Name: laser doppler perfusion imaging in the mouse hindlimb
Uploaded: 2021-04-18T13:00:00
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Este trabajo se llevó a cabo con el uso de instalaciones y recursos en el Centro de Atención Médica Va Puget Sound. La obra es la del autor y no necesariamente refleja la posición o política del Departamento de Asuntos de Veteranos o del gobierno de los Estados Unidos. El Dr. Tang se financia actualmente a través del VA (Merit 5 I01 BX004975-02).

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Washington.
1. Preparación del escáner
<ol><li>Ajuste la altura del escáner para que la distancia al sujeto escaneado sea de aproximadamente 30 cm.</li>
	<li>Encienda el imager e inicie el software asociado.</li>
	<li>Abra el programa de medición. Si el software se comunica correctamente con el escáner, aparecer...

<ol>
	<li>Varma, P., Stineman, M. G., Dillingham, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+limb+loss.">Epidemiology of limb loss.</a> Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 25 (1), 1-8 (2014).</li><li>Farber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Limb-Threatening+Ischemia.">Chronic Limb-Threatening Ischemia.</a> New England Journal of Medicine. 379 (2), 171-180 (2018).</li><li>Abularrage, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+microcirculation+in+vascular+disease.">Evaluation of the microcirculation in vascular disease.</a> Journal of Vascular Surgery. 42 (3), 574-581 (2005).</li><li>Houben, A., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+Microvascular+Function+in+Humans+from+a+Chronic+Disease+Perspective.">Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).</li><li>Mahe, G., Humeau-Heurtier, A., Durand, S., Leftheriotis, G., Abraham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+skin+microvascular+function+and+dysfunction+with+laser+speckle+contrast+imaging.">Assessment of skin microvascular function and dysfunction with laser speckle contrast imaging.</a> Circulation: Cardiovascular Imaging. 5 (1), 155-163 (2012).</li><li>Murray, A. K., Herrick, A. L., King, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Doppler+imaging:+a+developing+technique+for+application+in+the+rheumatic+diseases.">Laser Doppler imaging: a developing technique for application in the rheumatic diseases.</a> Rheumatology (Oxford). 43 (10), 1210-1218 (2004).</li><li>Greco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeatability,+reproducibility+and+standardisation+of+a+laser+Doppler+imaging+technique+for+the+evaluation+of+normal+mouse+hindlimb+perfusion.">Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser Doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion.</a> Sensors (Basel). 13 (1), 500-515 (2012).</li><li>Sonmez, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+laser-Doppler+flowmetry+assisted+murine+model+of+acute+hindlimb+ischemia-reperfusion+for+free+flap+research.">A novel laser-Doppler flowmetry assisted murine model of acute hindlimb ischemia-reperfusion for free flap research.</a> PLoS One. 8 (6), 66498 (2013).</li><li>Gargiulo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+some+anesthetic+agents+on+skin+microcirculation+evaluated+by+laser+Doppler+perfusion+imaging+in+mice.">Effects of some anesthetic agents on skin microcirculation evaluated by laser Doppler perfusion imaging in mice.</a> BMC Veterinary Research. 9, 255 (2013).</li><li>Ankri-Eliahoo, G., Weitz, K., Cox, T. C., Tang, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p27(kip1)+Knockout+enhances+collateralization+in+response+to+hindlimb+ischemia.">p27(kip1) Knockout enhances collateralization in response to hindlimb ischemia.</a> Journal of Vascular Surgery. 63 (5), 1351-1359 (2016).</li><li>McEnaney, R. M., Shukla, A., Madigan, M. C., Sachdev, U., Tzeng, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2Y2+nucleotide+receptor+mediates+arteriogenesis+in+a+murine+model+of+hind+limb+ischemia.">P2Y2 nucleotide receptor mediates arteriogenesis in a murine model of hind limb ischemia.</a> Journal of Vascular Surgery. 63 (1), 216-225 (2016).</li><li>Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Acute+and+Subacute+Murine+Hindlimb+Ischemia.">Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e54166 (2016).</li><li>Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+hindlimb+ischemia.">Murine model of hindlimb ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments. (23), e1035 (2009).</li><li>Chalothorn, D., Faber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-dependent+variation+in+collateral+circulatory+function+in+mouse+hindlimb.">Strain-dependent variation in collateral circulatory function in mouse hindlimb.</a> Physiological Genomics. 42 (3), 469-479 (2010).</li><li>Helisch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+mouse+strain+differences+in+innate+hindlimb+collateral+vasculature.">Impact of mouse strain differences in innate hindlimb collateral vasculature.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (3), 520-526 (2006).</li><li>Faber, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+causes+collateral+rarefaction+and+increased+severity+of+ischemic+injury+in+multiple+tissues.">Aging causes collateral rarefaction and increased severity of ischemic injury in multiple tissues.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (8), 1748-1756 (2011).</li><li>Forrester, K. R., Stewart, C., Tulip, J., Leonard, C., Bray, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+laser+speckle+and+laser+Doppler+perfusion+imaging:+measurement+in+human+skin+and+rabbit+articular+tissue.">Comparison of laser speckle and laser Doppler perfusion imaging: measurement in human skin and rabbit articular tissue.</a> Medical &amp; Biological Engineering &amp; Computing. 40 (6), 687-697 (2002).</li><li>Briers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Doppler,+speckle+and+related+techniques+for+blood+perfusion+mapping+and+imaging.">Laser Doppler, speckle and related techniques for blood perfusion mapping and imaging.</a> Physiological Measurement. 22 (4), 35-66 (2001).</li><li>Heeman, W., Steenbergen, W., van Dam, G., Boerma, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+laser+speckle+contrast+imaging:+a+review.">Clinical applications of laser speckle contrast imaging: a review.</a> Journal of Biomedical Optics. 24 (8), 1-11 (2019).</li><li>Nguyen, T., Davidson, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrast+Enhanced+Ultrasound+Perfusion+Imaging+in+Skeletal+Muscle.">Contrast Enhanced Ultrasound Perfusion Imaging in Skeletal Muscle.</a> Journal of Cardiovascular Imaging. 27 (3), 163-177 (2019).</li><li>Zaccagnini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+Resonance+Imaging+Allows+the+Evaluation+of+Tissue+Damage+and+Regeneration+in+a+Mouse+Model+of+Critical+Limb+Ischemia.">Magnetic Resonance Imaging Allows the Evaluation of Tissue Damage and Regeneration in a Mouse Model of Critical Limb Ischemia.</a> PLoS One. 10 (11), 0142111 (2015).</li><li>Penuelas, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET+as+a+measurement+of+hindlimb+perfusion+in+a+mouse+model+of+peripheral+artery+occlusive+disease.">PET as a measurement of hindlimb perfusion in a mouse model of peripheral artery occlusive disease.</a> Journal of Nuclear Medicine. 48 (13), 1216-1223 (2007).</li><li>Jia, Y., Qin, J., Zhi, Z., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh+sensitive+optical+microangiography+reveals+depth-resolved+microcirculation+and+its+longitudinal+response+to+prolonged+ischemic+event+within+skeletal+muscles+in+mice.">Ultrahigh sensitive optical microangiography reveals depth-resolved microcirculation and its longitudinal response to prolonged ischemic event within skeletal muscles in mice.</a> Journal of Biomedical Optics. 16 (8), 086004 (2011).</li><li>Turaihi, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Intravital+Microscopy+and+Contrast-enhanced+Ultrasonography+of+the+Mouse+Hindlimb+to+Study+Insulin-induced+Vasodilation+and+Muscle+Perfusion.">Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), e54912 (2017).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+autophagy+alleviates+injury+during+hindlimb+ischemia/reperfusion+in+mice.">Enhanced autophagy alleviates injury during hindlimb ischemia/reperfusion in mice.</a> Experimental and Therapeutic Medicine. 18 (3), 1669-1676 (2019).</li><li>Liu, D. L., Svanberg, K., Wang, I., Andersson-Engels, S., Svanberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Doppler+perfusion+imaging:+new+technique+for+determination+of+perfusion+and+reperfusion+of+splanchnic+organs+and+tumor+tissue.">Laser Doppler perfusion imaging: new technique for determination of perfusion and reperfusion of splanchnic organs and tumor tissue.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 20 (4), 473-479 (1997).</li><li>Jing, Y., Bai, F., Chen, H., Dong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Laser+Doppler+Imaging+and+Monitoring+to+Analyze+Spinal+Cord+Microcirculation+in+Rat.">Using Laser Doppler Imaging and Monitoring to Analyze Spinal Cord Microcirculation in Rat.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e56243 (2018).</li><li>Zhang, D., Li, S., Wang, S., Ma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+the+effect+of+a+gastric+ischemia-reperfusion+model+with+laser+Doppler+blood+perfusion+imaging.">An evaluation of the effect of a gastric ischemia-reperfusion model with laser Doppler blood perfusion imaging.</a> Lasers in Medical Science. 21 (4), 224-228 (2006).</li><li>Fitzal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulatory+changes+after+prolonged+ischemia+in+the+epigastric+flap.">Circulatory changes after prolonged ischemia in the epigastric flap.</a> Journal of Reconstructive Microsurgery. 17 (7), 535-543 (2001).</li></ol>

La técnica consistente es fundamental para obtener resultados fiables con LDPI. El mismo anestésico, la configuración de temperatura, la posición del ratón y la región de interés deben utilizarse durante todo el curso de tiempo. Diferentes agentes anestésicos darán como resultado valores de perfusión superiores o inferiores9. La anestesia isoflurano es conveniente debido a su rápida aparición y aparición, así como a la seguridad general. Un porcentaje constante de isoflurano debe uti...

Ulceración cutánea con cicatrización inadecuada de heridas es una de las principales causas de amputación en pacientes humanos1. La cicatrización adecuada de heridas requiere mayores niveles de perfusión arterial de los necesarios para mantener la piel intacta, que se ve comprometida en pacientes con enfermedad arterial periférica2,3,4. Varias otras afecciones reumatológicas y la diabetes también pueden conducir a microcirculación cutánea perturbada e inadecuada para curar heridas5,6. Muchos pacientes diabéticos tienen una enfermedad arterial periférica concomitante, lo que los coloca en un riesgo especialmente alto de amputación. Las imágenes de perfusión de Doppler láser (LDPI) se utilizan en situaciones clínicas para evaluar la microcirculación de la piel, así como en situaciones de investigación para evaluar el flujo sanguíneo y la recuperación del flujo sanguíneo después de la isquemia hindlimb experimental, isquemia-reperfusión y aletas microquirúrgicas7.
El sistema LDPI proyecta un rayo láser de baja potencia que es desviado por un espejo de escaneo para moverse sobre una región de interés. Esto difiere de la caudalmetría Laser Doppler, que proporciona una medición de perfusión para el área pequeña del tejido en contacto directo con la sonda de diagrama8. Cuando el rayo láser interactúa con la sangre en movimiento en la microvasculatura, se somete a un cambio de frecuencia Doppler, que es fotodetectado por el escáner y convertido en unidades de perfusión arbitrarias. Dado que el LDPI es una técnica basada en la luz, se limita en términos de profundidad de penetración a 0,3-1 mm, lo que significa que en su mayor parte la perfusión dérmica se evalúa7. El flujo dérmico puede ser alterado por la temperatura de la piel y el sistema nervioso simpático, que puede verse afectado por varios agentes anestésicos9. Las mediciones del láser óptico también se ven afectadas por las condiciones de iluminación ambiental, pigmentación de la piel, y pueden ser bloqueadas por el exceso de piel o el cabello7.
LDPI es la técnica de investigación más utilizada para monitorear la recuperación de perfusión después de la isquemia porque no es invasiva, no requiere administración de contrastes y tiene tiempos de escaneo rápidos que permiten la recolección de datos en varios animales. Esto hace que sea ideal para ayudar a determinar si los tratamientos dirigidos a la arteriogénesis terapéutica o la angiogénesis son eficaces en modelos animales pequeños. La recuperación del flujo sanguíneo después de la isquemia del hindlimb medida por el LDPI se correlaciona bien con el desarrollo de arterias colaterales cuando se evalúa por otros medios como la fundición microfil o micro-CT10,11. El objetivo de este protocolo es demostrar la evaluación de la perfusión de hindlimb utilizando LDPI.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Black nonreflective material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fabric store, black neoprene recommended by company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F/air cannister</td>
			<td>A.M. Bickford Inc</td>
			<td>80120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homeothermic blanket with rigid metal probe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
			<td>Also comes with flexible probe, but this is less durable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Anesthesia machine</td>
			<td>Drager</td>
			<td></td>
			<td>Multiple manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane induction chamber</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>941444</td>
			<td>2 L chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moor laser Doppler perfusion imager</td>
			<td>Moor Instruments</td>
			<td>MoorLDI2-IR</td>
			<td>Higher resolution imager (MoorLDI2-HIR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anesthesia nose cone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Multiple manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen tank</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Multiple manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgilube</td>
			<td>Multiple distributors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser doppler perfusion imaging in the mouse hindlimb

La recuperación del flujo sanguíneo es una medida de resultado crítico después de la isquemia hindlimb experimental o la reperfusión de isquemia. Las imágenes de perfusión doppler láser (LDPI) es un método común, no invasivo y repetible para evaluar la recuperación del flujo sanguíneo. La técnica calcula el flujo sanguíneo general en el tejido muestreado a partir del cambio de frecuencia de Doppler causado cuando un láser golpea los glóbulos rojos en movimiento. Las mediciones se expresan en unidades de perfusión arbitrarias, por lo que el contralateral no intervenido en la pierna se utiliza generalmente para ayudar a controlar las mediciones. La profundidad de medición está en el rango de 0,3-1 mm; para la isquemia hindlimb, esto significa que se evalúa la perfusión dérmica. La perfusión dérmica depende de varios factores, sobre todo la temperatura de la piel y el agente anestésico, que deben controlarse cuidadosamente para dar lugar a lecturas fiables. Además, la pigmentación del cabello y la piel puede alterar la capacidad del láser para alcanzar o penetrar en la dermis. Este artículo muestra la técnica de LDPI en el hindlimb del ratón.

El LDPI exitoso debe dar lugar a exploraciones constantes de medidas repetidas, con no más de 100-150 de variación de la unidad de perfusión (correspondiente a aproximadamente el 10% de la perfusión media habitual para el bloc de pies del ratón) entre las tres exploraciones(Figura 2). Como se muestra en la Figura 2,las exploraciones repetidas ayudan a determinar que el ratón se ha equilibrado adecuadamente para que la relación isquémica/de control reflej...

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Laser Doppler Perfusion Imaging in the Mouse Hindlimb

Aquí, presentamos un protocolo que demuestra la técnica y los controles necesarios para las imágenes de perfusión de Laser Doppler para medir el flujo sanguíneo en el retroigrama del ratón.

Imágenes de perfusión doppler láser en el hindlimb del ratón

Blood flow recovery is a critical outcome measure after experimental hindlimb ischemia or ischemia-reperfusion. Laser Doppler perfusion imaging (LDPI) is ...

La ulceración cutánea con cicatrización inadecuada de heridas es una de las principales causas de amputación en pacientes humanos. La cicatrización adecuada de heridas requiere mayores niveles de profusión arterial que se necesitan para mantener la piel intacta, que se ve comprometida en pacientes con enfermedad arterial periférica. Varias otras afecciones reumatológicas y la diabetes también pueden conducir a microcirculación cutánea perturbada e inadecuada para curar heridas.Muchos pacientes diabéticos tienen una enfermedad arterial periférica concomitante, lo que los coloca en un riesgo especialmente alto de amputación. Las imágenes de perfusión de Doppler láser o LDPI se utiliza en situaciones clínicas para evaluar la microcirculación de la piel, así como en situaciones de investigación para evaluar el flujo sanguíneo y la recuperación del flujo sanguíneo después de la isquemia hindlimb experimental, la reperfusión de isquemia y las aletas microquirúrgicas. El sistema LDPI proyecta un rayo láser de baja potencia que es desviado por un espejo de escaneo para moverse sobre una región de interés.Esto difiere de la caudalmetría Doppler láser, que proporciona una medición de perfusión para el área pequeña de tejido en contacto directo con la sonda de diagrama de flujo. Cuando el rayo láser interactúa con la sangre en movimiento en la microvasculatura se somete a un cambio de frecuencia Doppler que es fotodetectado por el escáner y convertido en unidades de perfusión arbitrarias. Debido a que el LDPI es una técnica basada en la luz, se limita en términos de profundidad de penetración a 0,3 a 1 milímetro, lo que significa que en su mayor parte se evalúa la perfusión dérmica.El flujo dérmico puede ser alterado por la temperatura de la piel y el sistema nervioso simpático, que puede verse afectado por varios agentes anestésicos. Las mediciones del láser óptico también se ven afectadas por las condiciones de iluminación ambiental, la pigmentación de la piel y pueden bloquearse mediante el exceso de piel o cabello. LDPI es la técnica de investigación más utilizada para monitorear la recuperación de profusión después de la isquemia porque no es invasiva, no requiere administración de contrastes y tiene tiempos de escaneo rápidos que permiten la recopilación de datos en varios animales.Esto hace que sea ideal para ayudar a determinar si los tratamientos dirigidos a la arteriogénesis terapéutica o la angiogénesis son eficaces en modelos animales pequeños. La recuperación del flujo sanguíneo después de la isquemia del hindlimb medida por el LDPI se correlaciona bien con el desarrollo de arterias colaterales cuando se evalúa por otros medios, como la fundición por microllenda o la micro TC. El objetivo de este protocolo es demostrar la evaluación de la perfusión de hindlimb utilizando LDPI. Ajuste la altura del escáner para que la distancia al sujeto de escaneo sea de aproximadamente 30 centímetros.Encienda el imager e inicie el software asociado. Abra el programa de medición. Si el software se comunica correctamente con el escáner, aparecerá la advertencia de encendido láser infrarrojo.Ajuste la configuración del escáner para que sea adecuada para el material de fondo y la configuración de iluminación de la habitación. Establezca el umbral de fondo apuntando el rayo láser al material de fondo negro y pulse Auto BK Set. Instalar la cámara de inducción isoflurano con la limpieza adecuada de gas residual.Colocar la cámara de inducción en una almohadilla de calentamiento ayudará a prevenir la pérdida de temperatura del ratón durante la inducción por anestesia. Encienda la manta homeotérmica, que se coloca en el área de escaneo debajo de una superficie no reflectante. En este caso, un tejido negro de neopreno.La manta homeotérmica mantendrá una temperatura corporal de 37 grados centígrados. Coloque la sonda de temperatura y los lubricantes para que estén listos para su inserción. Coloque la máscara facial de anestesia y el sistema de barrido en el área de escaneo también.Anestesia el ratón con un vaporizador isoflurano. La velocidad del oxígeno se establece en un litro por minuto de flujo. Y el isoflurano se ajusta al 4% para la inducción por anestesia.El flujo se enciende en la cámara de inducción de anestesia y la frecuencia respiratoria del ratón se ralentizará. La anestesia adecuada se logra cuando el ratón pierde su reflejo corrector. Transfiera el ratón a un cono nasal de máscara anestésica con carroñero de gas residual unido y ajuste el isoflurano al 1,5% Este nivel de anestesia es generalmente adecuado para mantener al ratón tendido relativamente quieto durante la exploración, pero no está destinado a proporcionar niveles quirúrgicos de anestesia.Así que la profundidad de la anestesia no se comprueba. Cambiar el nivel de isoflurano provoca cambios en la frecuencia cardíaca, la respiración y la profusión dérmica. Por lo tanto, se debe utilizar un porcentaje consistente a lo largo de cualquier experimento de curso de tiempo y para todos los sujetos experimentales.También se pueden utilizar técnicas anestésicas alternativas, como la inyección de IP de ketamina xylazina, pero la misma técnica anestésica debe utilizarse a lo largo de cualquier momento del estudio, ya que diferentes anestésicos afectan la profusión dérmica de manera diferente. Si la región de interés del plan a escanear está cubierta por pieles, utilice una pequeña recortadora eléctrica y/o crema depilatoria para eliminar el cabello de la región de interés. Las cremas depilatorias deben eliminarse por completo y la piel del ratón seca antes de escanear como piel húmeda puede causar reflejos del láser Inserte la sonda de temperatura rectal lubricada asociada con la manta homeotérmica en el recto del ratón.Equilibrar la temperatura del ratón para desear temperatura de escaneo, 37 grados Celsius. Esto puede tardar hasta cinco a 10 minutos. Seleccione Configuración del escáner a la que se puede acceder desde el menú superior o desde el icono Configuración del escáner.El área de escaneado debe ajustarse cambiando las coordenadas X y Y para adaptarse a la región de interés. La velocidad de escaneo dependerá de la resolución del escaneo. Una resolución más alta dará lugar a tiempos de escaneo más largos.Para la exploración repetida, centrándose en la profusión global, en lugar de una resolución más alta centrada en la perfusión anatómica, la velocidad de escaneo más alta de cuatro milisegundos por píxel es adecuada. Si realiza análisis repetidos, seleccione la pestaña Repetir y Analizar línea. El número de escaneos se puede cambiar.En este caso, tres escaneos, así como el intervalo de repetición. El tiempo mínimo para el intervalo de repetición serían los tiempos estimados de escaneo que se muestran en el área atenuada a la derecha de la caja, determinada por el área de escaneo y la resolución de escaneo. Agregar unos segundos permite al usuario pausar y potencialmente cambiar la posición del ratón si es necesario entre escaneos.El tiempo total de escaneo en este caso es de tres minutos y 21 segundos. Seleccione la pestaña Escaneo de imagen y seleccione el botón Marcar. Esto hará que el láser delinee el área de escaneo.Ajuste la posición del ratón para que el destino a escanear esté dentro del área marcada. Inicie la medición repetida seleccionando el icono Repetir escaneado y pulsando el botón Reproducir para iniciar el análisis. Aparecerá una ventana emergente que confirme la distancia de escaneo.Haga clic en Aceptar para iniciar la exploración. El escaneo inicial de un ratón antes de la inducción de isquemia hindlimb se muestra en tiempo real. El segundo y tercer escaneos repetidos se aceleran a una velocidad de 16x.La ventana principal muestra los resultados de la exploración, ya que es generada por el software. El inserto en la parte inferior derecha muestra el láser escaneando las almohadillas del ratón. Para el footpad o footpad y el escaneo dorsal de la pantorrilla, el posicionamiento propenso con las extremidades posteriores extendidas hacia la cola proporciona una región más consistente de interés en el posicionamiento supina.La arteria femoral, la arteria sapenosa y las garantías están muy cerca de la superficie ventral del muslo y la pantorrilla. Por lo tanto, se prefiere el posicionamiento supino si se utilizan estas regiones de interés. Supervise el ratón durante la exploración para detectar el movimiento del ratón.Si el ratón se mueve lo suficiente como para que los blocs de pies ya no estén en la región de escaneado en medio de un análisis, reinicie el análisis. Pequeñas variaciones en la posición del bloc de pies del ratón se pueden acomodar en el software de análisis. Además, monitoree la temperatura del ratón durante el proceso de escaneo, ya que puede fluctuar incluso con el uso de la manta homeotérmica.Si hay demasiada variación en la temperatura del ratón, esto puede resultar en variaciones significativas entre los escaneos. En general, un rango de temperatura de 36,8 a 37,2 dará lugar a datos aceptables. Guarde el análisis capturado en la ventana Guardar como con un nombre de archivo que incluya el identificador del mouse y el punto de tiempo para facilitar el análisis de datos.Introduzca los detalles del ratón y del punto de tiempo si lo desea en la ventana Detalles del asunto. El escaneo posterior ventral con el ratón en posición supina se muestra aquí después de ajustar el área de escaneo. Tenga en cuenta que la propuesta con el ratón supina da como resultado una parte variable del lado del pie que se está escaneando.Retire la sonda de temperatura rectal y desinfecte con 70% de etanol para que esté lista para el siguiente ratón. Disminuir isoflurano a 0%El ratón se recuperará más rápido si continúa recibiendo oxígeno, pero también se puede recuperar sin oxígeno suplementario. Permita que el ratón se recupere de la anestesia hasta el punto en que muestra un reflejo corrector volteando desde la posición supina a la posición propensa antes de devolverlo a la jaula.La recuperación se puede llevar a cabo ya sea en una manta de calentamiento para isofluranos, ya que la recuperación es muy rápida o en una jaula de recuperación caliente para la ketamina xylazina. Abra el programa de software de revisión de imágenes. Se abrirá una nueva ventana para revisar los exámenes.Vaya al menú Archivo, Abra y busque el archivo guardado. Seleccione el icono roi en la barra de herramientas. Seleccione el icono Agregar polígono.Trace un área alrededor de la región de interés con el ratón. Cuando haya terminado, vuelva a la barra de herramientas y seleccione el icono Estadísticas. Esto abrirá una ventana que muestra las estadísticas de la región de interés.En la revisión de datos, la unidad media de profusión, o PU, los valores no varían más de 100 a 150 PU sobre las exploraciones repetidas para cada almohadilla de pie. Este es un escaneo aceptable e indica que el ratón estaba bien equilibrado durante el escaneo. Los valores medios de PU con una variación superior a 100 a 150 UNIDADES, que corresponde a más del 10% de la perfusión media de una almohadilla de ratón no operada sobre los escaneos repetidos indicarían que el ratón no estaba bien equilibrado y se sugiere encarecidamente una exploración repetida.Realizar un análisis rápido inmediatamente después de completar la exploración permite realizar una exploración repetida mientras el ratón todavía está anestesiado y evitar perder un punto de datos que podría ocurrir si los escaneos se analizan en una fecha posterior y un análisis se considera inaceptable debido a una variación significativa entre los escaneos repetidos. Los resultados se expresan como una proporción de profusión quirúrgica de hindlimb sobre la perfusión de hindlimb de control, ya que los ratones vasodilados inicialmente y luego desarrollan sus colaterales intrínsecos, la recuperación del flujo sanguíneo por LDPI debe verse en un curso de tiempo postoperatorio. El grado de recuperación depende de la tensión del ratón y la gravedad del modelo de isquemia del retroimen.Esta cifra muestra un experimento de curso de tiempo completado durante 28 días donde LDPI se utilizó para medir la recuperación del flujo sanguíneo del footpad con el tiempo después de la ligadura de las arterias femorales y los ratones P27 knockout y wild tipo C57Bl/6. Ambos P27 knockout en ratones de tipo salvaje habían deteriorado la recuperación del flujo sanguíneo cuando se trata con doxiciclina oral, un inhibidor de la matriz generalizada metaloproteínsa, lo que sugiere que la actividad de MMP facilita la arteriogénesis. La configuración de ganancia y el umbral de fondo deben mantenerse constantes durante todo el experimento del curso de tiempo.Si el umbral de fondo se establece demasiado bajo, escanear el material de fondo dará como resultado valores de profusión bajos. Esto dará lugar a que los valores de profusión en segundo plano se promediarán en la región de interés durante la selección de polígonos. Para eliminar este problema, el umbral de fondo se puede ajustar en la ventana Configuración del escáner en la pestaña General.En este caso, el aumento del umbral de fondo a 118 unidades de profusión da como resultado un fondo gris que no se incluirá en ningún análisis. La paleta o escala de color de la imagen de flujo se puede ajustar tanto en el software de medición como en el software de revisión de imágenes. Todos los valores de profusión superiores al valor máximo de la escala se mostrarán como el color de profusión más alto.En este caso, rojo. Aumentar el rango dinámico, por ejemplo, cambiar la escala a rango de cero a 1500, hará que la variación de escaneo repetido sea más obvia para el ojo, ya que las áreas que miden entre 1000 y 1500 unidades de profusión ahora se mostrarán usando el degradado de color en lugar de que todas se muestren como rojas. La exploración que se muestra aquí se obtuvo en un ratón cuya temperatura corporal central estaba inicialmente por debajo de 36.8 al comienzo de la exploración repetida y luego aumentó con respecto a las exploraciones repetidas.Tenga en cuenta que la profusión media de la almohadilla del pie de control se vio más afectada por la temperatura corporal del núcleo más fría que la almohadilla isquémica. Una sola exploración de la temperatura corporal más fría habría dado lugar a una mayor relación de profusión que se registra para este punto de datos. La variación en la pigmentación de la piel del ratón, como se puede ver con ratones C57Bl/6, puede resultar en que el área de escaneo esté por debajo del valor umbral de fondo, lo que dificultará el análisis de las regiones de interés que contienen áreas pigmentadas.Las almohadillas del ratón en general no tienen hiperpigmentación, por lo que esta es la zona más conveniente para buscar esta cepa del ratón. Si el investigador desea estudiar el hindlimb ventral, entonces se debe seleccionar una cepa de ratón blanco. El LDPI es un método eficaz, fácil de realizar y repetible para medir la profusión dérmica de hindlimb como reflejo de la perfusión arterial general.Se requiere una técnica consistente cuando se utiliza LDPI para obtener datos confiables.

Research

JoVE Journal

Medicine

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

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Intraluminal la arteria cerebral media de oclusión (MCAO) Modelo para el ictus isquémico con Orientación flujometría láser Doppler en ratones

Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of disability in the world, with an estimated cost of near $70 billion 
in the United ...

Investigación

Medicina

Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging

Perfusión retrógrada y llenado de la vasculatura coronaria del ratón, como preparación para la Micro tomografía computarizada

Visualization of the vasculature is becoming increasingly important for understanding many different disease states. While several techniques exist for ...

Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Rat

La endotelina-1 inducida por la arteria cerebral media oclusión Modelo para el ictus isquémico con Orientación flujometría láser Doppler en la rata

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in ...

Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

Osmótica Drug Delivery de miembros posteriores isquémicos y la perfusión de la vasculatura con Microfil para Micro-tomografía computarizada

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to ...

Technical Aspects of the Mouse Aortocaval Fistula

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Technical aspects of creating an arteriovenous fistula in the mouse are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made, and the aorta ...

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Combina la microscopia Intravital y ecografía de contraste de la trasera de ratón para estudiar la perfusión muscular y vasodilatación inducida por la insulina

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)

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Metales de imagen en el tejido cerebral por ablación con láser - plasma de acoplamiento inductivo - espectrometría de masas (LA-ICP-MS)

Metals are found ubiquitously throughout an organism, with their biological role dictated by both their chemical reactivity and abundance within a ...

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Resonancia magnética cardiaca en 7 Tesla

CMR at an ultra-high field (magnetic field strength B0&#160;&#8805; 7 Tesla) benefits from the signal-to-noise ratio (SNR) advantage inherent at higher ...

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