frekans Üretimi TitreşimSpektroskopisi Ile Ortaya Çıkan Polimerlerin ve Biyomakromoleküllerin İnterasfer Moleküler Düzey Yapıları

As a second-order nonlinear optical spectroscopy, sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy has widely been used in investigating various ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Primer ınsan hava yolu epitel hücrelerinin hava yolu yüzeyi sıvı pH 'Sı gerçek zamanlı, yarı otomatik floresan ölçümü

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Sıvı ve Buzdaki Virüs Düzeneklerinin Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesinin İlerlemesi

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...