Name: in vitro modeling for neurological diseases using direct conversion from fibroblasts to neuronal progenitor cells and differentiation into astrocytes
Uploaded: 2021-06-10T13:45:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes at JoVE.

We danken alle patiënten en gezonde vrijwilligers voor het doneren van kritische monsters aan onderzoeken. Bovendien bedanken we Rochelle Rodrigo voor continue deskundige technische assistentie in weefselkweek en Laura Ferraiuolo voor het onafhankelijk bevestigen van de techniek in haar lab als medewerker. Dit werk ontving financiering van de Amerikaanse National Institutes of Health Grants R01 NS644912-4 en RC2 NS69476-01 (aan A.L.S.) en Packard Center for ALS Research Grant P2ALS en de Helping Link Foundation. K.M. ontving ook financiering van de Swiss National Science Foundation en de Young Investigator Development Award van de Muscular Dystrophy Association, The Rett Syndrome Research Trust en de Families of SCN2A-stichtingen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>media</td>
			<td>Reagens</td>
			<td>Te mengen hoeveelheid</td>
			<td>Eindconcentratie (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Fibroblast media</td>
			<td>DMEM, hoge glucose, GlutaMAX</td>
			<td>500 ml</td>
			<td>89</td>
		</tr>
<tr>
<td>Foetale Runderserum</td>
			<td>50 ml</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antibioticum-antimycoticum</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Basismedia</td>
			<td>DMEM/F12 + Glutamax</td>
			<td>500 ml</td>
			<td>97</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-2</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>B-27</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antibioticum-antimycoticum</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Conversiemedia</td>
			<td>Basismedia</td>
			<td>50 ml</td>
			<td>99.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>FGF</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>0,02 (20 ng/ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>EFG</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>0,02 (20 ng/ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Heparine</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>0,1 (5 μg/ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Neurale voorlopercel (NPC) Media</td>
			<td>DMEM/F12 + Glutamax</td>
			<td>500 ml</td>
			<td>96.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-2</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>B-27</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antibioticum-antimycoticum</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>FGF</td>
			<td>10 uL</td>
			<td>0.002</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Astrocyte Media</td>
			<td>DMEM, hoge glucose, GlutaMAX</td>
			<td>500 ml</td>
			<td>89</td>
		</tr>
<tr>
<td>Foetale Runderserum</td>
			<td>50 ml</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antibioticum-antimycoticum</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-2</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Media moeten worden gefilterd na het mengen van alle componenten. Conversiemedia (met factoren) moeten elke week vers worden bereid.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Mediarecepten voor alle celtypen die in het protocol zijn opgenomen. Media moeten worden gefilterd na het mengen van alle componenten met een steriel vacuümfiltratiesysteem voor grote volumes of spuit- en 0,2 um spuitfilters. Conversiemedia (met factoren) moeten elke week vers worden bereid.
1. Directe omzetting van volwassen menselijke fibroblasten in neuronale voorlopercellen
OPMERKING: Een schematische tijdlijn van dit protocol kan worden bekeken in Meyer (2014)19.
<ol><li>Gebruik primaire menselijke huidfibroblasten die kunnen worden verkregen uit celbanken of huidbiopten31. Kweekcellen bij 37 °C in een CO2 weefselkweek incubator van 5%. Passagecellen voor ten minste 1-2 passages na ontdooiing voorafgaand aan gebruik in het experiment. Zodra de cellen klaar zijn, bedek een put van een 6-put plaat met menselijke fibronectine (1:200 verdund in PBS) op kamertemperatuur gedurende 15-20 minuten.</li>
	<li>Wanneer de cellen klaar zijn om te worden geplateerd, verwijdert u de fibronectine uit de schaal en voegt u onmiddellijk celoplossing of 2 ml fibroblastmedia (tabel 1) toe - laat de schaal niet uitdrogen voordat u media toevoegt. Afhankelijk van hoe snel de cellen groeien, plaat 150.000 (snelgroeiende) - 200.000 (langzaam groeiende) fibroblasten in twee putten van een menselijke fibronectine gecoate 6-put plaat elk. OPMERKING: De cellen moeten ongeveer 70% samenvloeien voor virale transductie om ze na transductie nog enkele dagen in dezelfde plaat te kunnen houden. Het kan nuttig zijn om bij twee verschillende dichtheden te zaaien om de volgende dag een keuze te hebben voor conversie.</li>
	<li>Controleer de dag na het zaaien de fibroblasten onder de microscoop en controleer de celdichtheid (tussen 70-85%) en zelfs zaaien door de put voor optimale resultaten.</li>
	<li>Transduceer één put met alle vier retrovirale vectoren (Oct3/4, Klf4, Sox2 en c-Myc) - gebruik een multipliciteit van infectie (MOI) van 10 voor snelgroeiende of 15 voor langzaam groeiende fibroblasten (transductie-efficiëntie moet meer dan 70% of meer positieve cellen voor elke vector bedragen). Voeg regelmatig fibroblastmedium toe aan virale mix tot een totaal volume van 1 ml per put en incubeer 's nachts bij 37 °C in een co-incubator met 5% CO 2-weefselkweek. Laat de tweede goed onbehandeld en breng cellen terug naar weefselkweek incubator. OPMERKING: Retrovirale vectoren kunnen worden gekocht door een leverancier of in eigen huis worden gemaakt, protocollen zijn online beschikbaar32.</li>
	<li>De dag na transductie, was cellen 1x met PBS en voeg 1 ml vers fibroblastmedium toe.</li>
	<li>Verander de volgende dag van medium naar conversiemedium. Was cellen 1x met PBS om van het resterende fibroblastmedium af te komen en voeg vervolgens 1 ml conversiemedium toe. Verander de media van de onbehandelde put ook in conversiemedia. OPMERKING: Sommige morfologische veranderingen kunnen zelfs worden waargenomen door de media op de fibroblasten te veranderen die geen retrovirale vectorbehandeling hebben ontvangen, dus het hebben van een onbehandelde put (optioneel) zal nuttig zijn bij het bepalen van de effecten van de virale vectoren. Cellen moeten 2-4 dagen na het overschakelen naar conversiemedia beginnen met het veranderen van morfologie.</li>
	<li>Observeer cellen onder de microscoop en let op veranderingen in de morfologie (figuur 1). Celmedia moeten dagelijks worden vervangen tijdens het conversieproces (1-2 ml conversiemedia, tabel 1)en voor de daaropvolgende iNPC-cultuur. Verander het medium door voorzichtig 70% van het medium uit de put te verwijderen en ervoor te zorgen dat de cellen bedekt blijven met de resterende 30% van de media. OPMERKING: Media met groeifactoren erin moeten binnen 1 week na de voorbereiding worden geconsumeerd.<ol>
<li>Blijf cellen observeren en verander dagelijks van medium (1-2 ml conversiemedia).</li>
		<li>Sommige cellijnen beginnen losse verhoogde ronde formaties te vormen die groeien in balachtige structuren of losse neuronale bollen (Aanvullende figuur 1 en 19,33). Zorg ervoor dat u deze cellen niet losmaakt. Als de ballen losraken, kunnen ze worden verzameld en opnieuw worden geplateerd in een nieuwe fibronectine gecoat goed van een 6-well plaat. OPMERKING: Als ze op zichzelf worden uitgebreid, hebben de cellen een verminderde diversiteit in vergelijking met de beginplaat en kunnen ze een duidelijk andere cellijn vertegenwoordigen. We raden aan om deze cellen te combineren met de rest van de geconverteerde cellen bij de volgende splitsingsronde.</li>
	</ol></li>
	<li>Na ongeveer 5-6 dagen in conversiemedia (tot 12 dagen voor moeilijke cellijnen) of wanneer cellen erg dicht worden, doorloop ze 1:2 of maximaal 1:3. OPMERKING: Het is erg belangrijk om de cellen gedurende het hele conversieproces op een hoge dichtheid te houden.</li>
</ol>2. Conversie- en iNPC-splitsingsprocedure
<ol><li>Warm de oplossing voor celloslating op (bijv. Accutase) en bekleed een geschikt aantal putten van een 6-put met fibronectine (1:200 in PBS, 1 ml coatingvolume) gedurende 15-20 minuten bij kamertemperatuur. Fibronectine coating kan langer zijn zonder negatieve impact, maar zorg ervoor dat de coatingtijd niet wordt verkort.</li>
	<li>Was cellen zorgvuldig met PBS zonder cellen los te maken (gebruik de wand van de put om PBS voorzichtig op de cellen aan te brengen). Verwijder PBS voorzichtig met pipetten of door aspiratie.</li>
	<li>Voeg 0,5 ml celloslatingsoplossing toe en incubeer 2-3 minuten bij 37 °C in een weefselkweek-incubator. Controleer onder de microscoop of de meeste cellen zijn losgeraakt. Als alle cellen zijn losgekomen, voeg dan 2 ml verse conversiemedia toe en pipetteer voorzichtig 2-3 keer op en neer om klonten te dissocieren (indien nodig).</li>
	<li>Verzamel de cellen in een buis van 15 ml en voeg extra 3 ml media toe om de celloslatingsoplossing verder te verdunnen. Was de put eerst met de extra media om er zeker van te zijn dat alle cellen zijn verzameld.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 4 min bij 200 x g bij kamertemperatuur. OPMERKING: Het converteren van cellen of iNPC's is uiterst gevoelig voor de aanwezigheid van celloslatingsoplossing in de media. Het is absoluut noodzakelijk om het resterende enzym te verwijderen door centrifugeren en terugtrekken van supernatant.</li>
	<li>Verwijder supernatant uit celpellets en resuspendeer de cellen in 1 ml vers medium. Pipetteer voorzichtig 2-3 keer op en neer om celklompen op te lossen. Verwijder fibronectine uit gecoate 6-putten en voeg onmiddellijk 1 ml verse media toe aan elke put (laat fibronectine niet drogen). Voeg voor een split ratio van 1:2 0,5 ml van de celsuspensie toe in de ene put en de andere 0,5 ml in een tweede put.<ol>
<li>Kweekcellen bij 37 °C in een weefselkweek-incubator.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verdeel de cellen door de 6-put voorzichtig te schudden in noord-zuidoost-west richting (niet circulair) en zet in weefselkweek incubator.</li>
	<li>Observeer de cellen de volgende dag onder de microscoop en verander van medium (1-2 ml). Verander elke dag van medium totdat de cellen klaar zijn om opnieuw te worden gesplitst. OPMERKING: Op dit punt moet de celproliferatie beginnen te versnellen en moeten cellen binnen 2-3 dagen klaar zijn voor een tweede splitsing (4 dagen voor zeer langzaam groeiende lijnen).<ol>
<li>Bij deze nieuwe splitsing zaait u één put cellen in conversiemedia en de andere put in NPC-media die alleen FGF bevatten bij verhoogde concentratie zonder EFG/heparine (tabel 1). OPMERKING: Sommige cellijnen bereiken na ongeveer 10 dagen een stagnerende status in conversiemedia en overschakelen naar NPC-media kan helpen bij celgroei. Bovendien hebben NPC's een specifiekere, kleinere vorm, wanneer ze worden gekweekt in NPC-media19. Op dit moment zijn de iNPC's klaar voor differentiatie en verder gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Blijf dagelijks van medium (1-2 ml) van de iNPC's wisselen.<ol>
<li>Breid NPC's uit tot gerechten van 10 cm door twee of drie samenvloeiende putten van een 6-put te combineren. Het mediavolume voor schotels van 10 cm is meestal 12-15 ml.</li>
		<li>Bij de volgende splitsing breiden we deze cellen verder uit tot drie of vier schotels van 10 cm (12-15 ml media) voor generaties van grote aantallen celvoorraden. 10 cm gerechten worden meestal verdeeld om 1:3 of 1:4 elke 3-4 dagen, afhankelijk van de proliferatiesnelheid.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Genereren van geïnduceerde astrocyten uit NPC's
<ol><li>Om astrocyten te maken van verse iNPC's, zaaien iNPC's (in 10 cm fibronectine gecoate platen) direct in 10 ml astrocyt medium (Tabel 1) zodat ze de volgende dag ongeveer 10% samenvloeien. Kweekcellen bij 37 °C in een CO2 weefselkweek incubator van 5%. OPMERKING: De aanbevolen zaaidichtheid is meestal 50 μL van de celresuspensie van een schaal van 10 cm NPC's, op voorwaarde dat ze worden verdund tot een eindvolume op basis van hun splitverhouding (bijv. 3 ml voor een 1:3-splitsing, 4 ml voor een 1:4-splitsing, enz.).</li>
	<li>Verander medium (10 ml astrocytmedia) van de iAs drie dagen na plating. Houd de cellen onderscheidend voor 5-7 dagen. OPMERKING: IA's verdragen niet meerdere passages goed, daarom is het beter om verse astrocyten te maken elke keer dat u de NPC's splitst.</li>
	<li>Om te zaaien voor experimenten, splits de astrocyten met trypsine of celloslatingsoplossing zoals beschreven in stap 2.1-2.7. Aanbevolen zaaidichtheden zijn opgenomen in tabel 2.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Plaattype</td>
			<td>Astrocyten per put</td>
		</tr>
<tr>
<td>384-goed</td>
			<td>2500</td>
		</tr>
<tr>
<td>96-goed</td>
			<td>10000</td>
		</tr>
<tr>
<td>24-goed</td>
			<td>40000</td>
		</tr>
<tr>
<td>6-goed</td>
			<td>150000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2. Aanbevolen zaaidichtheid van iA's per plaatoppervlak. Typisch aantal iA's gezaaid om een monolaag te genereren op de meest voorkomende weefselkweekplaten.
4. Het bereiden en ontdooien van porties voor astrocytdifferentiatie ten opzichte van bevroren NPC-bestanden (alternatief voor stap 3)
OPMERKING: Als alternatief voor het behoud van iNPC's in cultuur, kunnen astrocyten ook rechtstreeks uit een bevroren stam worden geproduceerd. Om dit te doen, worden de iNPC's in kleinere porties ingevroren. Tabel 3 toont de voorgestelde vries- en ontdooivolumes voor porties die moeten worden ontdooid in een schaal van 10 cm met 10 ml Astrocyte-media.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Portiegrootte</td>
			<td>Celsuspensie (μL)</td>
			<td>Invriesmedia (μL)</td>
			<td>Totaal volume (μL)</td>
			<td>Ontdooit in</td>
		</tr>
<tr>
<td>4x</td>
			<td>400</td>
			<td>400</td>
			<td>800</td>
			<td>Twee schotels van 10 cm</td>
		</tr>
<tr>
<td>2x</td>
			<td>200</td>
			<td>200</td>
			<td>400</td>
			<td>Een schaal van 10 cm</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3. Instructies voor het portioneren van iNPC om iA's te genereren. Aandeel iNPC-suspensie- en vriesmedia om porties te genereren. Merk op dat de uiteindelijke DMSO-concentratie 10% is wanneer celsuspensie wordt gemengd met vriesmedia.
<ol><li>Om astrocyten uit bevroren iNPC-voorraden te maken, verwijdert u de portieflacon uit de opslagtank voor vloeibare stikstof en ontdooit u snel bij 37 °C. Zodra cellen zijn ontdooid, pipetceloplossing in een buis van 15 ml met 5 ml astrocytmedia.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 4 min bij 200 x g en kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspend in 1 ml vers astrocytmedium.</li>
	<li>Voeg 9 ml vers astrocytmedium toe aan een met fibronectine bedekte schaal van 10 cm en voeg 1 ml celoplossing toe. Voorzichtig cellen verdelen in noord-zuid-oost-west beweging. Kweekcellen bij 37 °C in een CO2 weefselkweek incubator van 5%.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Leenaars, C. H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+to+human+translation:+a+systematic+scoping+review+of+reported+concordance+rates.">Animal to human translation: a systematic scoping review of reported concordance rates.</a> Journal of Translational Medicine. 17 (1), 223 (2019).</li><li>Rhrissorrakrai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+limits+of+animal+models+as+predictors+of+human+biology:+lessons+learned+from+the+sbv+IMPROVER+Species+Translation+Challenge.">Understanding the limits of animal models as predictors of human biology: lessons learned from the sbv IMPROVER Species Translation Challenge.</a> Bioinformatics. 31 (4), 471-483 (2015).</li><li>Hartung, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thoughts+on+limitations+of+animal+models.">Thoughts on limitations of animal models.</a> Parkinsonism &amp; Related Disorders. 14, 81-83 (2008).</li><li>Ladewig, J., Koch, P., Brustle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveling+Waddington:+the+emergence+of+direct+programming+and+the+loss+of+cell+fate+hierarchies.">Leveling Waddington: the emergence of direct programming and the loss of cell fate hierarchies.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (4), 225-236 (2013).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Hamada, M., Malureanu, L. A., Wijshake, T., Zhou, W., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+to+pluripotency+can+conceal+somatic+cell+chromosomal+instability.">Reprogramming to pluripotency can conceal somatic cell chromosomal instability.</a> PLoS Genetics. 8 (8), 1002913 (2012).</li><li>Stricker, S. H., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+neural+lineage+elaboration:+Implications+for+therapeutic+reprogramming.">Epigenetic regulation of neural lineage elaboration: Implications for therapeutic reprogramming.</a> Neurobiology of Disease. 148, 105174 (2020).</li><li>Tang, Y., Liu, M. L., Zang, T., Zhang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Reprogramming+Rather+than+iPSC-Based+Reprogramming+Maintains+Aging+Hallmarks+in+Human+Motor+Neurons.">Direct Reprogramming Rather than iPSC-Based Reprogramming Maintains Aging Hallmarks in Human Motor Neurons.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 359 (2017).</li><li>Kelaini, S., Cochrane, A., Margariti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+adult+cells:+avoiding+the+pluripotent+state.">Direct reprogramming of adult cells: avoiding the pluripotent state.</a> Stem Cells Cloning. 7, 19-29 (2014).</li><li>Kim, E., Tae, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+and+biomaterials+for+controlling+cell+fate.">Direct reprogramming and biomaterials for controlling cell fate.</a> Biomaterials Research. 20, 39 (2016).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+mouse+fibroblasts+to+neural+progenitors.">Direct reprogramming of mouse fibroblasts to neural progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7838-7843 (2011).</li><li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+dermal+fibroblasts+into+neural+progenitor+cells+by+a+novel+cocktail+of+defined+factors.">Direct conversion of dermal fibroblasts into neural progenitor cells by a novel cocktail of defined factors.</a> Current Molecular Medicine. 12 (2), 126-137 (2012).</li><li>Mertens, J., Marchetto, M. C., Bardy, C., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+cell+reprogramming,+differentiation+and+conversion+technologies+in+neuroscience.">Evaluating cell reprogramming, differentiation and conversion technologies in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (7), 424-437 (2016).</li><li>Kim, J., Ambasudhan, R., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming+to+neural+cells.">Direct lineage reprogramming to neural cells.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (5), 778-784 (2012).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li><li>Ambasudhan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+adult+human+fibroblasts+to+functional+neurons+under+defined+conditions.">Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions.</a> Cell Stem Cell. 9 (2), 113-118 (2011).</li><li>Kogiso, T., Nagahara, H., Otsuka, M., Shiratori, K., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdifferentiation+of+human+fibroblasts+into+hepatocyte-like+cells+by+defined+transcriptional+factors.">Transdifferentiation of human fibroblasts into hepatocyte-like cells by defined transcriptional factors.</a> Hepatology International. 7 (3), 937-944 (2013).</li><li>Grath, A., Dai, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cell+reprogramming+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine.">Direct cell reprogramming for tissue engineering and regenerative medicine.</a> Journal of Biological Engineering. 13, 14 (2019).</li><li>Meyer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+patient+fibroblasts+demonstrates+non-cell+autonomous+toxicity+of+astrocytes+to+motor+neurons+in+familial+and+sporadic+ALS.">Direct conversion of patient fibroblasts demonstrates non-cell autonomous toxicity of astrocytes to motor neurons in familial and sporadic ALS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (2), 829-832 (2014).</li><li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Reprogramming+to+Human+Induced+Neuronal+Progenitors+from+Fibroblasts+of+Familial+and+Sporadic+Parkinson's+Disease+Patients.">Direct Reprogramming to Human Induced Neuronal Progenitors from Fibroblasts of Familial and Sporadic Parkinson's Disease Patients.</a> International Journal of Stem Cells. 12 (3), 474-483 (2019).</li><li>Meyer, K., Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia-neuron+interactions+in+neurological+diseases:+Testing+non-cell+autonomy+in+a+dish.">Glia-neuron interactions in neurological diseases: Testing non-cell autonomy in a dish.</a> Brain Research. 1656, 27-39 (2017).</li><li>Verkhratsky, A., Parpura, V., Pekna, M., Pekny, M., Sofroniew, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+in+the+pathogenesis+of+neurodegenerative+diseases.">Glia in the pathogenesis of neurodegenerative diseases.</a> Biochemical Society Transactions. 42 (5), 1291-1301 (2014).</li><li>Ettle, B., Schlachetzki, J. C. M., Winkler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+and+Myelin+in+Neurodegenerative+Diseases:+More+Than+Just+Bystanders.">Oligodendroglia and Myelin in Neurodegenerative Diseases: More Than Just Bystanders.</a> Molecular Neurobiology. 53 (5), 3046-3062 (2016).</li><li>Ferraiuolo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocytes+contribute+to+motor+neuron+death+in+ALS+via+SOD1-dependent+mechanism.">Oligodendrocytes contribute to motor neuron death in ALS via SOD1-dependent mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (42), 6496-6505 (2016).</li><li>Palpagama, T. H., Waldvogel, H. J., Faull, R. L. M., Kwakowsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Microglia+and+Astrocytes+in+Huntington's+Disease.">The Role of Microglia and Astrocytes in Huntington's Disease.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 258 (2019).</li><li>Maezawa, I., Swanberg, S., Harvey, D., LaSalle, J. M., Jin, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome+astrocytes+are+abnormal+and+spread+MeCP2+deficiency+through+gap+junctions.">Rett syndrome astrocytes are abnormal and spread MeCP2 deficiency through gap junctions.</a> Journal of Neuroscience. 29 (16), 5051-5061 (2009).</li><li>Hautbergue, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRSF1-dependent+nuclear+export+inhibition+of+C9ORF72+repeat+transcripts+prevents+neurodegeneration+and+associated+motor+deficits.">SRSF1-dependent nuclear export inhibition of C9ORF72 repeat transcripts prevents neurodegeneration and associated motor deficits.</a> Nature Communications. 8, 16063 (2017).</li><li>Almad, A., Maragakis, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stocked+toolbox+for+understanding+the+role+of+astrocytes+in+disease.">A stocked toolbox for understanding the role of astrocytes in disease.</a> Nature Reviews Neurology. 14 (6), 351-362 (2018).</li><li>Gatto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directly+converted+astrocytes+retain+the+ageing+features+of+the+donor+fibroblasts+and+elucidate+the+astrocytic+contribution+to+human+CNS+health+and+disease.">Directly converted astrocytes retain the ageing features of the donor fibroblasts and elucidate the astrocytic contribution to human CNS health and disease.</a> Aging Cell. , (2020).</li><li>Caiazzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+fibroblasts+into+functional+astrocytes+by+defined+transcription+factors.">Direct conversion of fibroblasts into functional astrocytes by defined transcription factors.</a> Stem Cell Reports. 4 (1), 25-36 (2015).</li><li>Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+punch+biopsy+explant+culture+for+derivation+of+primary+human+fibroblasts.">Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e3779 (2013).</li><li>Pear, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+methods+for+preparation+of+high-titer+retroviral+supernatants.">Transient transfection methods for preparation of high-titer retroviral supernatants.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 11 (2001).</li><li>Boczonadi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+glycyl-tRNA+synthetase+impair+mitochondrial+metabolism+in+neurons.">Mutations in glycyl-tRNA synthetase impair mitochondrial metabolism in neurons.</a> Human Molecular Genetics. 27 (12), 2187-2204 (2018).</li><li>Rinaldi, F., Motti, D., Ferraiuolo, L., Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+analysis+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">High content analysis in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 80, 180-191 (2017).</li></ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Kortom, de directe conversie is een snelle en eenvoudige methode om geïnduceerde neuronale voorlopercellen te genereren uit huidfibblasten van patiënten. Deze methode is voordelig vanwege de snelheid en het grote aantal gegenereerde cellen die gemakkelijk te onderhouden zijn. Bovendien suggereert toenemend bewijs dat directe herprogrammeringsmethoden minder epigenetische tekens verwijderen in vergelijking met klassieke iPSC-herprogrammeringstechnologie, waardoor het ziektemilieu intacter blijft4,7,8. De differentiatie van iNPC 's ten nadep aan astrocyten is zeer eenvoudig en zeer reproduceerbaar , zelfs tussen meerdere onafhankelijke laboratoria19,29,33. iNPC's kunnen in kleine porties worden ingevroren en direct worden ontdooid voor differentiatiedoeleinden, wat helpt de variatie tussen experimenten te verminderen, omdat passagenummers vergelijkbaar kunnen worden gehouden. Astrocyten spelen een cruciale rol in de progressie van ziekten bij veel neurologische ziekten en zijn daarom een interessant celtype om mee te werken. De astrocyten kunnen worden gebruikt voor mechanistische studies, metabolische studies of drug testen assays en worden meestal gekweekt als monolagen. Bovendien kunnen astrocyten worden gecombineerd in co-kweeksystemen met muis- of menselijke neuronen om de impact van astrocyten op neuronale overleving en morfologie te beoordelen, die beide goede uitlezingen zijn voor het testen van geneesmiddelen34.
Om dit protocol met succes te kunnen gebruiken, moeten een paar punten en mogelijke beperkingen in gedachten worden gehouden. De menselijke huidfibroblasten variëren bijvoorbeeld sterk in hun celdelingssnelheid en reactie op virale vectoren. Omdat dit geen gestandaardiseerde cellijnen zijn, zijn ze net zo variabel als de mensheid zelf, elke lijn is anders. Zoals voor veel herprogrammeringsmethoden, is het gemakkelijker om fibroblasten te herprogrammeren die een matige tot snelle celdelingssnelheid hebben ten opzichte van cellen die nauwelijks repliceren. De replicatiesnelheid kan worden beïnvloed door de kwaliteit van de huidbiopsie en de verwerking zelf, door het passagenummer van de fibroblasten en de behandeling. Bij het werken met primaire huidfibroblasten is het belangrijk om de cellen niet te dicht te laten worden om inductie van senescentie te voorkomen. Als de fibroblasten niet goed groeien, is het het beste om een nieuw bestand of een lagere passage te proberen, hoewel in sommige gevallen de ziekte zelf ook een rol kan spelen. Celdeling kan soms worden verbeterd door 15% of 20% FBS in de fibroblastmedia te gebruiken in vergelijking met de standaard 10%.
De kwaliteit van de herprogrammering van virale vectoren is van groot belang voor succes. In onze handen waren retrovirale vectoren efficiënter in vergelijking met lentivirale vectoren of andere niet-integrerende virussen; dit kan echter afhankelijk zijn van de virale vectorkwaliteit en zuiverheid. Commerciële retrovirale vectorkits specificeren meestal de virale vectorconcentratie en vaak ook een veelheid aan infecties voor een bepaalde cellijn. Het is belangrijk om in gedachten te houden dat primaire fibroblasten verschillen van de cellijn die door de bedrijven wordt gebruikt om de virale vectoropname te bepalen. Bovendien is, zelfs bij het bestellen van dezelfde commerciële kit, variatie tussen batches gebruikelijk. Bovendien varieert de opname van virale vectoren ook tussen fibroblastcellijnen. Sommige lijnen kunnen gevoeliger zijn en daarom kunnen getransduceerde cellen afsterven, terwijl andere cellijnen mogelijk beter bestand zijn tegen virale opname. Het bepalen van de transductie-efficiëntie voor een bepaalde cellijn kan dus belangrijk zijn, vooral als de cellijn langzaam groeit of eerdere conversiepogingen zijn mislukt. In onze handen is de beste manier om te evalueren hoeveel van een specifieke retrovirale vector nodig is voor conversie, het uitvoeren van een immunofluorescente kleuring met verschillende verdunningen van de virale vector. Het aantal cellen dat het transgene voor elke vector uitdrukt, kan vervolgens worden geteld, met als doel een transductie-efficiëntie van 70% of hoger. Onze ervaring is dat vergelijkbare MOIs voor de meeste cellijnen kunnen worden gebruikt, maar de MOI kan indien nodig worden aangepast.
Tijdens het conversieproces is het van cruciaal belang om de cellen niet te vroeg te splitsen. De tijd tot de cellen klaar zijn om te worden gesplitst, hangt af van meerdere factoren, waaronder de primaire cellijn en de kenmerken ervan, de kwaliteit van de gebruikte virale vector en de mediakwaliteit. Belangrijk is dat het slagingspercentage van de conversie veel hoger is wanneer de cellen op hoge dichtheid worden gehouden. Zelfs als de cellen de morfologie beginnen te veranderen, is het beter om de cellen in de eerste put langer te laten dan ze voortijdig te splitsen. Als de splitsing te vroeg plaatsvindt, kan de conversie stoppen in de voortgang en de cellen ertoe brengen om terug te differentiëren naar fibroblastachtige vorm en gedrag. Bovendien kan het te vroeg verdunnen ervan resulteren in meer langwerpige cellichamen in vergelijking met de kleine en compacte cellichamen van de EERDER waargenomen NPC's. De eerste splitsingen moeten dus altijd conservatief zijn; het is beter om de cellen te dicht te houden met een 1:1 of 1:2 split in vergelijking met het te veel verdunnen. Enige celdood wordt verwacht na de eerste splitsing. Let op, de cellen zien er altijd slechter (vlakker) uit de eerste dag na het splitsen, wat normaal is. De beste oordelen over de celvorm moeten 2-3 dagen later worden gemaakt. Belangrijk is dat ook de kwaliteit van de groeifactoren en mediacomponenten cruciaal is. Het is belangrijk om kleine hoeveelheden media met groeifactoren voor te bereiden, zodat de volledig voorbereide media maximaal 5-7 dagen worden gebruikt. Bewaar het medium niet langer op kamertemperatuur of 37°C. Snel gebruiken en in de koelkast bewaren zodra de mediawissel is uitgevoerd. Bovendien kan het laag houden van het mediavolume bij 1 ml in plaats van 2 ml helpen, vooral voor cellijnen die beter bestand zijn tegen conversie. Als de cellen de media snel consumeren, wat kan worden waargenomen door een verandering in mediakleur van rood naar geel (verzuringssnelheid), past u het volume van de media aan tot 2 ml. Snelle mediaconsumptie is een positief teken en wordt vaak waargenomen in latere stadia van conversie naast een toegenomen proliferatie.
NPC's zijn ook erg gevoelig voor de aanwezigheid van accutase in de media en het is erg belangrijk om de incubatietijd van de accutase kort te houden. We raden een incubatietijd van 2-4 minuten aan, controleer cellen vaak onder de microscoop om te zien wanneer ze zijn losgeraakt. Het is essentieel om de cellen na het splitsen te centrifugeren om de enzymmix uit de media te verwijderen. Het is ook belangrijk om het passagenummer in gedachten te houden, omdat cellijnen kunnen veranderen bij uitgebreide cultivering, wat leidt tot wijziging van expressieprofielen. Het is dus belangrijk om veel celvoorraden in vroege passages te bevriezen. Cellen moeten worden ingevroren in 10% DMSO en 90% NPC-media en op lange termijn worden opgeslagen in vloeibare stikstof. Vanwege het gebrek aan serum in dit medium is het van cruciaal belang om te zorgen voor een langzame bevriezing met behulp van vrieskamers en eenmaal 's nachts bevroren, onmiddellijk over te brengen naar vloeibare stikstof. Hoewel er in dit protocol geen klonale selectie wordt uitgevoerd, is het mogelijk dat uitgebreide cultivering en passaging leidt tot natuurlijke selectie van een initiële celpopulatie met gunstige groei en overlevingskans. Daarom is het belangrijk om het passagenummer en de behandeling in gedachten te houden bij het uitvoeren van experimenten. We geven er de voorkeur aan om lagere passages te gebruiken voor experimenten, indien mogelijk overschrijden we de doorlaatlijn van de cellijnen niet meer dan 20 keer. Omdat NPC's snel groeien, kunnen grote aantallen voorraden worden bevroren bij lagere passages voor experimenten. Cellijnen met bijzonder hoge groeisnelheden lopen een hoger risico op mediaverzuring. Naarmate cellijnen met verschillende snelheid groeien, moet de hoeveelheid media mogelijk worden aangepast op basis van proliferatie. Als de cellen continu in sterk verzuurde media worden achtergelaten, kan dit de gezondheid van zowel controle- als ziektecellijnen beïnvloeden. Dit zorgt ervoor dat zelfs gezonde astrocyten reactief worden, wat het gebruik ervan in verdere differentiatie en experimenten beïnvloedt.
Voor astrocytdifferentiatie is het belangrijk om de cellen op een lage dichtheid te houden, omdat een hoge dichtheid voorkomt dat de cellen differentiëren en ze zich met hogere snelheden blijven verspreiden. De zaaidichtheid moet dus worden aangepast voor elke cellijn, afhankelijk van hun proliferatiesnelheid. We raden aan om verschillende zaaidichtheden te proberen en kleuringen / RT-PCR uit te voeren met astrocytmarkers om een goede differentiatie te garanderen. De kwaliteit van de IAs kan worden beoordeeld naast gezonde controles met behulp van co-cultuurtesten met neuronen. Op voorwaarde dat ziektepathologie niet leidt tot een reactief fenotype, moeten neuronen gedurende meerdere dagen levensvatbaar blijven in contact met IA's. Astrocytmorfologie kan sterk variëren tussen individuele cellijnen en kan ook worden beïnvloed door het ziektefenotype. Bovendien kunnen ze bij ziekten waarbij astrocyten zwaar worden beïnvloed, een reactief fenotype vertonen met grote, langwerpige extensies.

Het begrijpen van onderliggende ziektemechanismen is van cruciaal belang voor neurologische ziekten, omdat het helpt bij de ontwikkeling van potentiële therapeutische strategieën. Hoewel diermodellen van oudsher de gouden standaard zijn voor het onderzoeken van ziekten van het zenuwstelsel , toont de directe vertaling van potentiële therapieën naar een klinische setting vaak beperkt succes1,2,3. Redenen voor het gebrek aan vertaling zijn gebrek aan variabiliteit van genetische achtergrond en mutaties bij muizen, onvolledige weergave van ziektefenotypes en variatie in medicijngevoeligheid of dosering bij menselijke patiënten die niet goed worden afgebeeld in ingeteelde muisstammen. Bovendien zijn er voor veel zeldzame neurologische aandoeningen geen of weinig diermodellen beschikbaar. Het direct bestuderen van ziektemechanismen in relevante menselijke celtypen kan onderzoek vergemakkelijken en de vertaling naar de kliniek verbeteren. Voor CZS-aandoeningen zijn primaire menselijke cellen moeilijk op te halen en vertegenwoordigen ze een zeer beperkte bron, omdat biopsieën invasief zijn of alleen postmortem kunnen worden opgehaald in het eindstadium van de ziekte. In de afgelopen 15 jaar heeft de ontwikkeling van cellulaire herprogrammeringstechnologie het vermogen om menselijke neurologische en neurodegeneratieve ziekten in vitro te modelleren snel uitgebreid.
Traditionele methoden voor celherprogrammering omvatten het herprogrammeren van fibroblasten of andere celtypen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) die zich kunnen onderscheiden in celtypen uit alle drie de kiemlagen4. Takahashi en Yamanaka waren de eersten die aantoonden dat reexpressie van vier stamceltranscriptiefactoren voldoende is om somatische cellen om te leiden tot iPSC's5. iPSC's kunnen vervolgens verder worden gedifferentieerd in specifieke celtypen. Het nadeel van dit proces is echter dat het arbeidsintensief en tijdrovend is om stabiele stamcelklonen te genereren en te isoleren. Somatische mutaties of specifieke afwijkingen van de moedercel worden ook gehandhaafd in de stamcelkloon en kunnen de resultaten van het onderzoekbeïnvloeden 6. Bovendien suggereert toenemend bewijs dat het herprogrammeringsproces naar stamcellen waardevolle epigenetische veranderingen wist die de mechanismen voor cellulaire ziekten kunnen beïnvloeden4,7,8. In de afgelopen jaren richtten onderzoekers zich op aangepaste herprogrammeringsmethoden die een directere generatie van verschillende celtypen mogelijk maakten en tegelijkertijd de pluripotente stamceltoestand9,10,11,12 (beoordeeld in 13,14) omzeilden. Eerste doorbraken onthulden in vitro combinatorische herprogrammering van fibroblasten naar cardiomyocyten15, neuronen16 en hepatocyten17 door ectopische expressie van meervoudige afstammingsspecifieke transcriptiefactoren of microRNAs18. Dit werd gevolgd door studies die cellen direct herprogrammeren om neurologische aandoeningen te modelleren19,20. Zoals hierboven vermeld, hebben dergelijke directe herprogrammerings- of conversieprotocollen potentiële voordelen ten opzichte van klassieke iPSC-protocollen, waaronder snelheid en de ablatie van de klonale isolatiestap. Bovendien wijst het bewijs erop dat deze protocollen het mogelijk maken een grotere hoeveelheid epigenetische informatie met betrekking tot de leeftijd van de patiënt te behouden en waarschijnlijk geldt hetzelfde voor ziekterelevante markers7,8.
Tot op heden is het meeste in vitro onderzoek naar neurologische aandoeningen voornamelijk gericht op neuronen. Het is echter bekend dat andere celtypen zoals astrocyten, microglia en oligodendrocyten een cruciale rol spelen bij ziektepathologie en progressie van neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer (AD), Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS), de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Huntington (HD), Multiple Sclerose (MS) en andere neurologische pathologieën zoals rettsyndroom (RTT), slaapstoornissen,verslaving,epilepsie, lysosomaleaandoeningen Astrocyten zijn het meest voorkomende celtype in het centrale zenuwstelsel (CZS) en tot voor kort werden ze in grote lijnen verwaarloosd vanuit een pathologisch oogpunt7. Het is nu bekend dat ze een cruciale rol spelen bij het ondersteunen van bijna alle homeostatische functies van het gezonde CZS. Bovendien is het duidelijk dat ze een belangrijke pathologische impact hebben en zeer waardevol zijn bij het begrijpen van het ziektemechanisme en het evalueren van therapeutische strategieën19.
In de huidige beschrijving beschrijven we een protocol voor directe omzetting van fibroblasten van menselijke patiënten in geïnduceerde neuronale voorlopercellen (iNPC's) met behulp van retrovirale vectoren die de Yamanaka-herprogrammeringsfactoren uitdrukken (Klf4, Oct3/4, Sox2 en c-Myc) en daaropvolgende blootstelling aan neuraliserende media. Eerdere studies hebben verschillende combinaties van transcriptiefactoren gebruikt voor directe herprogrammering naar neurale cellen (herzien in 14), maar de factoren die in het beschreven protocol worden gebruikt, zijn algemeen beschikbaar als plasmiden voor de interne productie van virale vectoren, of als commercieel beschikbare kant-en-klare virale herprogrammeringskits. De resulterende iNPC's kunnen verder worden gedifferentieerd in geïnduceerde neuronen (iN's)27, oligodendrocyten (iOs)24 en astrocyten (iAS)19 om hun rol bij neurologische ziekten te bestuderen. Ons protocol omvat geen tijdrovende generatie iPSC's die de meeste beschikbare protocollen gebruiken voor afleiding van menselijke astrocyten28. Ongeveer 98% tot 100% van de direct geherprogrammeerde iNPC's kan differentiëren in GFAP-positieve astrocyten29 in vergelijking met slechts 2% met behulp van directe conversiemethode van fibroblasten naar astrocyten30. Onlangs heeft een vergelijkende transcriptomische studie met behulp van onze beschreven herprogrammeringsmethode aangetoond dat iNPC's geherprogrammeerd uit donorfibroblasten verouderingskenmerken kunnen behouden op transcriptie- en functioneel niveau vergelijkbaar met leeftijdsgematchte postmortale astrocyten en primaire astrocyten29. Dit conversieprotocol is dus een krachtig hulpmiddel om ziektemechanismen te onderzoeken en nieuwe therapeutische benaderingen voor leeftijdsgebonden neurodegeneratieve en neurologische aandoeningen te evalueren.
Hier beschrijven we het protocol dat wordt gebruikt om iNPC's te genereren en verdere differentiatie in iA's, die het meest geschikt zijn voor kleinschalige kleinschalige moleculaire screeningstesten. Ziektemechanismen en medicijntests met iA's kunnen worden gedaan met behulp van verschillende methodologieën, zoals coculturen met neuronen of metabole en biochemische analyse. Het voordeel van dit systeem is de snelheid en het gemak van onderhoud van deze cellijnen in vergelijking met iPSC's. Bovendien kunnen iNPC's in kleine porties worden ingevroren voor iAs-differentiatie, wat het testen van geneesmiddelen onder constante omstandigheden gedurende langere tijd vergemakkelijkt. Over het algemeen wordt vergelijking van grotere steekproefaantallen mogelijk op deze manier, wat de deur opent om het therapeutische potentieel van verbindingen in een grotere en representatievere patiëntenpopulatie te evalueren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100mm x 2mm Style dish, Cell culture treated, Nonpyrogenic</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td>Tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical screw cap centrifuge tubes, copolymer polypropylene</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1475-1611</td>
			<td>Used for lifting and centrifuge cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1500-1811</td>
			<td>Media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Antibiotic with antifungal activity for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27&#160; Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504044</td>
			<td>For NPC and base media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials&#160; 1.2ML</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430658-500EA</td>
			<td>For freezing cell stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX&#160; Supplement, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>For fibroblast and Astrocyte media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX&#160; supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565042</td>
			<td>For NPC and base media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438-50ML</td>
			<td>For freezing cell stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190136</td>
			<td>Referred in protocol as PBS. For fibronectin dilution and cell wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ Retrovirus iPSC Reprogramming Kit</td>
			<td>ALSTEM</td>
			<td>RF101</td>
			<td>Retrovirus containing the Yamanaka factors. Virus can also be made in-house.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-036</td>
			<td>Referred in protocol as FBS . For Fibroblast and Astrocyte media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-461</td>
			<td>Filter media (50mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149-10KU</td>
			<td>Referred in protocol as Heparin. Used in conversion media. Powder diluted in ultrapure water. Final stock concentration of 5000X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FC010-10MG</td>
			<td>Referred in protocol as Fibronectin, used in 1:200 dilution for coating.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (technical grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25372A</td>
			<td>For freezing cell stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>For freezing cell stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>For Astrocyte, NPC and base media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Referred in protocol as EGF, used in conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Referred in protocol as FGF, used in NPC and conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Referred in protocol as Accutase. Used for lifting during the conversion process and NPCs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2GPU05RE</td>
			<td>Media filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 6 well, Flat bottom with Low evaporation lid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td>Tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300062</td>
			<td>Lifting of Fibroblasts and Astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Puradisc 25 syringe filters, 0.2 &#956;m, PES sterile</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>80-2502</td>
			<td>Filter media (50mL)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro modeling for neurological diseases using direct conversion from fibroblasts to neuronal progenitor cells and differentiation into astrocytes

Onderzoek naar neurologische aandoeningen richt zich vooral op de impact van neuronen op ziektemechanismen. Beperkte beschikbaarheid van diermodellen heeft ernstige gevolgen voor de studie van celtypespecifieke bijdragen aan ziekten. Bovendien weerspiegelen diermodellen meestal geen variabiliteit in mutaties en ziektecursussen die bij menselijke patiënten worden waargenomen. Herprogrammeringsmethoden voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) hebben een revolutie teweeggebracht in patiëntspecifiek onderzoek en waardevolle instrumenten gecreëerd voor het bestuderen van ziektemechanismen. IPSC-technologie heeft echter nadelen zoals tijd, arbeidsbetrokkenheid, clonal selectiviteit en verlies van epigenetische markers. Recente wijzigingen van deze methoden maken het mogelijk om directer cellijnen of specifieke celtypen te genereren, waarbij klonale isolatie of een pluripotente stamceltoestand worden omzeild. We hebben een snelle directe conversiemethode ontwikkeld om geïnduceerde neuronale voorlopercellen (iNPC's) te genereren uit huidfibroblasten met behulp van retrovirale vectoren in combinatie met neuraliserende media. De iNPC's kunnen worden onderscheiden in neuronen (iN's) oligodendrocyten (iOs) en astrocyten (iA's). IAs-productie vergemakkelijkt snelle testen van geneesmiddelen en ziektemechanismen, omdat differentiatie van iNPC's slechts 5 dagen duurt. Bovendien zijn iA's gemakkelijk om mee te werken en worden ze in grote aantallen gegenereerd in zuivere populaties. We ontwikkelden een zeer reproduceerbare co-cultuurtest met behulp van muis GFP + neuronen en patiënt afgeleide iA's om potentiële therapeutische strategieën voor tal van neurologische en neurodegeneratieve aandoeningen te evalueren. Belangrijk is dat de iA-assays schaalbaar zijn tot 384-well formaat, wat de evaluatie van meerdere kleine moleculen in één plaat vergemakkelijkt. Deze aanpak maakt gelijktijdige therapeutische evaluatie van meerdere patiëntcellijnen met verschillende genetische achtergrond mogelijk. Eenvoudige productie en opslag van iA's en capaciteit om meerdere verbindingen in één test te screenen, maakt deze methodologie aanpasbaar voor gepersonaliseerde geneeskunde.

Dit protocol maakt het mogelijk om iNPC's rechtstreeks rechtstreeks van menselijke huidfibrose te genereren met behulp van retrovirussen die de Yamanaka-factoren bevatten. Deze methode maakt het mogelijk om de stamceltoestand en de behoefte aan klonale selectie te omzeilen, waardoor klonale variatie wordt vermeden. Belangrijke stappen om in gedachten te houden tijdens het conversieproces zijn de fibroblast zaaidichtheid, media pH en het houden van de cellen op een optimale samenvloeiing. Voorbeelden van optimale splitsingsconfluentie - en morfologische veranderingen tijdens het conversieproces zijn te vinden in figuur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62016/62016fig01.jpg"> Figuur 1. Representatieve beelden van het conversieproces na toevoeging van de retrovirale mix van Yamanaka-factoren. Fibroblasten werden vierentwintig uur later gezaaid en getransduceerd met Yamanaka-factoren. Twee dagen na virus (DPV), media werd gewijzigd in conversiemedia. Cellen werden gekweekt in conversiemedia totdat ze klaar waren om door te gaan (13 DPV). Cellen werden na passage gezaaid om de volgende dag 80% samenvloeiing te bereiken (14 DPV). Latere passages handhaafden deze dichtheid totdat neuronale voorlopercellen zich snel beginnen te delen. Schaalbalk is 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62016/62016fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
Nadat het conversieproces is voltooid, vertonen de NPC's sterk verminderde expressie of geen expressie van fibroblastmarkers en morfologie, en drukken ze NPC-specifieke celmarkers uit (Figuur 2). Bovendien kunnen ze ook worden gebruikt voor het genereren van verschillende cellijnen, zoals iN's, iOs en iA's.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62016/62016fig02.jpg"> Figuur 2. Cellen die het conversieproces ondergaan, drukken celspecifieke markeringen uit. Patiëntfibroblasten (A), geïnduceerde neuronale voorlopercellen (iNPC's (B) en geïnduceerde Astrocyten (iAs (C) cellen werden gezaaid op glazen afdeklips in een 24 goed weefselkweek behandelde plaat. Cellen werden geïmmuneerd voor: fibroblastspecifieke celmarkers (A), Vimentine (groen) en TE7 (rood), iNPC-specifieke celmarker (B), Nestine (rood) en iAs-celmarker (C) GFAP (paars) en iNPC-marker Nestin (groen). De schaalbalk is 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62016/62016fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
Onze ervaring is dat met name IA's zeer waardevol zijn voor het testen van geneesmiddelen en ziektemechanismen, omdat ze kunnen worden gegenereerd in zuivere populaties (98% of meer GFAP-positieve cellen29) bij reproduceerbare grote aantallen. iA's kunnen worden onderscheiden van iNPC's door een klein aantal cellen te nemen tijdens het splitsen of een eerder bevroren iNPC-gedeelte en direct te plateren in astrocytmedia. Belangrijke overwegingen tijdens dit proces zijn het laag houden van de initiële zaaidichtheid van de iNPC's (figuur 3 en figuur 4), omdat is aangetoond dat een hoge dichtheid het differentiatieproces belemmert (figuur 4) en extra aandacht besteedt aan de media pH, omdat verzuring zelfs gezonde astrocyten kan activeren.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62016/62016fig03.jpg"> Figuur 3. Representatieve beelden van het iA-generatieproces van iNPC's. iNPC's worden gezaaid in Astrocyte media (tabel 1) met een lage seeding density. Een goede zaaidichtheid is ongeveer 10% op de eerste dag na het zaaien (DPS) (links); deze dichtheid kan echter worden aangepast aan de groeisnelheid van cellen. Typische iAs morfologie kan worden waargenomen na 5 DPS (midden). In sommige gevallen kan afwijkende astrocytmorfologie worden waargenomen, met lange, stekelige extensies. Deze verandering is indicatief voor astrocytactivatie en kan secundair zijn aan ziektetoestand of onjuiste cultiveringstechnieken (rechts). Schaalbalk is 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62016/62016fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62016/62016fig04.jpg"> Figuur 4. iNPC-zaaidichtheid beïnvloedt de differentiatie-efficiëntie van de iAs. Controle-iNPC-lijnen werden gezaaid met een lage (A) en hoge (B) dichtheid in Astrocyte-media om effecten van zaaidichtheid op differentiatie aan te tonen. 5 DPS, de lagedichtheidslijn uitgedrukte astrocytspecifieke markers, terwijl de high-density lijn een mengsel van iNPC- en iAs-markers met een gemarkeerde iNPC-achtige morfologie toont. De schaalbalk is 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62016/62016fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
Aanvullend figuur 1. Aanvullende cijfers van het conversieproces na toevoeging van de retrovirale mix van Yamanaka-factoren. Afbeeldingen van het conversieproces bij 12 DPV (1 dag voor passage) en 19 DPV (6 dagen na passage). Let op het verschil op morfologie tussen cellen voor en na passage, bij 12 DPV hebben cellen een balachtige structuurmorfologie. Na een passage en enkele dagen op conversiemedia (tabel 1) beginnen cellen een NPC-achtige morfologie weer te geven. De schaalbalk is 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62016/Supplemental%201.%20Additional%20Images%20Conversion.tif" target="_blank">Klik hier om dit Bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes at JoVE.

In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes

We beschrijven een protocol om menselijke huid-afgeleide fibroblasten te herprogrammeren in geïnduceerde Neuronal Progenitor Cells (iNPC's), en hun daaropvolgende differentiatie in geïnduceerde Astrocyten (iA's). Deze methode leidt tot een snelle en reproduceerbare generatie van iNPC's en iA's in grote hoeveelheden.

In vitro modellering voor neurologische ziekten met behulp van directe conversie van fibroblasten naar neuronale voorlopercellen en differentiatie in astrocyten

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely ...

We gebruiken dit protocol om neurale voorlopercellen te maken van huidfibroblasten van patiënten en neurologische en neurodegeneratieve ziekten te bestuderen. We hebben het gevoel dat dit protocol veel voordelen heeft ten opzichte van klassieke IPS-technologie, waaronder de snelheid, maar in bepaalde gevallen ook een ernstiger ziektefenotype krijgt. We bestuderen neurologische en neurodegeneratieve ziekten en met behulp van huidmonsters kunnen we ook de diversiteit van de patiënten echt evalueren.Mijn lab is vooral geïnteresseerd in de rol van astrocyten bij ziekten en we gebruiken de astrocyten die we maken van de NPC's om medicijnen te testen en ook om ziektemechanismen te bestuderen, maar ook in co-culturen met menselijke en muisneuronen. We hopen dat dit protocol informatief zal zijn en neem contact op als u vragen heeft. Bedankt.Gebruik primaire menselijke huidfibroblasten die kunnen worden verkregen uit celbanken of huidbiopten. Kweekcellen bij 37 graden Celsius in een co2-weefselkweek-incubator van 5%. Passagecellen voor ten minste één tot twee passages na ontdooiing voorafgaand aan gebruik in het experiment.Zodra de cellen klaar zijn, bekleedt u een put van een zes-put plaat met menselijke fibronectine in een concentratie van 1:200 verdund in PBS bij kamertemperatuur gedurende 15 tot 20 minuten. Bereid fibroblastmedia voor zoals weergegeven in tabel één. Wanneer de cellen klaar zijn om te worden geplateerd, verwijdert u de fibronectine uit de schaal en voegt u onmiddellijk celoplossing of twee mils fibroblastmedia toe.Laat de schaal niet uitdrogen voordat u media toevoegt. Afhankelijk van hoe snel de cellen groeien, plaat 150, 000 tot 200, 000 fibroblasten in twee putten van een menselijke fibronectine-gecoate zes-put plaat. Kweekcellen bij 37 graden Celsius in een co2-weefselkweek-incubator van 5%.Controleer de dag na het zaaien de fibroblasten onder de microscoop en controleer of de celdichtheid tussen 70 en 85% ligt Transduceer één put met alle vier retrovirale vectoren: Oct3/4, Klf4, Sox2 en c-Myc. Gebruik een veelvoud aan infecties van 10 voor snelgroeiende of 15 voor langzaam groeiende fibroblasten. De transductie-efficiëntie moet meer dan 70% of meer positieve cellen voor elke vector bedragen.Voeg regelmatig fibroblastmedium toe aan virale mix voor een totaal volume van één mil per put. Laat de tweede goed onbehandeld en breng cellen terug naar de weefselkweek-incubator om 's nachts te incuberen. De dag na transductie, was cellen een keer met PBS en voeg een mil verse fibroblast media.Kweekcellen bij 37 graden Celsius in een co2-weefselkweek-incubator van 5%. Bereid de volgende dag conversiemedia voor zoals weergegeven in tabel één en was cellen één keer met PBS om de resterende fibroblastmedia te verwijderen en voeg vervolgens een mil conversiemedium toe. Verander de media van de onbehandelde put ook in conversiemedia.Observeer cellen onder de microscoop en let op veranderingen in de morfologie. Celmedia moeten dagelijks tijdens het conversieproces worden vervangen door één tot twee miljoen conversiemedia en voor de daaropvolgende iNPC-cultuur. Verander media door voorzichtig 70% media uit de put te verwijderen en ervoor te zorgen dat de cellen bedekt blijven met de resterende 30% van de media.Blijf de cellen observeren en verander dagelijks van medium met één tot twee miljoen conversiemedia. Na ongeveer vijf tot zes dagen in conversiemedia of wanneer cellen erg dicht worden, breng je ze één tot twee of maximaal één tot drie door. Warm Accutase op en bedek een geschikt aantal putten in een plaat met zes putten met één mil totaal fibronectine verdund 1:200 in PBS gedurende 15 tot 20 minuten bij kamertemperatuur.Was cellen zorgvuldig met PBS zonder cellen los te maken. Gebruik de wand van de put om PBS voorzichtig op de cellen aan te brengen. Verwijder PBS voorzichtig met pipetten of door te aspireren.Voeg 500 microliters Accutase toe en incubeer twee tot drie minuten bij 37 graden Celsius in een weefselkweek-incubator. Controleer onder de microscoop of de meeste cellen zijn losgeraakt. Als cellen zijn losgekomen, voeg dan twee mils verse conversiemedia toe en pipetteer voorzichtig twee tot drie keer op en neer om klonten te dissocieren.Verzamel de cellen in een buis van 15 mil en voeg drie mils media toe om de Accutase verder te verdunnen. Centrifugeer gedurende vier minuten bij 200 G bij kamertemperatuur. Verwijder supernatant uit de celkorrel en resuspend de cellen in een mil van vers medium.Pipetteer twee tot drie keer zachtjes op en neer om celklompen op te lossen. Verwijder fibronectine uit gecoate zes putten en voeg onmiddellijk een mil verse media toe aan elke put. Voeg voor een split ratio van 1:2 500 microliters van de celsuspensie toe in de ene put en de andere 500 in een tweede put.Verdeel de cellen door de zes goed voorzichtig in noord-zuid oost-west richting te schudden en in 37 graden weefselkweek incubator te plaatsen. Observeer de cellen de volgende dag onder de microscoop en verander media met één tot twee mils. Verander elke dag van medium totdat de cellen weer kunnen worden gesplitst.Bereid NPC-media voor die FGF bevatten in verhoogde concentratie zonder EFG of heparine, zoals te zien is in tabel één. Bij deze nieuwe splitsing zaait u een put met cellen in conversiemedia en de andere goed in NPC-media. Blijf dagelijks van media van iNPC's veranderen met één tot twee miljoen NPC-media.Bereid astrocytmedia voor volgens tabel één. Om astrocyten te maken van verse iNPC's, zaai iNPC's rechtstreeks in 10 mils astrocyt media in 10 centimeter fibronectine-gecoate platen zodat ze de volgende dag ongeveer 10% samenvloeien. Kweekcellen bij 37 graden Celsius in een co2-weefselkweek-incubator van 5%.Verander medium met 10 mils astrocyt media drie dagen na plating. Laat de cellen vijf tot zeven dagen differentiëren. Om te zaaien voor experimenten, splits de astrocyten met trypsine of Accutase zoals beschreven in stap 2 tot en met 2.6.Aanbevolen zaaidichtheden zijn opgenomen in tabel twee. Instructies voor het portioneren van iNPC's om geïnduceerde astrocyten te genereren bevinden zich in tabel drie. Om astrocyten uit bevroren iNPC-voorraden te maken, verwijdert u het voorraadbestand van de portie uit de opslagtank voor vloeibare stikstof en ontdooit u snel bij 37 graden Celsius.Zodra cellen zijn ontdooid, pipetceloplossing in een buis van 15 mil met vijf mils astrocytmedia. Centrifugeer gedurende vier minuten op kamertemperatuur van 200 G. Verwijder supernatant en resuspend in een mil verse astrocyt medium.Voeg negen mils verse astrocyt medium toe aan een met fibronectine bedekte schaal van 10 centimeter en voeg een mil celoplossing toe, waarbij cellen voorzichtig worden verdeeld in noord-zuidoost-west beweging. Kweekcellen bij 37 graden Celsius in een co2-weefselkweek-incubator van 5%. Dit protocol maakt het mogelijk om iNPC's rechtstreeks rechtstreeks van menselijke huidfibrose te genereren met behulp van retrovirussen die de Yamanaka-factoren bevatten.Deze methode maakt het mogelijk om de stamceltoestand en de behoefte aan klonale selectie te omzeilen, waardoor klonale variatie wordt vermeden. Belangrijke stappen om in gedachten te houden tijdens het conversieproces zijn de fibroblast zaaidichtheid, media pH en het houden van de cellen op een optimale samenvloeiing. Voorbeelden van optimale confluency- en morfologische veranderingen tijdens het conversieproces zijn te vinden in figuur één.Nadat het conversieproces is voltooid, vertonen de NPC's sterk verminderde expressie of geen expressie van fibroblastmarkers en morfologie en drukken ze NPC-specifieke celmarkers uit. Bovendien kunnen ze ook worden gebruikt voor het genereren van verschillende cellijnen zoals geïnduceerde neuronen, oligodendrocyten en astrocyten. Onze ervaring is dat geïnduceerde astrocyten in het bijzonder zeer waardevol zijn voor het testen van geneesmiddelen en ziektemechanismen, omdat ze in zuivere populaties in reproduceerbare grote aantallen kunnen worden gegenereerd.Geïnduceerde astrocyten kunnen worden onderscheiden van iNPC's door een klein aantal cellen te nemen tijdens het splitsen of een eerder bevroren iNPC-gedeelte en direct te plateren in astrocytmedia. Belangrijke overwegingen tijdens dit proces zijn het handhaven van de initiële zaaidichtheid van de iNPC's, omdat is aangetoond dat een hoge seedingdichtheid het differentiatieproces belemmert, en extra aandacht besteden aan de media-pH omdat verzuring zelfs gezonde astrocyten kan activeren. Kortom, het directe conversieprotocol is een zeer snelle methode om neurale voorlopercellen te kunnen maken van huidmonsters van patiënten.Dit maakt het mogelijk om een groter aantal celmonsters tegelijkertijd te bestuderen en echt te kijken naar diversiteit in de ziektecontext. We vinden dit een zeer sterke test die je kunt gebruiken om neurale voorlopercellen, neuronen, maar ook astrocyten te maken die vervolgens kunnen worden gebruikt in co-cultuur of alleen voor drugstests of mechanistische studies.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging van zintuig voorloper cellen in Intact Drosophila Poppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

De Neuroblast test: een test voor de generatie en de verrijking van Neuronale stamcellen uit Onderscheidende factor voor neurale stamcellen Nakomelingen met behulp van flowcytometrie

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Progenitor afgeleide oligodendrocyt Cultuur System van menselijke foetale hersenen

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Voedingsvrije Afleiding van neurale stamcellen uit humane pluripotente stamcellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modeling Astrocytoom Pathogenese<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em&gt; Met behulp van corticale Astrocyten of neurale stamcellen uit Conditional, genetisch gemanipuleerde muizen

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Afleiding van volwassen menselijke fibroblasten en hun directe omzetting in Expandable Neural Progenitor Cellen

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Sex Verschillen in Mouse hippocampus Astrocytes na<em&gt; In-vitro</em&gt; Ischemie

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modelleren van neuronale dood en degeneratie in muis primaire cerebellaire submodule neuronen

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Lipidomics and Transcriptomics in Neurological Diseases

Lipidomics en Transcriptomics bij neurologische aandoeningen

Lipids serve as the primary interface to brain insults or stimuli conducive to neurological diseases and are a reservoir for the synthesis of lipids with ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

Zuivering van fibroblasten en Schwann cellen van sensorische en motorische zenuwen in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...