Name: in vitro modeling for neurological diseases using direct conversion from fibroblasts to neuronal progenitor cells and differentiation into astrocytes
Uploaded: 2021-06-10T13:45:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes at JoVE.

نشكر جميع المرضى والمتطوعين الأصحاء على التبرع بعينات حرجة للدراسات البحثية. وعلاوة على ذلك، نشكر روشيل رودريغو على المساعدة التقنية المستمرة من الخبراء في زراعة الأنسجة ولورا فيرايولو لتأكيدها بشكل مستقل هذه التقنية في مختبرها كمتعاون. تلقى هذا العمل تمويلا من المعاهد الوطنية الأمريكية للمنح الصحية R01 NS644912-4 وRC2 NS69476-01 (إلى A.L.S.) ومركز باكارد لمنحة أبحاث ALS P2ALS ومؤسسة ربط المساعدة. كما تلقت .M تمويلا من المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم، فضلا عن جائزة تطوير المحققين الشباب من رابطة ضمور العضلات، وصندوق بحوث متلازمة ريت، وأسر مؤسسات SCN2A.

<ol>
	<li>Leenaars, C. H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+to+human+translation:+a+systematic+scoping+review+of+reported+concordance+rates.">Animal to human translation: a systematic scoping review of reported concordance rates.</a> Journal of Translational Medicine. 17 (1), 223 (2019).</li><li>Rhrissorrakrai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+limits+of+animal+models+as+predictors+of+human+biology:+lessons+learned+from+the+sbv+IMPROVER+Species+Translation+Challenge.">Understanding the limits of animal models as predictors of human biology: lessons learned from the sbv IMPROVER Species Translation Challenge.</a> Bioinformatics. 31 (4), 471-483 (2015).</li><li>Hartung, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thoughts+on+limitations+of+animal+models.">Thoughts on limitations of animal models.</a> Parkinsonism &amp; Related Disorders. 14, 81-83 (2008).</li><li>Ladewig, J., Koch, P., Brustle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveling+Waddington:+the+emergence+of+direct+programming+and+the+loss+of+cell+fate+hierarchies.">Leveling Waddington: the emergence of direct programming and the loss of cell fate hierarchies.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (4), 225-236 (2013).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Hamada, M., Malureanu, L. A., Wijshake, T., Zhou, W., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+to+pluripotency+can+conceal+somatic+cell+chromosomal+instability.">Reprogramming to pluripotency can conceal somatic cell chromosomal instability.</a> PLoS Genetics. 8 (8), 1002913 (2012).</li><li>Stricker, S. H., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+neural+lineage+elaboration:+Implications+for+therapeutic+reprogramming.">Epigenetic regulation of neural lineage elaboration: Implications for therapeutic reprogramming.</a> Neurobiology of Disease. 148, 105174 (2020).</li><li>Tang, Y., Liu, M. L., Zang, T., Zhang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Reprogramming+Rather+than+iPSC-Based+Reprogramming+Maintains+Aging+Hallmarks+in+Human+Motor+Neurons.">Direct Reprogramming Rather than iPSC-Based Reprogramming Maintains Aging Hallmarks in Human Motor Neurons.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 359 (2017).</li><li>Kelaini, S., Cochrane, A., Margariti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+adult+cells:+avoiding+the+pluripotent+state.">Direct reprogramming of adult cells: avoiding the pluripotent state.</a> Stem Cells Cloning. 7, 19-29 (2014).</li><li>Kim, E., Tae, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+and+biomaterials+for+controlling+cell+fate.">Direct reprogramming and biomaterials for controlling cell fate.</a> Biomaterials Research. 20, 39 (2016).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+mouse+fibroblasts+to+neural+progenitors.">Direct reprogramming of mouse fibroblasts to neural progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7838-7843 (2011).</li><li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+dermal+fibroblasts+into+neural+progenitor+cells+by+a+novel+cocktail+of+defined+factors.">Direct conversion of dermal fibroblasts into neural progenitor cells by a novel cocktail of defined factors.</a> Current Molecular Medicine. 12 (2), 126-137 (2012).</li><li>Mertens, J., Marchetto, M. C., Bardy, C., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+cell+reprogramming,+differentiation+and+conversion+technologies+in+neuroscience.">Evaluating cell reprogramming, differentiation and conversion technologies in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (7), 424-437 (2016).</li><li>Kim, J., Ambasudhan, R., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming+to+neural+cells.">Direct lineage reprogramming to neural cells.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (5), 778-784 (2012).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li><li>Ambasudhan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+adult+human+fibroblasts+to+functional+neurons+under+defined+conditions.">Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions.</a> Cell Stem Cell. 9 (2), 113-118 (2011).</li><li>Kogiso, T., Nagahara, H., Otsuka, M., Shiratori, K., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdifferentiation+of+human+fibroblasts+into+hepatocyte-like+cells+by+defined+transcriptional+factors.">Transdifferentiation of human fibroblasts into hepatocyte-like cells by defined transcriptional factors.</a> Hepatology International. 7 (3), 937-944 (2013).</li><li>Grath, A., Dai, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cell+reprogramming+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine.">Direct cell reprogramming for tissue engineering and regenerative medicine.</a> Journal of Biological Engineering. 13, 14 (2019).</li><li>Meyer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+patient+fibroblasts+demonstrates+non-cell+autonomous+toxicity+of+astrocytes+to+motor+neurons+in+familial+and+sporadic+ALS.">Direct conversion of patient fibroblasts demonstrates non-cell autonomous toxicity of astrocytes to motor neurons in familial and sporadic ALS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (2), 829-832 (2014).</li><li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Reprogramming+to+Human+Induced+Neuronal+Progenitors+from+Fibroblasts+of+Familial+and+Sporadic+Parkinson's+Disease+Patients.">Direct Reprogramming to Human Induced Neuronal Progenitors from Fibroblasts of Familial and Sporadic Parkinson's Disease Patients.</a> International Journal of Stem Cells. 12 (3), 474-483 (2019).</li><li>Meyer, K., Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia-neuron+interactions+in+neurological+diseases:+Testing+non-cell+autonomy+in+a+dish.">Glia-neuron interactions in neurological diseases: Testing non-cell autonomy in a dish.</a> Brain Research. 1656, 27-39 (2017).</li><li>Verkhratsky, A., Parpura, V., Pekna, M., Pekny, M., Sofroniew, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+in+the+pathogenesis+of+neurodegenerative+diseases.">Glia in the pathogenesis of neurodegenerative diseases.</a> Biochemical Society Transactions. 42 (5), 1291-1301 (2014).</li><li>Ettle, B., Schlachetzki, J. C. M., Winkler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+and+Myelin+in+Neurodegenerative+Diseases:+More+Than+Just+Bystanders.">Oligodendroglia and Myelin in Neurodegenerative Diseases: More Than Just Bystanders.</a> Molecular Neurobiology. 53 (5), 3046-3062 (2016).</li><li>Ferraiuolo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocytes+contribute+to+motor+neuron+death+in+ALS+via+SOD1-dependent+mechanism.">Oligodendrocytes contribute to motor neuron death in ALS via SOD1-dependent mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (42), 6496-6505 (2016).</li><li>Palpagama, T. H., Waldvogel, H. J., Faull, R. L. M., Kwakowsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Microglia+and+Astrocytes+in+Huntington's+Disease.">The Role of Microglia and Astrocytes in Huntington's Disease.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 258 (2019).</li><li>Maezawa, I., Swanberg, S., Harvey, D., LaSalle, J. M., Jin, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome+astrocytes+are+abnormal+and+spread+MeCP2+deficiency+through+gap+junctions.">Rett syndrome astrocytes are abnormal and spread MeCP2 deficiency through gap junctions.</a> Journal of Neuroscience. 29 (16), 5051-5061 (2009).</li><li>Hautbergue, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRSF1-dependent+nuclear+export+inhibition+of+C9ORF72+repeat+transcripts+prevents+neurodegeneration+and+associated+motor+deficits.">SRSF1-dependent nuclear export inhibition of C9ORF72 repeat transcripts prevents neurodegeneration and associated motor deficits.</a> Nature Communications. 8, 16063 (2017).</li><li>Almad, A., Maragakis, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stocked+toolbox+for+understanding+the+role+of+astrocytes+in+disease.">A stocked toolbox for understanding the role of astrocytes in disease.</a> Nature Reviews Neurology. 14 (6), 351-362 (2018).</li><li>Gatto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directly+converted+astrocytes+retain+the+ageing+features+of+the+donor+fibroblasts+and+elucidate+the+astrocytic+contribution+to+human+CNS+health+and+disease.">Directly converted astrocytes retain the ageing features of the donor fibroblasts and elucidate the astrocytic contribution to human CNS health and disease.</a> Aging Cell. , (2020).</li><li>Caiazzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+fibroblasts+into+functional+astrocytes+by+defined+transcription+factors.">Direct conversion of fibroblasts into functional astrocytes by defined transcription factors.</a> Stem Cell Reports. 4 (1), 25-36 (2015).</li><li>Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+punch+biopsy+explant+culture+for+derivation+of+primary+human+fibroblasts.">Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e3779 (2013).</li><li>Pear, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+methods+for+preparation+of+high-titer+retroviral+supernatants.">Transient transfection methods for preparation of high-titer retroviral supernatants.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 11 (2001).</li><li>Boczonadi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+glycyl-tRNA+synthetase+impair+mitochondrial+metabolism+in+neurons.">Mutations in glycyl-tRNA synthetase impair mitochondrial metabolism in neurons.</a> Human Molecular Genetics. 27 (12), 2187-2204 (2018).</li><li>Rinaldi, F., Motti, D., Ferraiuolo, L., Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+analysis+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">High content analysis in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 80, 180-191 (2017).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

باختصار ، التحويل المباشر هو طريقة سريعة وسهلة لتوليد خلايا السلف العصبية المستحثة من الخلايا الليفية الجلدية المريضة. هذا الأسلوب مفيد بسبب سرعته وكذلك العدد الكبير من الخلايا التي تم إنشاؤها التي يسهل الحفاظ عليها. وعلاوة على ذلك، تشير الأدلة المتزايدة إلى أن أساليب إعادة البرمجة المباشرة تزيل علامات أقل لا جينية مقارنة بتكنولوجيا إعادة برمجة iPSC الكلاسيكية، وبالتالي تتركبيئةالمرض أكثر سلامة 4و7و8. تمايز الشخصيات غير المعملية إلى الخلايا الفلكية مستقيم جدا إلى الأمام وقابل للاستنساخ للغاية حتى بين مختبرات مستقلة متعددة19،29،33. ويمكن تجميد الشخصيات غير المناقصة في أجزاء صغيرة وذوبانها مباشرة لأغراض التمايز، مما يساعد على تقليل التباين بين التجارب حيث يمكن الاحتفاظ بأرقام المرور متشابهة. تلعب الخلايا الفلكية دورا حاسما في تطور المرض في العديد من الأمراض العصبية ، وبالتالي فهي نوع من الخلايا المثيرة للاهتمام للعمل معها. يمكن استخدام الخلايا الفلكية للدراسات الميكانيكية أو الدراسات الأيضية أو فحوصات اختبار المخدرات وعادة ما تزرع كخلايا أحادية. وعلاوة على ذلك، يمكن الجمع بين الخلايا الفلكية في نظم الثقافة المشتركة مع الماوس أو الخلايا العصبية البشرية لتقييم تأثير الخلايا الفلكية على بقاء الخلايا العصبية ومورفولوجيا، وكلاهما قراءات جيدة لاختبار المخدرات34.
من أجل استخدام هذا البروتوكول بنجاح، يجب أن يتم الأخذ بعين الاعتبار بعض النقاط والقيود المحتملة. الخلايا الليفية الجلد البشري على سبيل المثال تختلف اختلافا كبيرا في معدل انقسام الخلايا، فضلا عن الاستجابة لنواقل الفيروسية. وبما أن هذه ليست خطوط الخلايا الموحدة، فهي متغيرة مثل البشرية نفسها، كل سطر مختلف. أما بالنسبة للعديد من أساليب إعادة البرمجة، فمن الأسهل إعادة برمجة الخلايا الليفية التي لديها معدل انقسام الخلايا المعتدلة إلى السريعة مقابل الخلايا التي بالكاد تكرر. يمكن أن يتأثر معدل النسخ المتماثل بجودة خزعة الجلد ومعالجة نفسه ، من خلال عدد مرور الخلايا الليفية وكذلك المناولة. عند العمل مع الخلايا الليفية الجلدية الأولية، من المهم عدم السماح للخلايا الحصول على كثيفة جدا لتجنب تحريض الشيخوخة. إذا كانت الخلايا الليفية لا تنمو بشكل جيد ، فمن الأفضل تجربة مخزون جديد أو ممر أقل ، على الرغم من أنه في بعض الحالات ، يمكن أن يلعب المرض نفسه دورا أيضا. يمكن تحسين انقسام الخلايا في بعض الأحيان باستخدام 15٪ أو 20٪ FBS في وسائط الخلايا الليفية مقارنة ب 10٪ القياسية.
نوعية إعادة برمجة ناقلات الفيروسية ذات أهمية كبيرة للنجاح. في أيدينا، كانت ناقلات الفيروسات الرجعية أكثر كفاءة بالمقارنة مع ناقلات العدسية أو غيرها من الفيروسات غير المتكاملة؛ ومع ذلك ، يمكن أن يعتمد هذا على جودة النواقل الفيروسية والنقاء. مجموعات ناقلات الفيروسات الرجعية التجارية عادة تحديد تركيز ناقلات الفيروسية وغالبا ما أيضا تعدد العدوى لخط الخلية معينة. من المهم أن نضع في اعتبارنا أن الخلايا الليفية الأولية تختلف عن خط الخلية المستخدمة من قبل الشركات لتحديد امتصاص ناقلات الفيروسية. وعلاوة على ذلك، حتى عند طلب نفس المجموعة التجارية، والاختلاف بين دفعات أمر شائع. وعلاوة على ذلك، فإن امتصاص ناقلات الفيروسية يختلف أيضا بين خطوط الخلايا الليفية. يمكن أن تكون بعض الخطوط أكثر حساسية وبالتالي يمكن أن تموت الخلايا المنقولة ، في حين أن خطوط الخلايا الأخرى قد تكون أكثر مقاومة لامتصاص الفيروس. وبالتالي، يمكن تحديد كفاءة النقل لخط خلية معينة تكون مهمة خاصة إذا كان خط الخلية ينمو ببطء أو فشلت محاولات التحويل السابقة. في أيدينا ، فإن أفضل طريقة لتقييم مقدار ناقل فيروسي معين مطلوب للتحويل هي إجراء تلطيخ مناعي مع العديد من التخفيفات من الناقل الفيروسي. ويمكن بعد ذلك حساب عدد الخلايا التي تعبر عن المتحول لكل متجه، بهدف تحقيق كفاءة في النقل بنسبة 70 في المائة أو أكثر. في تجربتنا، يمكن استخدام MOIs مماثلة لمعظم خطوط الخلية ولكن يمكن تعديل وزارة الداخلية إذا لزم الأمر.
أثناء عملية التحويل، من الضروري عدم تقسيم الخلايا مبكرا جدا. يعتمد الوقت حتى تصبح الخلايا جاهزة للانقسام على عوامل متعددة بما في ذلك خط الخلية الأساسي وخصائصه وجودة الناقل الفيروسي المستخدم وجودة الوسائط. الأهم من ذلك ، فإن معدل نجاح التحويل أعلى بكثير عندما يتم الاحتفاظ بالخلايا بكثافة عالية. حتى لو بدأت الخلايا في تغيير مورفولوجيا، فمن الأفضل ترك الخلايا في أول أطول بكثير من تقسيمها قبل الأوان. إذا حدث الانقسام في وقت مبكر جدا التحويل يمكن أن تتوقف في تقدمها وتؤدي الخلايا للتمييز مرة أخرى إلى شكل مثل الخلايا الليفية والسلوك. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يؤدي تمييعها في وقت مبكر جدا إلى أجسام خلايا أكثر استطالة مقارنة بأجسام الخلايا الصغيرة والمدمجة للشخصيات التي لوحظت سابقا. وبالتالي، ينبغي أن تكون الانقسامات الأولى محافظة دائما؛ وينبغي أن تكون الانقسامات الأولى في حالة من الانقسامات، وينبغي أن تكون الانقسامات الأولى في حالة فمن الأفضل للحفاظ على الخلايا كثيفة جدا مع انقسام 1:1 أو 1:2 مقارنة مع تمييع لهم أكثر من اللازم. ومن المتوقع حدوث بعض وفيات الخلايا بعد الانقسام الأولي. من الجدير بالذكر أن الخلايا تبدو دائما أسوأ (تملق) في اليوم الأول بعد تقسيم، وهو أمر طبيعي. وينبغي أن يكون أفضل الأحكام على شكل الخلية 2-3 أيام في وقت لاحق. والأهم من ذلك أن نوعية عوامل النمو ومكونات وسائط الإعلام أمر بالغ الأهمية أيضا. من المهم إعداد كميات صغيرة من الوسائط التي تحتوي على عوامل النمو بحيث يتم استخدام الوسائط المعدة بالكامل فقط لمدة 5-7 أيام كحد أقصى. لا تبقي الوسائط في درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية لفترات طويلة من الزمن. استخدمها بسرعة ثم قم بتبريدها بمجرد إجراء تغيير الوسائط. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يساعد الحفاظ على مستوى صوت الوسائط منخفضا عند 1 مل بدلا من 2 مل خاصة بالنسبة لخطوط الخلايا الأكثر مقاومة للتحويل. إذا كانت الخلايا تستهلك وسائل الإعلام بسرعة، والتي يمكن ملاحظتها عن طريق تغيير في شكل لون الوسائط الأحمر إلى الأصفر (معدل الحموضة)، وضبط حجم وسائل الإعلام إلى ما يصل إلى 2 مل. 10 - ويعتبر الاستهلاك السريع لوسائط الإعلام علامة إيجابية، وكثيرا ما يلاحظ في مراحل لاحقة من التحويل إلى جانب زيادة الانتشار.
كما أن الشخصيات غير المكتتة بالشخصيات حساسة جدا لوجود الأكوتاسي في وسائط الإعلام، ومن المهم جدا أن تبقي فترة حضانة الأكوتاسي قصيرة. نوصي بفترة حضانة مدتها 2-4 دقائق ، وفحص الخلايا بشكل متكرر تحت المجهر لمعرفة متى انفصلت. من الضروري طرد الخلايا بعد تقسيمها لإزالة مزيج الإنزيم من الوسائط. من المهم أيضا أن نأخذ رقم المرور في الاعتبار حيث يمكن أن تتغير خطوط الخلية عند الاستزراع الممتد مما يؤدي إلى تغيير ملامح التعبير. وبالتالي، من المهم تجميد العديد من مخزونات الخلايا في الممرات المبكرة. يجب تجميد الخلايا في 10٪ DMSO و 90٪ وسائل الإعلام المجلس الوطني للصحافه وتخزينها على المدى الطويل في النيتروجين السائل. بسبب عدم وجود مصل في هذه الوسائط من الأهمية بمكان ضمان تجميد بطيء باستخدام غرف التجميد وتجميد مرة واحدة بين عشية وضحاها، ونقل فورا إلى النيتروجين السائل. في حين لا يتم إجراء اختيار كلونال في هذا البروتوكول، فمن الممكن أن الاستزراع الموسع والتمريرة يؤدي إلى الانتقاء الطبيعي للسكان الخلية الأولية مع النمو مواتية ومعدل البقاء على قيد الحياة. لذلك ، من المهم أن نأخذ رقم المرور والمناولة في الاعتبار عند إجراء التجارب. نحن نفضل استخدام مقاطع أقل للتجارب ، إذا كان ذلك ممكنا ، لا نتجاوز تمرير خطوط الخلية لأكثر من 20 مرة. وبما أن المركبات غير الوطنية تنمو بسرعة، يمكن تجميد أعداد كبيرة من المخزونات في ممرات أدنى للتجارب. خطوط الخلايا ذات معدلات النمو المرتفعة بشكل خاص هي أكثر عرضة لتحمض وسائل الإعلام. وهكذا، ومع نمو خطوط الخلايا بسرعة مختلفة، قد تحتاج كمية الوسائط إلى تعديل استنادا إلى الانتشار. إذا تركت الخلايا باستمرار في وسائل الإعلام المحمضة للغاية، فإنه يمكن أن تؤثر على صحة كل من السيطرة وخطوط خلايا المرض. وهذا يؤدي حتى الخلايا الفلكية صحية لتصبح رد الفعل، مما يؤثر على استخدامها في مزيد من التمايز والتجارب.
بالنسبة لتمايز الخلايا الفلكية ، من المهم الحفاظ على الخلايا في كثافة منخفضة حيث أن الكثافة العالية ستمنع الخلايا من التفريق وستواصل الانتشار بمعدلات أعلى. وبالتالي، يجب تعديل كثافة البذر لكل خط خلية يعتمد على معدل انتشارها. نوصي بتجربة كثافات البذر المختلفة وتنفيذ البقع / RT-PCR مع علامات الخلايا الفلكية لضمان التمايز المناسب. يمكن تقييم جودة IAs جنبا إلى جنب مع الضوابط الصحية باستخدام المقايسات الثقافة المشتركة مع الخلايا العصبية. شريطة أن لا يؤدي مرض الأمراض إلى النمط الظاهري التفاعلي ، يجب أن تظل الخلايا العصبية قابلة للحياة في اتصال مع iAs لعدة أيام. يمكن أن يختلف مورفولوجيا الخلايا الفلكية بشكل كبير بين خطوط الخلايا الفردية ويمكن أن يتأثر بالنمط الظاهري للمرض أيضا. وعلاوة على ذلك، في الأمراض التي تتأثر فيها الخلايا الفلكية بشكل كبير، فإنها قد تظهر النمط الظاهري التفاعلي مع تمديدات كبيرة ممدود.

فهم آليات الأمراض الكامنة أمر بالغ الأهمية للأمراض العصبية لأنه يساعد في وضع استراتيجيات علاجية محتملة. في حين أن النماذج الحيوانية تاريخيا كانت المعيار الذهبي للبحث في أمراض الجهاز العصبي ، فإن الترجمة المباشرة للعلاجات المحتملة إلى بيئة سريرية غالبا ما تظهر نجاحا محدودا1و2و3. أسباب عدم وجود الترجمة هي عدم وجود تباين في الخلفية الوراثية والطفرات في الفئران ، والعرض غير الكامل للأنماط الظاهرية للمرض والاختلاف في حساسية الدواء أو التعاطي في المرضى البشريين التي لا يتم تصويرها بشكل جيد في سلالات الفئران الأصيلة. وعلاوة على ذلك، بالنسبة للعديد من الاضطرابات العصبية النادرة، لا تتوفر نماذج حيوانية أو عدد قليل منها. دراسة آليات المرض مباشرة في أنواع الخلايا البشرية ذات الصلة يمكن أن تسهل البحث وتحسين الترجمة إلى العيادة. بالنسبة لاضطرابات الجهاز العصبي المركزي ، يصعب استرداد الخلايا البشرية الأولية وتمثل مصدرا محدودا جدا لأن الخزعات غازية أو لا يمكن استرجاعها إلا بعد الوفاة في المرحلة النهائية من المرض. في السنوات ال 15 الماضية ، وتطوير تكنولوجيا إعادة برمجة الخلايا وسعت بسرعة القدرة على نموذج الأمراض العصبية العصبية والعصبية البشرية في المختبر.
تتضمن الطرق التقليدية لإعادة برمجة الخلايا إعادة برمجة الخلايا الليفية أو أنواع الخلايا الأخرى إلى خلايا جذعية مستحثة متعددة القدرات (iPSCs) قادرة على التفريق بين أنواع الخلايا من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث4. كان تاكاهاشي ويماناكا أول من أظهر أن إعادة التعبير عن أربعة عوامل لنسخ الخلايا الجذعية كافية لإعادة توجيه الخلايا الجسدية لتصبح iPSCs5. ويمكن بعد ذلك تمييز iPSCs إلى أنواع خلايا محددة. ومع ذلك ، فإن العيب في هذه العملية هو أنه من العمالة الكثيفة وتستغرق وقتا طويلا لتوليد وعزل استنساخ الخلايا الجذعية مستقرة. كما يتم الحفاظ على الطفرات الجسدية أو أبرانسات محددة من الخلية الأم في استنساخ الخلايا الجذعية ويمكن أن تؤثر على نتائجالدراسة 6. وبالإضافة إلى ذلك، تشير الأدلة المتزايدة إلى أن عمليةإعادةبرمجة الخلايا الجذعية تمحو التغيرات اللاجينية القيمة التي يمكن أن تؤثر على آليات المرض الخلوي 4و7و8. في السنوات الأخيرة، ركز الباحثون على أساليب إعادة البرمجة المعدلة التي تسمح بتوليد أكثر مباشرة من أنواع الخلايا المختلفة مع تجاوز حالة الخلايا الجذعية متعددة القدرات9و10و11و12 (تمت مراجعتها في 13و14). كشفت الاختراقات الأولية في المختبر إعادة برمجة الخلايا الليفية إلى خلايا القلب15، الخلايا العصبية16 وخلايا الكبد17 عن طريق التعبير خارج الرحم من عوامل النسخ النسب محددة متعددة أو microRNAs18. وأعقب ذلك دراسات مباشرة إعادة برمجة الخلايا لنموذج الاضطرابات العصبية19,20. وكما ذكر أعلاه، فإن بروتوكولات إعادة البرمجة أو التحويل المباشرة هذه لها مزايا محتملة على بروتوكولات iPSC الكلاسيكية بما في ذلك السرعة واجتثاث خطوة العزلة اللاستنساخية. وعلاوة على ذلك، تشير الأدلة إلى أن هذه البروتوكولات تسمح بالحفاظ على كمية أكبر من المعلومات اللاجينية المتعلقة بعمر المريض ومن المرجح أن ينطبق الشيء نفسه على العلامات ذات الصلة بالمرض7،8.
حتى الآن، ركزت معظم البحوث في المختبر على الاضطرابات العصبية في المقام الأول على الخلايا العصبية. ومع ذلك ، فمن المعروف جيدا أن أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا الفلكية ، microglia وoligodendrocytes تلعب دورا حاسما في أمراض الأمراض وتطور الاضطرابات العصبية مثل مرض الزهايمر (AD) ، والتصلب الجانبي الضموري (ALS) ، ومرض باركنسون (PD) ، ومرض هنتنغتون (HD) ، والتصلب المتعدد (MS) ، وأمراض عصبية أخرى مثل متلازمة ريت (RTT) ، واضطرابات النوم ، الإدمان والصرع واضطرابات التخزين الليسوسومية والاكتئاب والصداع النصفي والألم المرضي21،22،23،24،25،26. الخلايا الفلكية هي نوع الخلية الأكثر وفرة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) وحتى وقت قريب ، تم إهمالها على نطاق واسع من وجهة نظر مرضية7. ومن المعروف الآن أن لها دورا حاسما في دعم ما يقرب من جميع الوظائف الهوستاتيكية من الجهاز العصبي المركزي صحية. بالإضافة إلى ذلك ، من الواضح أن لها تأثيرا مرضيا مهما وقيمة جدا في فهم آلية المرض وتقييم الاستراتيجيات العلاجية19.
في الوصف الحالي ، نقوم بتفصيل بروتوكول للتحويل المباشر للخلايا الليفية للمريض البشري إلى خلايا سلف عصبية مستحثة (iNPCs) باستخدام ناقلات الفيروسات الرجعية التي تعبر عن عوامل إعادة برمجة Yamanaka (Klf4 ، Oct3 /4 ، Sox2 و c-Myc) والتعرض اللاحق لوسائل الإعلام العصبية. استخدمت الدراسات السابقة مجموعات مختلفة من العوامل النسخية لإعادة البرمجة المباشرة للخلايا العصبية (تمت مراجعتها في 14)، ولكن العوامل المستخدمة في البروتوكول الموصوف متاحة على نطاق واسع إما كالبلازميدات في الإنتاج الداخلي للناقلات الفيروسية ، أو كما هي متاحة تجاريا جاهزة للذهاب مجموعات إعادة البرمجة الفيروسية. يمكن تمييز الخلايا العصبية الناتجة عن ذلك إلى خلايا عصبية مستحثة (iNs)27، oligodendrocytes (iOs)24 والخلايا الفلكية (iAS)19 لدراسة دورها في الأمراض العصبية. بروتوكولنا لا ينطوي على توليد تستغرق وقتا طويلا من iPSCs التي تستخدم معظم البروتوكولات المتاحة لاشتقاق الخلايا الفلكية البشرية28. ما يقرب من 98٪ إلى 100٪ من الشخصيات غير المبرمجة مباشرة يمكن أن تفرق إلى الخلايا الفلكية إيجابية GFAP29 بالمقارنة مع 2٪ فقط باستخدام طريقة التحويل المباشر من الخلايا الليفية إلى الخلايا الفلكية30. في الآونة الأخيرة ، أظهرت دراسة نسخية مقارنة باستخدام طريقة إعادة البرمجة الموصوفة لدينا أن الشخصيات الطبيعية التي تمت برمجتها من الخلايا الليفية المانحة يمكن أن تحتفظ بميزات الشيخوخة على المستوى النسخي والوظيفي المشابه للعمر المطابق للخلايا الفلكية بعد الوفاة والخلايا الفلكية الأولية29. وبالتالي، فإن بروتوكول التحويل هذا هو أداة قوية للتحقيق في آليات المرض وتقييم النهج العلاجية الجديدة للاضطرابات العصبية والعصبية المرتبطة بالعمر.
هنا نصف البروتوكول المستخدمة لتوليد الشخصيات الوطنية والتمايز في اتفاقات الاستثمار الدولية ، والتي هي الأكثر ملاءمة على نطاق أوسع صغيرة الفحص الجزيئي المقايسات. يمكن القيام بآليات الأمراض واختبار الأدوية باستخدام iAs باستخدام منهجيات مختلفة مثل الثقافات المشتركة مع الخلايا العصبية أو التحليل الأيضي والكيميائي الحيوي. ميزة هذا النظام هو سرعة وسهولة صيانة هذه الخطوط الخلية بالمقارنة مع iPSCs. وعلاوة على ذلك، يمكن تجميد الشخصيات غير الوطنية في أجزاء صغيرة من أجل تمايز اتفاقات الاستثمار الدولية مما يسهل اختبار المخدرات في ظل ظروف ثابتة على مدى فترات طويلة من الزمن. وعموما، تصبح مقارنة أعداد العينات الأكبر ممكنة بهذه الطريقة التي تفتح الباب لتقييم الإمكانات العلاجية للمركبات في عدد أكبر وأكثر تمثيلا من المرضى.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100mm x 2mm Style dish, Cell culture treated, Nonpyrogenic</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td>Tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical screw cap centrifuge tubes, copolymer polypropylene</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1475-1611</td>
			<td>Used for lifting and centrifuge cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1500-1811</td>
			<td>Media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Antibiotic with antifungal activity for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27&#160; Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504044</td>
			<td>For NPC and base media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials&#160; 1.2ML</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430658-500EA</td>
			<td>For freezing cell stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX&#160; Supplement, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>For fibroblast and Astrocyte media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX&#160; supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565042</td>
			<td>For NPC and base media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438-50ML</td>
			<td>For freezing cell stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190136</td>
			<td>Referred in protocol as PBS. For fibronectin dilution and cell wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ Retrovirus iPSC Reprogramming Kit</td>
			<td>ALSTEM</td>
			<td>RF101</td>
			<td>Retrovirus containing the Yamanaka factors. Virus can also be made in-house.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-036</td>
			<td>Referred in protocol as FBS . For Fibroblast and Astrocyte media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-461</td>
			<td>Filter media (50mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149-10KU</td>
			<td>Referred in protocol as Heparin. Used in conversion media. Powder diluted in ultrapure water. Final stock concentration of 5000X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FC010-10MG</td>
			<td>Referred in protocol as Fibronectin, used in 1:200 dilution for coating.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (technical grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25372A</td>
			<td>For freezing cell stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>For freezing cell stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>For Astrocyte, NPC and base media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Referred in protocol as EGF, used in conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Referred in protocol as FGF, used in NPC and conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Referred in protocol as Accutase. Used for lifting during the conversion process and NPCs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2GPU05RE</td>
			<td>Media filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 6 well, Flat bottom with Low evaporation lid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td>Tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300062</td>
			<td>Lifting of Fibroblasts and Astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Puradisc 25 syringe filters, 0.2 &#956;m, PES sterile</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>80-2502</td>
			<td>Filter media (50mL)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro modeling for neurological diseases using direct conversion from fibroblasts to neuronal progenitor cells and differentiation into astrocytes

تركز الأبحاث على الاضطرابات العصبية في المقام الأول على تأثير الخلايا العصبية على آليات المرض. يؤثر التوافر المحدود للنماذج الحيوانية تأثيرا شديدا على دراسة مساهمات محددة لنوع الخلية في المرض. وعلاوة على ذلك، فإن النماذج الحيوانية عادة لا تعكس التباين في الطفرات ودورات الأمراض التي ينظر إليها في المرضى البشر. أحدثت طرق إعادة البرمجة لتوليد الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) ثورة في أبحاث المريض المحددة وخلقت أدوات قيمة لدراسة آليات المرض. ومع ذلك ، فإن تقنية iPSC لها عيوب مثل الوقت والالتزام بالعمل والانتقائية اللاستنساخية وفقدان العلامات اللاجينية. تسمح التعديلات الأخيرة لهذه الطرق بتوليد أكثر مباشرة من أنساب الخلايا أو أنواع خلايا محددة ، متجاوزة العزلة اللاستنساخية أو حالة الخلايا الجذعية متعددة القدرات. لقد طورنا طريقة تحويل مباشرة سريعة لتوليد خلايا السلف العصبية المستحثة (iNPCs) من الخلايا الليفية الجلدية باستخدام ناقلات الفيروسات الرجعية في تركيبة مع وسائل الإعلام العصبية. يمكن تمييز ال INPCs إلى خلايا عصبية (iNs) أوليغودندروسيتوس (iOs) والخلايا الفلكية (iAs). ويسهل إنتاج اتفاقات مكافحة المخدرات إجراء اختبار سريع لآلية المخدرات والأمراض لأن التمايز عن الشخصيات غير الوطنية لا يستغرق سوى 5 أيام. وعلاوة على ذلك، من السهل العمل مع اتفاقات الاستثمار الدولية ويتم إنشاؤها في مجموعات سكانية نقية بأعداد كبيرة. قمنا بتطوير اختبار الثقافة المشتركة القابلة للاستنساخ للغاية باستخدام الخلايا العصبية GFP + الماوس و iAs المشتقة من المريض لتقييم الاستراتيجيات العلاجية المحتملة للعديد من الاضطرابات العصبية والعصبية. الأهم من ذلك ، فإن مقايسات iA قابلة للتطوير إلى تنسيق 384 جيدا مما يسهل تقييم جزيئات صغيرة متعددة في لوحة واحدة. يسمح هذا النهج بإجراء تقييم علاجي متزامن لخطوط خلايا المريض المتعددة ذات الخلفية الوراثية المتنوعة. سهولة إنتاج وتخزين iAs والقدرة على فحص مركبات متعددة في مقايسة واحدة يجعل هذه المنهجية قابلة للتكيف مع الطب الشخصي.

يسمح هذا البروتوكول بالتوليد السريع والسهل للشخصيات غير المشلولة مباشرة من الخلايا الليفية الجلدية البشرية باستخدام الفيروسات الرجعية التي تحتوي على عوامل ياماناكا. تسمح هذه الطريقة بتجاوز حالة الخلايا الجذعية والحاجة إلى التحديد الكلوني ، وبالتالي تجنب الاختلاف اللاستنساخي. الخطوات الهامة التي يجب وضعها في الاعتبار أثناء خضوع الخلايا لعملية التحويل هي كثافة البذر في الخلايا الليفية ، درجة الحموضة في الوسائط والحفاظ على الخلايا في التقاء أمثل. يمكن العثور على أمثلة على التغيرات المثلى في التقاء التقسيم والمورفولوجيا أثناء عملية التحويل في الشكل 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62016/62016fig01.jpg"> الشكل 1. صور تمثيلية لعملية التحويل بعد إضافة المزيج الرجعي لعوامل ياماناكا. تم زرع الخلايا الليفية ونقلها بعد أربع وعشرين ساعة مع عوامل ياماناكا. بعد يومين من الفيروس (DPV)، تم تغيير الوسائط إلى وسائط التحويل. تم استزراع الخلايا في وسائط التحويل حتى كانت جاهزة للمرور (13 DPV). تم زرع الخلايا بعد مرور للوصول إلى التقاء 80٪ في اليوم التالي (14 DPV). حافظت الممرات اللاحقة على هذه الكثافة حتى تبدأ خلايا السلف العصبية في الانقسام بسرعة. مقياس الشريط هو 200 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62016/62016fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
بعد اكتمال عملية التحويل ، فإن NPCs تظهر تعبيرا مخفضا بقوة أو لا تعبير عن علامات الورم الليفي ومورفولوجيا ، والتعبير عن علامات الخلايا المحددة للمجلس الوطني للصحافه(الشكل 2). وعلاوة على ذلك، يمكن استخدامها أيضا لتوليد خطوط خلايا مختلفة، مثل iNs و iOs و iAs.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62016/62016fig02.jpg"> الشكل 2. الخلايا التي تخضع لعملية التحويل تعبر عن علامات خاصة بالخلايا. تم بذر الخلايا الليفية المريض (A) ، والخلايا السلف العصبية المستحثة (iNPCs (B) والخلايا الفلكية المستحثة (iAs (C) على أغطية زجاجية في لوحة معالجة 24 زراعة أنسجة جيدة. كانت الخلايا ملطخة بالمناعة ل: علامات الخلايا المحددة للخلايا الليفية (A) ، Vimentin (الأخضر) و TE7 (أحمر) ، علامة الخلية المحددة iNPC (B) ، Nestin (أحمر) ، وعلامة الخلية iAs (C) GFAP (الأرجواني) وعلامة iNPC Nestin (خضراء). مقياس الشريط هو 50 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62016/62016fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
في تجربتنا، iAs على وجه الخصوص هي قيمة جدا لاختبار آلية المخدرات والمرض لأنها يمكن أن تتولد في مجموعات نقية (98٪ أو أكثر من الخلايا الإيجابية GFAP29) بأعداد كبيرة قابلة للاستنساخ. يمكن تمييز iAs عن iNPCs عن طريق أخذ aaliquot صغيرة من الخلايا أثناء تقسيم أو جزء iNPC المجمدة سابقا والطلاء مباشرة في وسائل الإعلام astrocyte. اعتبارات هامة خلال هذه العملية هي الحفاظ على الكثافة الأولية للبذر iNPCs منخفضة (الشكل 3 والشكل 4)، كما ثبت كثافة عالية لعرقلة عملية التمايز(الشكل 4)وإيلاء اهتمام إضافي لحاء وسائل الإعلام، كما يمكن للتحمض تنشيط حتى الخلايا الفلكية صحية.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62016/62016fig03.jpg"> الشكل 3. صور تمثيلية لعملية إنشاء iAs من الشخصيات الوطنية. يتم بذر الشخصيات في وسائط الخلايا الفلكية (الجدول 1) بكثافة بذر منخفضة. كثافة البذر الجيدة حوالي 10٪ في اليوم الأول بعد البذر (DPS) (يسار)؛ ومع ذلك، يمكن تعديل هذه الكثافة وفقا لمعدل نمو الخلايا. يمكن ملاحظة مورفولوجيا iAs النموذجية بعد 5 DPS (وسط). في بعض الحالات، يمكن ملاحظة مورفولوجيا الخلايا الفلكية الشاذة، مع امتدادات طويلة وشائكة. هذا التغيير يدل على تنشيط الخلايا الفلكية ويمكن أن تكون ثانوية لحالة المرض أو تقنيات زراعة غير صحيحة (حق). مقياس الشريط هو 200 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62016/62016fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62016/62016fig04.jpg"> الشكل 4. تؤثر كثافة البذر iNPC على كفاءة تمييز iAs. تم زرع خطوط التحكم iNPC في كثافة منخفضة (A) و (B) عالية في وسائط Astrocyte لإظهار آثار كثافة البذر على التمايز. 5 DPS، أعرب خط منخفض الكثافة علامات محددة للخلايا الفلكية، في حين أن خط عالية الكثافة يظهر مزيجا من علامات iNPC و iAs مع مورفولوجيا تشبه iNPC ملحوظ. مقياس الشريط هو 50 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62016/62016fig04large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الشكل التكميلي 1- الزيادة في النسبة إلى 100 في المائة من ال أرقام إضافية لعملية التحويل بعد إضافة مزيج الرجعية من العوامل ياماناكا. صور لعملية التحويل في 12 DPV (1 قبل يوم من مرور) و 19 DPV (6 أيام بعد مرور). لاحظ الفرق في مورفولوجيا بين الخلايا قبل وبعد مرور، في 12 خلايا DPV لديها مورفولوجيا بنية تشبه الكرة. بعد مرور وعدة أيام على وسائل الإعلام التحويل (الجدول 1) تبدأ الخلايا عرض مورفولوجيا تشبه NPC. مقياس الشريط هو 200 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62016/Supplemental%201.%20Additional%20Images%20Conversion.tif" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes at JoVE.

In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes

نحن نصف بروتوكولا لإعادة برمجة الخلايا الليفية المشتقة من الجلد البشري إلى خلايا السلف العصبية المستحثة (iNPCs) ، وتمايزها اللاحق إلى خلايا أستراتية مستحثة (iAs). وتؤدي هذه الطريقة إلى توليد سريع وقابل للاستنساخ من الشخصيات غير الوطنية وأجهزة iAs بكميات كبيرة.

في المختبر النمذجة للأمراض العصبية باستخدام التحويل المباشر من الخلايا الليفية إلى خلايا السلف العصبية والتمايز إلى الخلايا الفلكية

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely ...

نحن نستخدم هذا البروتوكول لجعل خلايا السلف العصبية من الخلايا الليفية الجلد المريض ودراسة الأمراض العصبية والعصبية. نشعر أن هذا البروتوكول لديه الكثير من المزايا على تكنولوجيا IPS الكلاسيكية ، بما في ذلك السرعة ، ولكن أيضا الحصول في بعض الحالات على النمط الظاهري للمرض أكثر حدة. نحن ندرس الأمراض العصبية والعصبية واستخدام عينات الجلد يسمح لنا حقا لتقييم تنوع المرضى كذلك.مختبري مهتم بشكل خاص بدور الخلايا الفلكية في الأمراض ونحن نستخدم الخلايا الفلكية التي نصنعها من الNPCs لاختبار الأدوية وكذلك لدراسة آليات المرض ، ولكن أيضا في الثقافات المشتركة مع الخلايا العصبية البشرية والفأرة. نأمل أن يكون هذا البروتوكول مفيدا ويرجى التواصل إذا كان لديك أي أسئلة. شكرًا لك.استخدام الخلايا الليفية الجلد البشري الأولية التي يمكن الحصول عليها من بنوك الخلايا أو خزعات الجلد. خلايا الاستزراع عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة أنسجة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. خلايا المرور لمدة واحد إلى اثنين على الأقل من المقاطع بعد ذوبان الجليد قبل استخدامها في التجربة.مرة واحدة في الخلايا جاهزة، معطف بئر من لوحة من ستة آبار مع فيبروكتين الإنسان في تركيز 1:200 المخفف في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 20 دقيقة. إعداد وسائط الخلايا الليفية كما هو موضح في الجدول الأول. عندما تكون الخلايا جاهزة لتكون مطلية، وإزالة فيبروكتين من الطبق وإضافة فورا حل الخلية أو اثنين من ميل من وسائل الإعلام فيبرومبلاست.لا تدع الطبق يجف قبل إضافة الوسائط. اعتمادا على مدى سرعة نمو الخلايا، لوحة 150، 000 إلى 200، 000 الخلايا الليفية في بئرين من لوحة فيبروكتين الإنسان المغلفة ستة آبار. خلايا الاستزراع عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة أنسجة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪.في اليوم التالي للبذر ، تحقق من الخلايا الليفية تحت المجهر وتحقق من أن كثافة الخلية تتراوح بين 70 إلى 85٪ عبر بئر واحد مع جميع ناقلات الفيروسات الرجعية الأربعة: Oct3/4 ، Klf4 ، Sox2 ، و c-Myc. استخدام عدد كبير من العدوى من 10 للنمو السريع أو 15 للخلايا الليفية بطيئة النمو. يجب أن تتجاوز كفاءة النقل 70٪ أو أكثر من الخلايا الإيجابية لكل متجه.إضافة العادية الليفية المتوسطة إلى مزيج الفيروسية لحجم إجمالي قدره مليون واحد لكل بئر. اترك البئر الثاني دون علاج وأعيد الخلايا إلى حاضنة زراعة الأنسجة لاحتضانها بين عشية وضحاها. في اليوم التالي لاتحميل, غسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني وإضافة واحدة ميل وسائل الإعلام الليفية الطازجة.خلايا الاستزراع عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة أنسجة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. في اليوم التالي، وإعداد وسائل الإعلام التحويل كما هو مبين في الجدول الأول وغسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني للتخلص من وسائل الإعلام الليفية المتبقية، ثم إضافة ميل واحد من متوسط التحويل. تغيير وسائل الإعلام من البئر غير المعالجة لتحويل وسائل الإعلام أيضا.مراقبة الخلايا تحت المجهر ومشاهدة التغيرات في مورفولوجيا. وينبغي استبدال الوسائط الخلوية يوميا طوال عملية التحويل بوسائط تحويل واحدة إلى اثنتين وثقافة iNPC اللاحقة. تغيير الوسائط عن طريق إزالة الوسائط 70٪ بعناية من البئر مع التأكد من أن الخلايا تظل مغطاة في 30٪ المتبقية من الوسائط.الاستمرار في مراقبة الخلايا وتغيير وسائل الإعلام يوميا مع واحد إلى اثنين من ميل من وسائل الإعلام التحويل. بعد حوالي خمسة إلى ستة أيام في وسائط التحويل أو عندما تصبح الخلايا كثيفة جدا ، مرورها من واحد إلى اثنين أو كحد أقصى واحد إلى ثلاثة. الاحماء Accutase ومعطف عدد مناسب من الآبار في لوحة من ستة آبار مع واحد ميل مجموع فيبروكتين المخفف 1:200 في برنامج تلفزيوني لمدة 15 إلى 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.غسل الخلايا بعناية مع برنامج تلفزيوني دون فصل أي خلايا. استخدام جدار البئر لتطبيق برنامج تلفزيوني بلطف على الخلايا. إزالة برنامج تلفزيوني بعناية مع ماصة أو عن طريق التجسس.إضافة 500 ميكرولتر اكوتاز واحتضان 2-3 دقائق في 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة. تحقق تحت المجهر للتحقق من أن معظم الخلايا قد انفصلت. إذا كانت الخلايا قد حان قبالة، إضافة اثنين من ميل من وسائل الإعلام تحويل جديدة وماصة بلطف صعودا وهبوطا مرتين إلى ثلاث مرات إلى كتل ينفصم.جمع الخلايا في أنبوب 15 مل وإضافة وسائل الإعلام ثلاثة ميلس لمزيد من التخفيف من Accutase. جهاز طرد مركزي لمدة أربع دقائق في 200 G في درجة حرارة الغرفة. إزالة supernatant من بيليه الخلية وإعادة إنفاق الخلايا في ميل واحد من المتوسطة الطازجة.ماصة بلطف صعودا وهبوطا مرتين إلى ثلاث مرات لحل كتل الخلية. إزالة فيبروكتين من ست آبار المغلفة وإضافة وسائل الإعلام واحد ميل الطازجة إلى كل بئر على الفور. للحصول على نسبة انقسام 1:2، أضف 500 ميكرولتر من تعليق الخلية في بئر واحد والآخر 500 في بئر ثاني.توزيع الخلايا عن طريق هز بلطف البئر الستة في الاتجاه الشمالي الجنوبي الشرقي الغربي ووضع في حاضنة زراعة الأنسجة 37 درجة. مراقبة الخلايا تحت المجهر في اليوم التالي وتغيير وسائل الإعلام مع 1-2 ميل. تغيير الوسائط كل يوم حتى تصبح الخلايا جاهزة للانقسام مرة أخرى.إعداد وسائل الإعلام المجلس الوطني للصحافه التي تحتوي على FGF في زيادة التركيز دون EGF أو الهيبارين كما رأينا في الجدول الأول. في هذا الانقسام الجديد ، والبذور بئر واحد من الخلايا في وسائل الإعلام التحويل والآخر جيدا في وسائل الإعلام المجلس الوطني للصحافه. الحفاظ على تغيير وسائل الإعلام من الشخصيات الوطنية يوميا مع واحد إلى اثنين من ميل من وسائل الإعلام المجلس الوطني للصحافه.إعداد وسائل الإعلام الخلايا الفلكية وفقا للجدول الأول. لجعل الخلايا الفلكية من الشخصيات الجديدة، البذور iNPCs مباشرة في 10 ميل من وسائل الإعلام astrocyte في 10 سم فيبروكتين المغلفة لوحات بحيث تكون حوالي 10٪ التقاء في اليوم التالي. خلايا الاستزراع عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة أنسجة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪.تغيير المتوسطة مع 10 ميل من وسائل الإعلام astrocyte بعد ثلاثة أيام من الطلاء. الحفاظ على الخلايا التفريق لمدة خمسة إلى سبعة أيام. للبذور للتجريب، وتقسيم الخلايا الفلكية باستخدام تريبسين أو أكوتاسي كما هو موضح في الخطوة 2 إلى 2.6.يتم تضمين كثافات البذر الموصى بها في الجدول الثاني. توجد إرشادات حول كيفية تقسيم iNPCs لإنشاء الخلايا الفلكية المستحثة في الجدول الثالث. لجعل الخلايا الفلكية من مخزونات iNPC المجمدة، وإزالة ملف مخزون جزء من خزان النيتروجين السائل وتذوب بسرعة في 37 درجة مئوية.بمجرد أن يتم إذابة الخلايا، محلول الخلية ماصة في أنبوب 15 ميل تحتوي على خمسة ميل من وسائل الإعلام astrocyte. جهاز طرد مركزي لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة 200 غرام. إزالة supernatant وإعادة الإنفاق في واحد ميل المتوسطة astrocyte الطازجة.إضافة تسعة ميلس المتوسطة astrocyte الطازجة إلى طبق فيبروكتين المغلفة 10 سم وإضافة محلول واحد خلية ميل، وتوزيع الخلايا بلطف في حركة الشمال والجنوب الشرقي الغربي. خلايا الاستزراع عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة أنسجة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. يسمح هذا البروتوكول بالجيل السريع والسهل من الشخصيات غير المناهمة مباشرة من الخلايا الليفية الجلدية البشرية باستخدام الفيروسات الرجعية التي تحتوي على عوامل ياماناكا.تسمح هذه الطريقة بتجاوز حالة الخلايا الجذعية والحاجة إلى التحديد الكلوني ، وبالتالي تجنب الاختلاف اللاستنساخي. الخطوات الهامة التي يجب وضعها في الاعتبار أثناء خضوع الخلايا لعملية التحويل هي كثافة البذر في الخلايا الليفية ، و درجة الحموضة في الوسائط ، والحفاظ على الخلايا في التقاء أمثل. ويمكن الاطلاع على أمثلة على التغيرات المثلى في التقاء ومورفولوجيا أثناء عملية التحويل في الشكل الأول.بعد اكتمال عملية التحويل ، ستظهر الشخصيات التعبير المنخفض بقوة أو عدم وجود تعبير عن علامات الخلايا الليفية والمورفولوجيا والتعبير عن علامات الخلايا الخاصة بالمجلس الوطني للصحافه. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم لتوليد خطوط الخلايا المختلفة مثل الخلايا العصبية المستحثة، oligodendrocytes، والخلايا الفلكية. في تجربتنا، الخلايا الفلكية المستحثة على وجه الخصوص هي قيمة جدا لاختبار آلية المخدرات والمرض لأنها يمكن أن تتولد في مجموعات نقية بأعداد كبيرة قابلة للاستنساخ.يمكن تمييز الخلايا الفلكية المستحثة عن الشخصيات غير المتشحمية عن طريق أخذ aaliquot صغيرة من الخلايا أثناء تقسيم أو جزء iNPC المجمدة سابقا والطلاء مباشرة في وسائل الإعلام astrocyte. اعتبارات هامة خلال هذه العملية هي الحفاظ على كثافة البذر الأولية iNPCs منخفضة كما ثبت كثافة البذر عالية لعرقلة عملية التمايز، وإيلاء اهتمام إضافي لرقم الحموضة وسائل الإعلام كما التحمض يمكن تنشيط حتى الخلايا الفلكية صحية. باختصار، بروتوكول التحويل المباشر هو طريقة سريعة جدا لتكون قادرة على جعل خلايا السلف العصبية من عينات جلد المريض.وهذا يسمح لدراسة عدد أكبر من عينات الخلايا في نفس الوقت والنظر حقا في التنوع في سياق المرض. نشعر أن هذا هو المقايسة قوية جدا التي يمكنك استخدامها لجعل خلايا السلف العصبية، والخلايا العصبية، ولكن أيضا الخلايا الفلكية التي يمكن استخدامها بعد ذلك إما في الثقافة المشتركة أو من تلقاء نفسها لاختبار المخدرات أو الدراسات الميكانيكية كذلك.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

تعيش خلية التصوير الحسي للخلايا السليمة في الجهاز السلائف ذبابة الفاكهة شرانق

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

الفحص Neuroblast: والفحص للانشاء وإثراء خلايا متعلق بالخلايا العصبية السلف من التفريق العصبية الجذعية آله الخلية باستخدام التدفق الخلوي

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

السلف المستمدة من نظام الثقافة دبقية قليلة التغصن من دماغ الجنين البشري

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

خالية من التغذية اشتقاق الخلايا العصبية كريست السلف من افرة القوة البشرية الخلايا الجذعية

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

النمذجة الخلايا النجمية إمراض<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em&gt; استخدام القشرية النجمية أو الخلايا الجذعية العصبية من الشرطي، الفئران المهندسة وراثيا

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

الاشتقاق من الكبار الخلايا الليفية الإنسان والتحويل المباشر إلى داخل الخلايا العصبية للتوسيع السلف

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

الفروق بين الجنسين في ماوس الحصين النجمية بعد<em&gt; في المختبر</em&gt; نقص التروية

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

وضع نماذج لموت الخلايا العصبية وضمور في الخلايا العصبية الأولية الحبيبية للدماغ الماوس

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Lipidomics and Transcriptomics in Neurological Diseases

علم الشحوم وعلم النسخ في الأمراض العصبية

Lipids serve as the primary interface to brain insults or stimuli conducive to neurological diseases and are a reservoir for the synthesis of lipids with ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

تنقية الخلايا الليفية وخلايا شوان من الأعصاب الحسية والحركية في المختبر

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...