Name: in vitro modeling for neurological diseases using direct conversion from fibroblasts to neuronal progenitor cells and differentiation into astrocytes
Uploaded: 2021-06-10T13:45:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes at JoVE.

Araştırma çalışmalarına kritik örnekler bağışlayan tüm hastalara ve sağlıklı gönüllülere teşekkür ederiz. Ayrıca, rochelle Rodrigo'ya doku kültüründe sürekli uzman teknik yardımı için ve Laura Ferraiuolo'ya laboratuvardaki tekniği bağımsız olarak onay verdiği için teşekkür ederiz. Bu çalışma, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri R01 NS644912-4 ve RC2 NS69476-01 (A.L.S.'ye) ve Packard Center for ALS Research Grant P2ALS ve Helping Link Foundation'dan fon aldı. K.M. ayrıca İsviçre Ulusal Bilim Vakfı'nın yanı sıra Kas Distrofisi Derneği, Rett Sendromu Araştırma Vakfı ve SCN2A vakıflarının Ailelerinden Genç Araştırmacı Geliştirme Ödülü'nden fon aldı.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>medya</td>
			<td>reaktif</td>
			<td>Karıştırılacak tutar</td>
			<td>Son konsantrasyon (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Fibroblast medya</td>
			<td>DMEM, yüksek glikoz, GlutaMAX</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>89</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fetal Sığır Serumu</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antibiyotik-Antimykotik</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Temel ortam</td>
			<td>DMEM/F12 + Glutamax</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>97</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-2</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>B-27</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antibiyotik-Antimykotik</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Dönüşüm ortamı</td>
			<td>Temel ortam</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>99.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>FGF</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>0,02 (20 ng/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>0,02 (20 ng/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Heparin</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>0,1 (5 μg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Nöral Progenitör Hücre (NPC) Ortamı</td>
			<td>DMEM/F12 + Glutamax</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>96.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-2</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>B-27</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antibiyotik-Antimykotik</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>FGF</td>
			<td>10 uL</td>
			<td>0.002</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Astrosit Medya</td>
			<td>DMEM, yüksek glikoz, GlutaMAX</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>89</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fetal Sığır Serumu</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antibiyotik-Antimykotik</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-2</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Tüm bileşenler karıştırıldıktan sonra ortam filtrelenmelidir. Dönüşüm ortamı (faktörlerle) her hafta taze olarak hazırlanmalıdır.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. Protokolde yer alan tüm hücre türleri için ortam tarifleri. Tüm bileşenler büyük hacimler veya şırınna ve 0,2 um şırındıcı filtreler için steril vakum filtrasyon sistemi ile karıştırıldıktan sonra ortam filtrelenmelidir. Dönüşüm ortamı (faktörlerle) her hafta taze olarak hazırlanmalıdır.
1. Yetişkin insan fibroblastlarının nöronal progenitör hücrelere doğrudan dönüştürülmesi
NOT: Bu protokolün şematik zaman çizelgesi Meyer (2014)19'da gözden geçirilebilir.
<ol><li>Hücre bankalarından veya cilt biyopsilerinden elde edilebilen birincil insan derisi fibroblastlarını kullanın31. %5 CO2 doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de kültür hücreleri. Deneyde kullanılmadan önce çözülme sonrası en az 1-2 pasaj için pasaj hücreleri. Hücreler hazır olduğunda, oda sıcaklığında 15-20 dakika boyunca insan fibronektin (PBS'de seyreltilmiş 1:200) ile 6 kuyulu bir plakanın kuyusunu kaplayın.</li>
	<li>Hücreler kaplanmaya hazır olduğunda, fibronektin kabından çıkarın ve hemen hücre çözeltisi veya 2 mL fibroblast ortamı ekleyin (Tablo 1) - ortam eklemeden önce yemeğin kurumasına izin vermeyin. Hücrelerin ne kadar hızlı büyüdüğüne bağlı olarak, her biri 6 kuyulu bir insan fibronektin kaplı iki kuyuda 150.000 (hızlı büyüyen) - 200.000 (yavaş büyüyen) fibroblast. NOT: Viral transdüksiyonun transdüksiyondan sonra birkaç gün daha aynı tabakta tutabilmesi için hücreler yaklaşık% 70 birikmelidir. Dönüşüm için ertesi gün bir seçim yapmak için iki farklı yoğunlukta tohumlamak faydalı olabilir.</li>
	<li>Tohumlamadan sonraki gün, mikroskop altındaki fibroblastları kontrol edin ve hücre yoğunluğunu doğrulayın (%70-85 arasında) ve hatta optimum sonuçlar için kuyu boyunca tohumlama.</li>
	<li>Dört retroviral vektörle de (Eki3/4, Klf4, Sox2 ve c-Myc) bir kuyu çevirin - hızlı büyüme için 10 veya yavaş büyüyen fibroblastlar için 15 çokluk bir enfeksiyon (MOI) kullanın (transdüksiyon verimliliği her vektör için% 70 veya daha fazla pozitif hücreyi aşmalıdır). Kuyu başına toplam 1 mL hacme düzenli fibroblast orta ila viral karışım ekleyin ve % 5 CO2 doku kültürü inkübatöründe bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın. İkinci iyi tedavi edilmemiş bırakın ve doku kültürü inkübatörüne hücreleri döndürün. NOT: Retroviral vektörler bir satıcı tarafından satın alınabilir veya şirket içinde yapılabilir, protokoller çevrimiçi olarak kullanılabilir32.</li>
	<li>Transdüksiyondan sonraki gün, hücreleri PBS ile 1x yıkayın ve 1 mL taze fibroblast ortamı ekleyin.</li>
	<li>Ertesi gün, ortamı dönüştürme ortamına değiştirin. Artık fibroblast ortamından kurtulmak için hücreleri PBS ile 1x yıkayın ve ardından 1 mL dönüştürme ortamı ekleyin. Tedavi edilmeyen kuyunun medyasını da dönüştürme ortamı olarak değiştirin. NOT: Retroviral vektör tedavisi almayan fibroblastlar üzerindeki ortam değiştirilerek bile bazı morfolojik değişiklikler gözlenebilir, bu nedenle viral vektörlerin etkilerini belirlerken tedavi edilmemiş bir kuyuya (isteğe bağlı) sahip olmak yardımcı olacaktır. Hücreler dönüşüm ortamına geçtikten 2-4 gün sonra morfolojiyi değiştirmeye başlamalıdır.</li>
	<li>Mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyin ve morfolojideki değişiklikleri izleyin (Şekil 1). Hücre ortamı, dönüştürme işlemi boyunca (1-2 mL dönüştürme ortamı, Tablo 1)ve sonraki iNPC kültürü için günlük olarak değiştirilmelidir. Hücrelerin ortamın kalan %30'unda kapalı kalmasını sağlarken ortamın %70'ini kuyudan dikkatlice çıkararak ortamı değiştirin. NOT: İçinde büyüme faktörleri olan medyanın hazırlık aşamasından sonraki 1 hafta içinde tüketilmesi gerekir.<ol>
<li>Hücreleri gözlemlemeye ve medyayı günlük olarak değiştirmeye devam edin (1-2 mL dönüştürme ortamı).</li>
		<li>Bazı hücre hatları, yapılar veya gevşek nöronal küreler gibi toplarda büyüyen gevşek yüksek yuvarlak oluşumlar oluşturmaya başlar(Ek Şekil 1 ve 19,33). Bu hücreleri ayırmamaya dikkat edin. Toplar ayrılırsa, 6 kuyulu bir plakanın iyi kaplanmış yeni bir fibronektin içinde toplanabilir ve yeniden kaplanabilir. NOT: Kendi başlarına genişletilirse, hücreler ilk plakaya göre daha az çeşitliliğe sahip olacaktır ve belirgin bir şekilde farklı bir hücre hattını temsil edebilir. Bu hücreleri bir sonraki bölme turunda dönüştürülen hücrelerin geri kalanıyla birleştirmenizi öneririz.</li>
	</ol></li>
	<li>Dönüşüm medyasında yaklaşık 5-6 gün sonra (zor hücre hatları için 12 güne kadar) veya hücreler çok yoğun hale geldiğinde, onları 1:2 veya maksimum 1:3'e geçirmek. NOT: Dönüştürme işlemi boyunca hücreleri yüksek yoğunlukta tutmak çok önemlidir.</li>
</ol>2. Dönüştürme ve iNPC bölme prosedürü
<ol><li>Hücre müfreze çözeltisini (örneğin, Accutase) ısıtın ve oda sıcaklığında 15-20 dakika boyunca fibronektin (PBS'de 1:200, 1 mL kaplama hacmi) ile uygun sayıda 6 kuyuyu kaplayın. Fibronektin kaplama olumsuz etki olmadan daha uzun olabilir, ancak kaplama süresini kısaltmamaya dikkat edilmelidir.</li>
	<li>Hücreleri herhangi bir hücreyi ayırmadan PBS ile dikkatlice yıkayın (PBS'yi hücrelere hafifçe uygulamak için kuyunun duvarını kullanın). PBS'yi pipetlerle veya aspirasyonla dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>0,5 mL hücre dekupment çözeltisi ekleyin ve bir doku kültürü inkübatörüne 37 °C'de 2-3 dk kuluçkaya yatırın. Çoğu hücrenin ayrıldığını doğrulamak için mikroskop altında kontrol edin. Tüm hücreler çıktıysa, 2 mL taze dönüştürme ortamı ekleyin ve kümeleri ayrıştırmak için (gerekirse) 2-3 kez yavaşça yukarı ve aşağı pipet ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve hücre ayırma çözeltisini daha da seyreltmek için ek 3 mL ortam ekleyin. Tüm hücrelerin toplandığından emin olmak için kuyuyu önce ekstra medya ile yıkayın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 200 x g'da 4 dakika santrifüj. NOT: Hücreleri veya iNPC'leri dönüştürmek, medyada hücre ayırma çözümünün varlığına karşı son derece hassastır. Artık enzimin santrifüjlenmesi ve süpernatantın çekilmesi ile çıkarılması kesinlikle gereklidir.</li>
	<li>Hücre peletinden süpernatant çıkarın ve hücreleri 1 mL taze ortamda yeniden biriktirin. Hücre kümelerini çözmek için 2-3 kez yavaşça yukarı ve aşağı pipet. Fibronektin kaplamalı 6-kuyulardan çıkarın ve hemen her kuyuya 1 mL taze ortam ekleyin (fibronektin kurumasına izin vermeyin). 1:2'lik bir bölünme oranı için, bir kuyuya 0,5 mL, ikinci bir kuyuya da 0,5 mL hücre süspansiyonu ekleyin.<ol>
<li>Doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de kültür hücreleri.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücreleri, 6 kuyuyu kuzey-güney-doğu-batı yönünde (dairesel değil) hafifçe sallayarak dağıtın ve doku kültürü inkübatörüne koyun.</li>
	<li>Ertesi gün mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyin ve ortamı değiştirin (1-2 mL). Hücreler yeniden bölünmeye hazır olana kadar her gün ortam değiştirin. NOT: Bu noktada hücre çoğalması hızlanmaya başlamalı ve hücreler 2-3 gün içinde ikinci bir bölünmeye hazır olmalıdır (çok yavaş büyüyen hatlar için 4 gün).<ol>
<li>Bu yeni bölmede, dönüşüm medyasındaki hücrelerin bir kuyusunun tohumunun, diğerinin ise EGF / heparin olmadan artan konsantrasyonda sadece FGF içeren NPC medyasında tohum (Tablo 1). NOT: Bazı hücre hatları yaklaşık 10 gün sonra dönüştürme medyasında durgun bir duruma ulaşır ve NPC ortamına geçmek hücre büyümesine yardımcı olabilir. Ek olarak, NPC'ler NPC medyasında yetiştirildiğinde daha spesifik, daha küçük bir şekle sahiptir19. Bu noktada, iNPC'ler farklılaşmaya ve daha fazla kullanıma hazırdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>iNPC'lerin medyasını (1-2 mL) günlük olarak değiştirmeye devam edin.<ol>
<li>6 kuyunun iki veya üç birleştirilmiş kuyularını birleştirerek NPC'leri 10 cm'lik yemeklere genişletin. 10 cm'lik yemekler için ortam hacmi tipik olarak 12-15 mL'dir.</li>
		<li>Bir sonraki bölmede, bu hücreleri çok sayıda hücre stokunun nesilleri için üç veya dört adet 10 cm'lik yemeklere (12-15 mL ortam) daha da genişletin. 10 cm'lik yemekler genellikle çoğalma oranına bağlı olarak her 3-4 günde bir 1:3 veya 1:4'te bölünür.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. NPC'lerden indüklenmiş astrositler oluşturma
<ol><li>Taze iNPC'lerden astrosit yapmak için, tohum iNPC'leri (10 cm fibronektin kaplı plakalarda) doğrudan 10 mL astrosit ortamında (Tablo 1) ertesi gün yaklaşık% 10 izdiah olacak şekilde. %5 CO2 doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de kültür hücreleri. NOT: Önerilen tohumlama yoğunluğu genellikle 10 cm'lik bir NPC kabının hücre resüspensiyonunun 50 μL'dir, ancak bölünme oranlarına göre son bir hacme seyreltilirler (örneğin, 1:3 bölme için 3 mL, 1:4 bölme için 4 mL, vb.).</li>
	<li>Kaplamadan üç gün sonra iA'ların ortasını (10 mL astrosit ortam) değiştirin. Hücreleri 5-7 gün boyunca farklı tutun. NOT: iA'lar birden fazla pasajı iyi tolere etmez, bu nedenle NPC'leri her böldüğünüzde taze astrositler yapmak daha iyidir.</li>
	<li>Deneme için tohumlama için, 2.1-2.7 adımlarında açıklandığı gibi tripsin veya hücre ayırma çözümünü kullanarak astrositleri bölün. Önerilen tohumlama yoğunlukları Tablo 2'yedahildir.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Plaka Türü</td>
			<td>Kuyu Başına Astrositler</td>
		</tr>
<tr>
<td>384 kuyu</td>
			<td>2500</td>
		</tr>
<tr>
<td>96-kuyu</td>
			<td>10000</td>
		</tr>
<tr>
<td>24 kuyu</td>
			<td>40000</td>
		</tr>
<tr>
<td>6 kuyu</td>
			<td>150000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2. Plaka alanı başına önerilen iA tohumlama yoğunluğu. En yaygın doku kültürü plakalarında bir monolayer oluşturmak için tohumlanan tipik iA sayısı.
4. Donmuş NPC stoklarından astrosit farklılaşması için bölümlerin hazırlanması ve çözülmesi (3. adıma alternatif)
NOT: Kültürde iNPC'leri korumaya alternatif olarak, astrositler doğrudan dondurulmuş bir stoktan da üretilebilir. Bunu yapmak için, iNPC'ler daha küçük bölümlerde dondurulur. Tablo 3, 10 mL Astrosit ortam içeren 10 cm'lik bir tabakta çözülecek kısımlar için donma ve çözülme hacimlerini göstermektedir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Porsiyon Boyutu</td>
			<td>Hücre Süspansiyonu (μL)</td>
			<td>Donma ortamı (μL)</td>
			<td>Toplam hacim (μL)</td>
			<td>Buzları Çözerek</td>
		</tr>
<tr>
<td>4x</td>
			<td>400</td>
			<td>400</td>
			<td>800</td>
			<td>İki adet 10 cm'lik yemek</td>
		</tr>
<tr>
<td>2x</td>
			<td>200</td>
			<td>200</td>
			<td>400</td>
			<td>Bir adet 10 cm'lik tabak</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3. iA'lar oluşturmak için iNPC'nin nasıl bölümlerek oluşturulana ilişkin yönergeler. Bölümleri oluşturmak için iNPC süspansiyon ve dondurma ortamı oranı. Hücre süspansiyonu donma ortamıyla karıştırıldığında son DMSO konsantrasyonu %10 olduğunu unutmayın.
<ol><li>Dondurulmuş iNPC stoklarından astrosit yapmak için, sıvı azot depolama tankından porsiyon şişesini çıkarın ve 37 °C'de hızla çözün. Hücreler çözülür çözülmez, 5 mL astrosit ortam içeren 15 mL'lik bir tüpte pipet hücresi çözeltisi.</li>
	<li>200 x g ve oda sıcaklığında 4 dakika santrifüj. Süpernatant çıkarın ve 1 mL taze astrosit ortamında yeniden diriltin.</li>
	<li>Fibronektin kaplı 10 cm'lik bir yemeğe 9 mL taze astrosit ortamı ekleyin ve 1 mL hücre çözeltisi ekleyin. Hücreleri kuzey-güney-doğu-batı hareketinde yavaşça dağıtıyor. %5 CO2 doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de kültür hücreleri.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Leenaars, C. H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+to+human+translation:+a+systematic+scoping+review+of+reported+concordance+rates.">Animal to human translation: a systematic scoping review of reported concordance rates.</a> Journal of Translational Medicine. 17 (1), 223 (2019).</li><li>Rhrissorrakrai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+limits+of+animal+models+as+predictors+of+human+biology:+lessons+learned+from+the+sbv+IMPROVER+Species+Translation+Challenge.">Understanding the limits of animal models as predictors of human biology: lessons learned from the sbv IMPROVER Species Translation Challenge.</a> Bioinformatics. 31 (4), 471-483 (2015).</li><li>Hartung, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thoughts+on+limitations+of+animal+models.">Thoughts on limitations of animal models.</a> Parkinsonism &amp; Related Disorders. 14, 81-83 (2008).</li><li>Ladewig, J., Koch, P., Brustle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveling+Waddington:+the+emergence+of+direct+programming+and+the+loss+of+cell+fate+hierarchies.">Leveling Waddington: the emergence of direct programming and the loss of cell fate hierarchies.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (4), 225-236 (2013).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Hamada, M., Malureanu, L. A., Wijshake, T., Zhou, W., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+to+pluripotency+can+conceal+somatic+cell+chromosomal+instability.">Reprogramming to pluripotency can conceal somatic cell chromosomal instability.</a> PLoS Genetics. 8 (8), 1002913 (2012).</li><li>Stricker, S. H., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+neural+lineage+elaboration:+Implications+for+therapeutic+reprogramming.">Epigenetic regulation of neural lineage elaboration: Implications for therapeutic reprogramming.</a> Neurobiology of Disease. 148, 105174 (2020).</li><li>Tang, Y., Liu, M. L., Zang, T., Zhang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Reprogramming+Rather+than+iPSC-Based+Reprogramming+Maintains+Aging+Hallmarks+in+Human+Motor+Neurons.">Direct Reprogramming Rather than iPSC-Based Reprogramming Maintains Aging Hallmarks in Human Motor Neurons.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 359 (2017).</li><li>Kelaini, S., Cochrane, A., Margariti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+adult+cells:+avoiding+the+pluripotent+state.">Direct reprogramming of adult cells: avoiding the pluripotent state.</a> Stem Cells Cloning. 7, 19-29 (2014).</li><li>Kim, E., Tae, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+and+biomaterials+for+controlling+cell+fate.">Direct reprogramming and biomaterials for controlling cell fate.</a> Biomaterials Research. 20, 39 (2016).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+mouse+fibroblasts+to+neural+progenitors.">Direct reprogramming of mouse fibroblasts to neural progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7838-7843 (2011).</li><li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+dermal+fibroblasts+into+neural+progenitor+cells+by+a+novel+cocktail+of+defined+factors.">Direct conversion of dermal fibroblasts into neural progenitor cells by a novel cocktail of defined factors.</a> Current Molecular Medicine. 12 (2), 126-137 (2012).</li><li>Mertens, J., Marchetto, M. C., Bardy, C., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+cell+reprogramming,+differentiation+and+conversion+technologies+in+neuroscience.">Evaluating cell reprogramming, differentiation and conversion technologies in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (7), 424-437 (2016).</li><li>Kim, J., Ambasudhan, R., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming+to+neural+cells.">Direct lineage reprogramming to neural cells.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (5), 778-784 (2012).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li><li>Ambasudhan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+adult+human+fibroblasts+to+functional+neurons+under+defined+conditions.">Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions.</a> Cell Stem Cell. 9 (2), 113-118 (2011).</li><li>Kogiso, T., Nagahara, H., Otsuka, M., Shiratori, K., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdifferentiation+of+human+fibroblasts+into+hepatocyte-like+cells+by+defined+transcriptional+factors.">Transdifferentiation of human fibroblasts into hepatocyte-like cells by defined transcriptional factors.</a> Hepatology International. 7 (3), 937-944 (2013).</li><li>Grath, A., Dai, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cell+reprogramming+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine.">Direct cell reprogramming for tissue engineering and regenerative medicine.</a> Journal of Biological Engineering. 13, 14 (2019).</li><li>Meyer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+patient+fibroblasts+demonstrates+non-cell+autonomous+toxicity+of+astrocytes+to+motor+neurons+in+familial+and+sporadic+ALS.">Direct conversion of patient fibroblasts demonstrates non-cell autonomous toxicity of astrocytes to motor neurons in familial and sporadic ALS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (2), 829-832 (2014).</li><li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Reprogramming+to+Human+Induced+Neuronal+Progenitors+from+Fibroblasts+of+Familial+and+Sporadic+Parkinson's+Disease+Patients.">Direct Reprogramming to Human Induced Neuronal Progenitors from Fibroblasts of Familial and Sporadic Parkinson's Disease Patients.</a> International Journal of Stem Cells. 12 (3), 474-483 (2019).</li><li>Meyer, K., Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia-neuron+interactions+in+neurological+diseases:+Testing+non-cell+autonomy+in+a+dish.">Glia-neuron interactions in neurological diseases: Testing non-cell autonomy in a dish.</a> Brain Research. 1656, 27-39 (2017).</li><li>Verkhratsky, A., Parpura, V., Pekna, M., Pekny, M., Sofroniew, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+in+the+pathogenesis+of+neurodegenerative+diseases.">Glia in the pathogenesis of neurodegenerative diseases.</a> Biochemical Society Transactions. 42 (5), 1291-1301 (2014).</li><li>Ettle, B., Schlachetzki, J. C. M., Winkler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+and+Myelin+in+Neurodegenerative+Diseases:+More+Than+Just+Bystanders.">Oligodendroglia and Myelin in Neurodegenerative Diseases: More Than Just Bystanders.</a> Molecular Neurobiology. 53 (5), 3046-3062 (2016).</li><li>Ferraiuolo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocytes+contribute+to+motor+neuron+death+in+ALS+via+SOD1-dependent+mechanism.">Oligodendrocytes contribute to motor neuron death in ALS via SOD1-dependent mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (42), 6496-6505 (2016).</li><li>Palpagama, T. H., Waldvogel, H. J., Faull, R. L. M., Kwakowsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Microglia+and+Astrocytes+in+Huntington's+Disease.">The Role of Microglia and Astrocytes in Huntington's Disease.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 258 (2019).</li><li>Maezawa, I., Swanberg, S., Harvey, D., LaSalle, J. M., Jin, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome+astrocytes+are+abnormal+and+spread+MeCP2+deficiency+through+gap+junctions.">Rett syndrome astrocytes are abnormal and spread MeCP2 deficiency through gap junctions.</a> Journal of Neuroscience. 29 (16), 5051-5061 (2009).</li><li>Hautbergue, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRSF1-dependent+nuclear+export+inhibition+of+C9ORF72+repeat+transcripts+prevents+neurodegeneration+and+associated+motor+deficits.">SRSF1-dependent nuclear export inhibition of C9ORF72 repeat transcripts prevents neurodegeneration and associated motor deficits.</a> Nature Communications. 8, 16063 (2017).</li><li>Almad, A., Maragakis, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stocked+toolbox+for+understanding+the+role+of+astrocytes+in+disease.">A stocked toolbox for understanding the role of astrocytes in disease.</a> Nature Reviews Neurology. 14 (6), 351-362 (2018).</li><li>Gatto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directly+converted+astrocytes+retain+the+ageing+features+of+the+donor+fibroblasts+and+elucidate+the+astrocytic+contribution+to+human+CNS+health+and+disease.">Directly converted astrocytes retain the ageing features of the donor fibroblasts and elucidate the astrocytic contribution to human CNS health and disease.</a> Aging Cell. , (2020).</li><li>Caiazzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+fibroblasts+into+functional+astrocytes+by+defined+transcription+factors.">Direct conversion of fibroblasts into functional astrocytes by defined transcription factors.</a> Stem Cell Reports. 4 (1), 25-36 (2015).</li><li>Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+punch+biopsy+explant+culture+for+derivation+of+primary+human+fibroblasts.">Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e3779 (2013).</li><li>Pear, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+methods+for+preparation+of+high-titer+retroviral+supernatants.">Transient transfection methods for preparation of high-titer retroviral supernatants.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 11 (2001).</li><li>Boczonadi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+glycyl-tRNA+synthetase+impair+mitochondrial+metabolism+in+neurons.">Mutations in glycyl-tRNA synthetase impair mitochondrial metabolism in neurons.</a> Human Molecular Genetics. 27 (12), 2187-2204 (2018).</li><li>Rinaldi, F., Motti, D., Ferraiuolo, L., Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+analysis+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">High content analysis in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 80, 180-191 (2017).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Özetle, doğrudan dönüşüm, hasta cilt fibroblastlarından indüklenmiş nöronal progenitör hücreler üretmek için hızlı ve kolay bir yöntemdir. Bu yöntem, hızı ve bakımı kolay üretilen çok sayıda hücre nedeniyle avantajlıdır. Dahası, artan kanıtlar, doğrudan yeniden programlama yöntemlerinin klasik iPSC yeniden programlama teknolojisine kıyasla daha az epigenetik izi ortadan kaldırdığını, bu nedenle hastalık ortamını daha sağlam bıraktığını göstermektedir4,7,8. INPC'lerin astrositlere farklılaşması çok düzdür ve birden fazla bağımsız laboratuvar arasında bile oldukça tekrarlanabilir19,29,33. iNPC'ler küçük porsiyonlarda dondurulabilir ve farklılaşma amacıyla doğrudan çözülebilir, bu da geçiş sayıları benzer tutulabildiğinden deneyler arasındaki varyasyonu azaltmaya yardımcı olur. Astrositler birçok nörolojik hastalıkta hastalığın ilerlemesinde çok önemli bir rol oynar ve bu nedenle çalışmak için ilginç bir hücre tipidir. Astrositler mekanistik çalışmalar, metabolik çalışmalar veya ilaç testi tahlilleri için kullanılabilir ve genellikle monolayer olarak yetiştirilir. Ayrıca, astrositler, her ikisi de ilaç testi için iyi okumalar olan nöronal sağkalım ve morfoloji üzerindeki etkisini değerlendirmek için fare veya insan nöronları ile ortak kültür sistemlerinde birleştirilebilir34.
Bu protokolün başarıyla kullanılabilmesi için birkaç noktanın ve potansiyel sınırlamaların akılda tutulması gerekir. Örneğin insan derisi fibroblastları, viral vektörlere yanıt olarak hücre bölünme oranlarına göre büyük ölçüde değişir. Bunlar standart hücre hatları olmadığından, insanlığın kendisi kadar değişkendir, her çizgi farklıdır. Birçok yeniden programlama yöntemine gelince, orta ila hızlı hücre bölünme oranına sahip fibroblastları zar zor çoğalan hücrelere göre yeniden programlamak daha kolaydır. Replikasyon oranı, cilt biyopsisi kalitesinden ve işlenmesinden, fibroblastların geçiş sayısından ve elleçlemeden etkilenebilir. Birincil cilt fibroblastları ile çalışırken, senescence indüksiyonunu önlemek için hücrelerin çok yoğun olmasına izin vermemek önemlidir. Fibroblastlar iyi büyümezse, yeni bir stok veya daha düşük bir pasaj denemek en iyisidir, ancak bazı durumlarda hastalığın kendisi de bir rol oynayabilir. Hücre bölünmesi bazen fibroblast ortamlarında standart %10'a kıyasla %15 veya %20 FBS kullanılarak iyileştirilebilir.
Yeniden programlayan viral vektörlerin kalitesi başarı için büyük önem taşımaktadır. Elimizde retroviral vektörler lentiviral vektörlere veya entegre olmayan diğer virüslere kıyasla daha verimliydi; bununla birlikte, bu viral vektör kalitesine ve saflığına bağlı olabilir. Ticari retroviral vektör kitleri genellikle viral vektör konsantrasyonunu ve genellikle belirli bir hücre hattı için enfeksiyonun çokluğunu belirtir. Birincil fibroblastların viral vektör alımını belirlemek için şirketler tarafından kullanılan hücre hattından farklı olduğunu akılda tutmak önemlidir. Ayrıca, aynı ticari kiti sipariş ederken bile, partiler arasındaki değişim yaygındır. Ayrıca, viral vektörlerin alımı da fibroblast hücre çizgileri arasında değişir. Bazı çizgiler daha hassas olabilir ve bu nedenle transdüklenmiş hücreler ölebilirken, diğer hücre hatları viral alıma karşı daha dirençli olabilir. Bu nedenle, belirli bir hücre hattı için transdüksiyon verimliliğinin belirlenmesi, özellikle hücre çizgisi yavaş büyüyorsa veya önceki dönüştürme girişimleri başarısız olursa önemli olabilir. Elimizde, dönüşüm için belirli bir retroviral vektörün ne kadarının gerekli olduğunu değerlendirmenin en iyi yolu, viral vektörün birkaç seyreltme ile immünofluoresan boyama yapmaktır. Her vektör için transjeni ifade eden hücrelerin sayısı daha sonra% 70 veya daha yüksek bir transdüksiyon verimliliği amacıyla sayılabilir. Deneyimlerimize göre, çoğu hücre hattı için benzer MOI'ler kullanılabilir, ancak gerekirse MOI ayarlanabilir.
Dönüştürme işlemi sırasında, hücreleri çok erken bölmemek önemlidir. Hücrelerin bölünmeye hazır olduğu süre, birincil hücre çizgisi ve özellikleri, kullanılan viral vektörün kalitesi ve ortam kalitesi dahil olmak üzere birden fazla faktöre bağlıdır. Daha da önemlisi, hücreler yüksek yoğunlukta tutulduğunda dönüşümün başarı oranı çok daha yüksektir. Hücreler morfolojiyi değiştirmeye başlasa bile, hücreleri erken bölmektense ilk kuyuda daha uzun süre bırakmak daha iyidir. Bölünme çok erken gerçekleşirse, dönüştürme ilerlemesinde durabilir ve hücrelerin fibroblast benzeri şekil ve davranışa geri dönmesine neden olabilir. Ayrıca, çok erken seyreltmek, daha önce gözlenen NPC'lerin küçük ve kompakt hücre gövdelerine kıyasla daha uzun hücre gövdelerine neden olabilir. Bu nedenle, ilk bölünmeler her zaman muhafazakar olmalıdır; hücreleri çok fazla seyreltmeye kıyasla 1:1 veya 1:2 bölünmesiyle çok yoğun tutmak daha iyidir. İlk bölünmeden sonra bir miktar hücre ölümü bekleniyor. Not olarak, hücreler bölündükten sonraki ilk gün her zaman daha kötü (daha düz) görünür, bu normaldir. Hücre şekli hakkında en iyi kararlar 2-3 gün sonra verilmelidir. Daha da önemlisi, büyüme faktörlerinin ve medya bileşenlerinin kalitesi de çok önemlidir. Tamamen hazırlanmış medyanın en fazla 5-7 gün kullanılabilmesi için büyüme faktörleri içeren az miktarda medya hazırlamak önemlidir. Ortamı oda sıcaklığında veya 37°C'de uzun süre tutmayın. Hızlı kullanın ve ortam değişikliği yapılır yapılmaz soğutun. Ayrıca, ortam hacmini 2 mL yerine 1 mL'de düşük tutmak, özellikle dönüştürmeye daha dayanıklı hücre hatları için yardımcı olabilir. Hücreler ortamı hızla tüketirse, bu da kırmızı ortam renk formunda sarıya (asitleşme oranı) bir değişiklikle gözlemlenebilir, ortamın hacmini 2 mL'ye kadar ayarlayın. Hızlı medya tüketimi olumlu bir işarettir ve genellikle dönüşümün sonraki aşamalarında artan çoğalma ile birlikte gözlenir.
NPC'ler de medyadaki accutase varlığına karşı çok hassastır ve akutase inkübasyon süresini kısa tutmak çok önemlidir. 2-4 dakikalık bir kuluçka süresi öneriyoruz, hücreleri ne zaman ayrıldıklarını görmek için mikroskop altında sık sık kontrol edin. Enzim karışımını ortamdan çıkarmak için bölündükten sonra hücrelerin santrifüjlenimi esastır. İfade profillerinin değiştirilmesine yol açan genişletilmiş kültleme üzerine hücre çizgileri değişebileceğinden, geçiş numarasını akılda tutmak da önemlidir. Bu nedenle, birçok hücre stoklarını erken geçişlerde dondurmak önemlidir. Hücreler % 10 DMSO ve% 90 NPC ortamlarında dondurulmalı ve sıvı nitrojende uzun süre saklanmalıdır. Bu ortamdaki serum eksikliği nedeniyle, donma odaları kullanılarak yavaş bir donma sağlamak ve bir kez bir gecede dondurulduktan sonra derhal sıvı nitrojene aktarılması kritik öneme sahiptir. Bu protokolde klonal seleksiyon yapılmazken, genişletilmiş kültleme ve pas geçmenin, ilk hücre popülasyonunun olumlu büyüme ve sağkalım oranı ile doğal olarak seçilmesine yol açtığı mümkündür. Bu nedenle, deneyler yaparken geçiş numarasını ve işlemeyi akılda tutmak önemlidir. Deneyler için daha düşük pasajlar kullanmayı tercih ediyoruz, mümkünse hücre çizgilerini 20'den fazla kez geçmeyi aşmuyoruz. NPC'ler hızla büyüdüğünden, deneyler için daha düşük geçitlerde çok sayıda stok dondurulabilir. Özellikle yüksek büyüme oranlarına sahip hücre hatları, medya asitlenmesi riski daha yüksektir. Bu nedenle, hücre hatları farklı bir hızla büyüdükçe, ortam miktarının çoğalmaya göre ayarlanması gerekebilir. Hücreler sürekli olarak yüksek asitli ortamda bırakılırsa, hem kontrol hem de hastalık hücre hatlarının sağlığını etkileyebilir. Bu, sağlıklı astrositlerin bile reaktif hale gelmesine neden olur ve daha fazla farklılaşma ve deneylerde kullanımlarını etkiler.
Astrosit farklılaşması için, yüksek yoğunluk hücrelerin farklılaşmasını önleyeceğinden ve daha yüksek oranlarda çoğalmaya devam edeceklerinden, hücreleri düşük yoğunlukta tutmak önemlidir. Bu nedenle, tohumlama yoğunluğunun çoğalma oranlarına bağlı olarak her hücre hattı için ayarlanması gerekir. Uygun farklılaşmayı sağlamak için farklı tohumlama yoğunluklarını denemenizi ve astrosit işaretleyicilerle boyama/RT-PCR gerçekleştirmenizi öneririz. IAs kalitesi, nöronlarla ortak kültür tahlilleri kullanılarak sağlıklı kontrollerle birlikte değerlendirilebilir. Hastalık patolojisi reaktif bir fenotipe yol açmadığı için, nöronlar birkaç gün boyunca iA'larla temas halinde canlı kalmalıdır. Astrosit morfolojisi bireysel hücre hatları arasında büyük ölçüde değişebilir ve hastalık fenotipi tarafından da etkilenebilir. Ayrıca, astrositlerin yoğun olarak etkilendiği hastalıklarda, büyük, uzun uzantılı reaktif bir fenotip gösterebilirler.

Alttaki hastalık mekanizmalarını anlamak, potansiyel terapötik stratejilerin geliştirilmesine yardımcı olduğu için nörolojik hastalıklar için kritik öneme sahiptir. Hayvan modelleri tarihsel olarak sinir sistemi hastalıklarını araştırmak için altın standart olsa da, potansiyel tedavilerin klinik bir ortama doğrudan çevrilmeleri genellikle sınırlı başarı gösterir1,2,3. Çeviri eksikliğinin nedenleri, farelerde genetik arka plan ve mutasyonların değişkenliğinin olmaması, hastalık fenotiplerinin eksik görüntülenmesi ve insan hastalarında insan hastalarında inbred fare suşlarında iyi resmedilmeyen ilaç duyarlılığı veya dozlamadaki değişimdir. Ayrıca, birçok nadir nörolojik bozukluk için, hiçbir veya az sayıda hayvan modeli mevcut yoktur. Hastalık mekanizmalarının doğrudan ilgili insan hücre tiplerinde incelenmesi, araştırmayı kolaylaştırabilir ve kliniğe çeviriyi iyileştirebilir. CNS hastalıkları için, biyopsiler invaziv olduğu veya hastalığın son aşamasında sadece ölüm sonrası alınabildiği için birincil insan hücrelerinin alınması zordur ve çok sınırlı bir kaynağı temsil eder. Son 15 yılda, hücresel yeniden programlama teknolojisinin gelişimi, insan nörolojik ve nörodejeneratif hastalıkları in vitro olarak modelleme yeteneğini hızla genişlettir.
Hücre yeniden programlamanın geleneksel yöntemleri, fibroblastların veya diğer hücre türlerinin, üç mikrop katmanından da hücre tiplerine farklılaşabilen indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC' ler) yeniden programlanmasını içerir4. Takahashi ve Yamanaka, dört kök hücre transkripsiyon faktörünün yeniden ifade edilebilmesinin somatik hücreleriiPSC'lereyönlendirmek için yeterli olduğunu gösteren ilk kişilerdi 5 . iPSC'ler daha sonra belirli hücre türlerine daha da farklılaştırılabilir. Ancak bu sürecin dezavantajı, stabil kök hücre klonları üretmenin ve izole etmenin emek yoğun ve zaman alıcı olmasıdır. Kök hücre klonunda somatik mutasyonlar veya anne hücresinin spesifik sapmaları da korunur ve çalışmanın sonuçlarını etkileyebilir6. Ek olarak, artan kanıtlar, kök hücrelere yeniden programlama işleminin hücresel hastalık mekanizmalarını etkileyebilecek değerli epigenetik değişiklikleri sildiğini göstermektedir4,7,8. Son yıllarda araştırmacılar, pluripotent kök hücre durumu 9 ,10 , 11,12'yiatlarken farklı hücre türlerinin daha doğrudan üretilmesine izin vermek için değiştirilmiş yeniden programlama yöntemlerine odaklandılar (13 ,14'teincelendi). İlk atılımlar, fibroblastların kardiyomiyositler 15 , nöronlar16ve hepatositler17'ye birden fazla soyuna özgü transkripsiyon faktörünün ektopik ekspresyonu veya mikroRNA'lar18 ile in vitro kombinatoryal yeniden programlanması ortaya koydu. Bunu, hücreleri nörolojik bozuklukları modellemek için doğrudan yeniden programlama çalışmaları izledi19,20. Yukarıda belirtildiği gibi, bu tür doğrudan yeniden programlama veya dönüştürme protokolleri, hız ve klonal izolasyon adımının ablasyonu da dahil olmak üzere klasik iPSC protokollerine göre potansiyel avantajlara sahiptir. Ayrıca, kanıtlar bu protokollerin hastanın yaşıyla ilgili daha fazla miktarda epigenetik bilginin korunmasına izin verdiğini ve muhtemelen aynı şeyin hastalıkla ilgili belirteçler için de geçerli olduğunu göstermektedir7,8.
Bugüne kadar nörolojik bozukluklarla ilgili in vitro araştırmaların çoğu öncelikle nöronlara odaklanmıştır. Bununla birlikte, astrositler gibi diğer hücre tiplerinin, mikroglia ve oligodendrositler, Alzheimer hastalığı (AD), Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS), Parkinson hastalığı (PD), Huntington Hastalığı (HD), Multipl Skleroz (MS) gibi nörodejeneratif bozuklukların ve Rett sendromu (RTT), uyku bozuklukları, bağımlılık gibi diğer nörolojik patolojilerin ilerlemesinde ve hastalık patolojisinde kritik bir rol oynar. epilepsi, lizozomal depolama bozuklukları, depresyon, migren ve patolojik ağrı21,22,23,24,25,26. Astrositler merkezi sinir sistemindeki (CNS) en bol hücre tipidir ve yakın zamana kadar patolojik açıdan geniş ölçüde ihmal edilmiştir7. Artık sağlıklı CNS'nin neredeyse tüm homeostatik fonksiyonlarını desteklemede kritik bir role sahip oldukları bilinmektedir. Ek olarak, önemli bir patolojik etkiye sahip oldukları ve hastalık mekanizmasını anlamada ve terapötik stratejileri değerlendirmede çok değerli oldukları açıktır19.
Mevcut açıklamada, Yamanaka yeniden programlama faktörlerini (Klf4, Eki3/4, Sox2 ve c-Myc) ifade eden retroviral vektörler kullanarak insan hasta fibroblastlarının indüklenmiş Nöronal Progenitör Hücrelere (iNPC' ler) doğrudan dönüştürülmesi ve daha sonra nöralize edici ortama maruz kalması için bir protokol detaylandırıyoruz. Önceki çalışmalar, sinir hücrelerine doğrudan yeniden programlama için transkripsiyonel faktörlerin farklı kombinasyonlarını kullanmıştır (14'tegözden geçirilmiştir), ancak açıklanan protokolde kullanılan faktörler, viral vektörlerin ev üretiminde plazmidler olarak veya viral yeniden programlama kitlerine gitmeye hazır ticari olarak yaygın olarak mevcuttur. Ortaya çıkan iNPC'ler, nörolojik hastalıklardaki rollerini incelemek için indüklenmiş nöronlar (iNs)27, oligodendrositler (iOs)24 ve astrositler (iAS)19 olarak daha da ayırt edilebilir. Protokolümüz, mevcut protokollerin çoğunun insan astrositlerinin türetmesi için kullandığı zaman alıcı iPSC'lerin neslini içermez28. Doğrudan yeniden programlanmış iNPC'lerin yaklaşık% 98 ila% 100'ü, fibroblastlardan astrositlere doğrudan dönüştürme yöntemini kullanarak sadece% 2'ye kıyasla GFAP pozitif astrositler29'a farklılaşabilir. Son zamanlarda, tarif edilen yeniden programlama yöntemimizi kullanan karşılaştırmalı bir transkriptomik çalışma, donör fibroblastlardan yeniden programlanan iNPC'lerin, yaşla eşleştirilen ölüm sonrası astrositler ve primer astrositlere benzer transkripsiyonel ve fonksiyonel düzeyde yaşlanma özelliklerini koruyabileceğini göstermiştir29. Bu nedenle, bu dönüşüm protokolü, hastalık mekanizmalarını araştırmak ve yaşa bağlı nörodejeneratif ve nörolojik bozukluklar için yeni terapötik yaklaşımları değerlendirmek için güçlü bir araçtır.
Burada, iNPC'ler oluşturmak ve daha büyük ölçekli küçük moleküler tarama tahlilleri için en uygun olan iA'lara daha fazla farklılaşmak için kullanılan protokolü açıklıyoruz. Hastalık mekanizmaları ve iA'larla ilaç testi, nöronlarla ortak kültürler veya metabolik ve biyokimyasal analizler gibi farklı metodolojiler kullanılarak yapılabilir. Bu sistemin avantajı, iPSC'lere kıyasla bu hücre hatlarının bakım hızı ve kolaylığıdır. Ayrıca, iNPC'ler, uzun süreler boyunca sabit koşullar altında ilaç testini kolaylaştıran iAs farklılaşması için küçük porsiyonlarda dondurulabilir. Genel olarak, daha büyük örnek sayıların karşılaştırılması, daha büyük ve daha temsili bir hasta popülasyonunda bileşiklerin terapötik potansiyelini değerlendirmenin kapısını açan bu şekilde mümkün hale gelir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100mm x 2mm Style dish, Cell culture treated, Nonpyrogenic</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td>Tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical screw cap centrifuge tubes, copolymer polypropylene</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1475-1611</td>
			<td>Used for lifting and centrifuge cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1500-1811</td>
			<td>Media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Antibiotic with antifungal activity for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27&#160; Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504044</td>
			<td>For NPC and base media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials&#160; 1.2ML</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430658-500EA</td>
			<td>For freezing cell stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX&#160; Supplement, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569010</td>
			<td>For fibroblast and Astrocyte media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX&#160; supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565042</td>
			<td>For NPC and base media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438-50ML</td>
			<td>For freezing cell stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190136</td>
			<td>Referred in protocol as PBS. For fibronectin dilution and cell wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ Retrovirus iPSC Reprogramming Kit</td>
			<td>ALSTEM</td>
			<td>RF101</td>
			<td>Retrovirus containing the Yamanaka factors. Virus can also be made in-house.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-036</td>
			<td>Referred in protocol as FBS . For Fibroblast and Astrocyte media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-461</td>
			<td>Filter media (50mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149-10KU</td>
			<td>Referred in protocol as Heparin. Used in conversion media. Powder diluted in ultrapure water. Final stock concentration of 5000X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FC010-10MG</td>
			<td>Referred in protocol as Fibronectin, used in 1:200 dilution for coating.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (technical grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25372A</td>
			<td>For freezing cell stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>For freezing cell stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>For Astrocyte, NPC and base media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Referred in protocol as EGF, used in conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Referred in protocol as FGF, used in NPC and conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Referred in protocol as Accutase. Used for lifting during the conversion process and NPCs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2GPU05RE</td>
			<td>Media filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 6 well, Flat bottom with Low evaporation lid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td>Tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300062</td>
			<td>Lifting of Fibroblasts and Astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Puradisc 25 syringe filters, 0.2 &#956;m, PES sterile</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>80-2502</td>
			<td>Filter media (50mL)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro modeling for neurological diseases using direct conversion from fibroblasts to neuronal progenitor cells and differentiation into astrocytes

Nörolojik bozukluklar üzerine yapılan araştırmalar öncelikle nöronların hastalık mekanizmaları üzerindeki etkisine odaklanmaktadır. Hayvan modellerinin sınırlı mevcudiyeti, hücre tipinin hastalığa özel katkılarının incelenmesini ciddi şekilde etkiler. Üstelik hayvan modelleri genellikle insan hastalarında görülen mutasyon ve hastalık derslerinde değişkenliği yansıtmamaktadır. İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC) üretimi için yeniden programlama yöntemleri hastaya özgü araştırmalarda devrim yaratmış ve hastalık mekanizmalarını incelemek için değerli araçlar yaratmıştır. Bununla birlikte, iPSC teknolojisinin zaman, işgücü taahhüdü, klonal seçicilik ve epigenetik belirteçlerin kaybı gibi dezavantajları vardır. Bu yöntemlerin son değişiklikleri, klonal izolasyonu veya pluripotent kök hücre durumunu atlayarak daha doğrudan hücre soylarının veya belirli hücre türlerinin üretilmesine izin verir. Nöronal Progenitör Hücreleri (iNPC'ler) cilt fibroblastlarından, nöralize edici ortamla birlikte retroviral vektörleri kullanarak üretmek için hızlı bir doğrudan dönüştürme yöntemi geliştirdik. iNPC'ler nöronlara (iNs) oligodendrositlere (iOs) ve astrositlere (iA'lar) ayırt edilebilir. iNPC'lerden farklılaşma sadece 5 gün sürdüğünden iAs üretimi hızlı ilaç ve hastalık mekanizması testini kolaylaştırır. Ayrıca, iA'larla çalışmak kolaydır ve saf popülasyonlarda çok sayıda oluşturulur. Çok sayıda nörolojik ve nörodejeneratif bozukluk için potansiyel terapötik stratejileri değerlendirmek için fare GFP+ nöronları ve hasta türevli iA'lar kullanarak son derece tekrarlanabilir bir ortak kültür tahlilleri geliştirdik. Daha da önemlisi, iA tahlilleri, tek bir plakada birden fazla küçük molekülün değerlendirilmesini kolaylaştıran 384 kuyu formatına ölçeklenebilir. Bu yaklaşım, çeşitli genetik geçmişe sahip birden fazla hasta hücre hattının eşzamanlı terapötik değerlendirilmesine izin verir. IA'ların kolay üretimi ve depolanabilirliği ve bir testte birden fazla bileşiği tarama kapasitesi, bu metodolojiyi kişiselleştirilmiş tıp için uyarlanabilir hale getirir.

Bu protokol, Yamanaka faktörlerini içeren retrovirüsleri kullanarak doğrudan insan derisi fibroblastlarından iNPC'lerin hızlı ve kolay üretilmesini sağlar. Bu yöntem, kök hücre durumunu ve klon seçimi ihtiyacını atlayarak klonal varyasyonu önlemeye izin verir. Hücreler dönüşüm sürecinden geçerken akılda tutulması gereken önemli adımlar fibroblast tohumlama yoğunluğu, ortam pH'ı ve hücrelerin optimum bir konfluenste tutulmasıdır. Dönüştürme işlemi sırasında en uygun bölme konfilüsyolojisi ve morfoloji değişikliklerine örnekler Şekil 1'de bulunabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62016/62016fig01.jpg"> Şekil 1. Yamanaka faktörlerinin retroviral karışımını ekledikten sonra dönüştürme işleminin temsili görüntüleri. Fibroblastlar yirmi dört saat sonra Yamanaka faktörleri ile tohumlandı ve transdüklendi. virüs sonrası iki gün (DPV), ortam dönüştürme ortamı olarak değiştirildi. Hücreler geçişe hazır olana kadar dönüşüm ortamlarında kültürlendi (13 DPV). Hücreler ertesi gün %80 izdihama (14 DPV) ulaşmak için post pasaj tohumlandı. Sonraki pasajlar, nöronal progenitör hücreler hızla bölünmeye başlayana kadar bu yoğunluğu korudu. Ölçek çubuğu 200 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62016/62016fig01large.jpg" target="_blank">μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Dönüştürme işlemi tamamlandıktan sonra, NPC'ler fibroblast belirteçlerinin ve morfolojisinin güçlü bir şekilde azaltılmış ifadesini veya ifadesini göstermez ve NPC'ye özgü hücre işaretlerini ifade edecektir (Şekil 2). Ayrıca, iNs, iOs ve iAs gibi farklı hücre hatları oluşturmak için de kullanılabilirler.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62016/62016fig02.jpg"> Şekil 2. Dönüştürme işleminden geçen hücreler hücreye özgü işaretleyicileri ifade edin. Hasta fibroblastları (A), indüklenmiş Nöronal Progenitör Hücreler (iNPC'ler (B) ve indüklenmiş Astrositler (iAs (C) hücreleri 24 kuyu doku kültürü tedavi edilen bir plakada cam kapaklar üzerinde tohumlandı. Hücreler için immünostained: fibroblast spesifik hücre belirteçleri (A), Vimentin (yeşil) ve TE7 (kırmızı), iNPC spesifik hücre işaretleyici (B), Nestin (kırmızı) ve iAs hücre işaretleyici (C) GFAP (mor) ve iNPC işaretleyici Nestin (yeşil). Ölçek çubuğu 50 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62016/62016fig02large.jpg" target="_blank">μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Deneyimlerimize göre, özellikle iA'lar, saf popülasyonlarda (%98 veya daha fazla GFAP pozitif hücre29)tekrarlanabilir büyük sayılarda üretilebildiğinden ilaç ve hastalık mekanizması testi için çok değerlidir. iA'lar, bölme sırasında küçük bir hücre aliquot'u veya daha önce dondurulmuş bir iNPC bölümü alınarak ve doğrudan astrosit ortama kapatılarak iNPC'lerden ayrılabilir. Bu işlem sırasında önemli hususlar, iNPC'lerin ilk tohumlama yoğunluğunu düşük tutmaktır (Şekil 3 ve Şekil 4), çünkü yüksek yoğunluğun farklılaşma sürecini engellediği gösterilmiştir (Şekil 4) ve asitleşme sağlıklı astrositleri bile aktive edebileceği için medya pH'ına ek dikkat gösterilmiştir.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62016/62016fig03.jpg"> Şekil 3. iNPC'lerden iAs oluşturma işleminin temsili görüntüleri. iNPC'ler Astrosit ortamlarında (Tablo 1) düşük tohumlama yoğunluğunda tohumlanır. İyi bir tohumlama yoğunluğu, tohumlama sonrası ilk gün (DPS) (solda) yaklaşık% 10'dur; ancak bu yoğunluk hücrelerin büyüme hızına göre ayarlanabilir. Tipik iAs morfolojisi 5 DPS'den (ortada) sonra gözlenebilir. Bazı durumlarda, uzun, dikenli uzantılarla anormal astrosit morfolojisi gözlenebilir. Bu değişiklik astrosit aktivasyonunun göstergesidir ve hastalık durumuna veya yanlış kültleme tekniklerine ikincil olabilir (sağda). Ölçek çubuğu 200 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62016/62016fig03large.jpg" target="_blank">μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62016/62016fig04.jpg"> Şekil 4. iNPC tohumlama yoğunluğu iAs farklılaşma verimliliğini etkiler. Kontrol iNPC hatları, tohumlama yoğunluğunun farklılaşma üzerindeki etkilerini göstermek için Astrosit ortamlarında düşük (A) ve yüksek (B) yoğunlukta tohumlanmıştır. 5 DPS, düşük yoğunluklu çizgi astrositlere özgü belirteçleri ifade ederken, yüksek yoğunluklu çizgi iNPC benzeri bir morfoloji ile iNPC ve iAs işaretleyicilerinin bir karışımını gösterir. Ölçek çubuğu 50 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62016/62016fig04large.jpg" target="_blank">μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1. Yamanaka faktörlerinin retroviral karışımını ekledikten sonra dönüşüm sürecinin ek rakamları. 12 DPV (geçişten 1 gün önce) ve 19 DPV (geçişten 6 gün sonra) dönüştürme işleminin görüntüleri. Geçişten önce ve sonra hücreler arasındaki morfoloji farkına dikkat edin, 12 DPV hücresinde top benzeri bir yapı morfolojisi vardır. Bir geçişten sonra ve dönüştürme medyasında birkaç gün (tablo 1) hücreler NPC benzeri bir morfoloji görüntülemeye başlar. Ölçek çubuğu 200 μm'dir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62016/Supplemental%201.%20Additional%20Images%20Conversion.tif" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes at JoVE.

In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes

İnsan derisinden türetilmiş fibroblastları indüklenmiş Nöronal Progenitör Hücrelere (iNPC' ler) yeniden programlamak için bir protokol ve daha sonra indüklenmiş Astrositlere (iAs) farklılaşmalarını açıklıyoruz. Bu yöntem, büyük miktarlarda iNPC'lerin ve iA'ların hızlı ve tekrarlanabilir üretimine yol açar.

Fibroblastlardan Nöronal Progenitör Hücrelere Doğrudan Dönüşüm ve Astrositlere Farklılaşma Kullanarak Nörolojik Hastalıklar için İn vitro Modelleme

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely ...

Bu protokolü hasta cilt fibroblastlarından nöral progenitör hücreler yapmak ve nörolojik ve nörodejeneratif hastalıkları incelemek için kullanıyoruz. Bu protokolün, hız da dahil olmak üzere klasik IPS teknolojisine göre birçok avantajı olduğunu, aynı zamanda bazı durumlarda daha ağır bir hastalık fenotipi elde ettiğimizi hissediyoruz. Nörolojik ve nörodejeneratif hastalıkları inceliyoruz ve cilt örneklerini kullanmak hastaların çeşitliliğini de değerlendirmemizi sağlıyor.Laboratuvarım özellikle astrositlerin hastalıklardaki rolüyle ilgileniyor ve NPC'lerden yaptığımız astrositleri ilaçları test etmek ve aynı zamanda hastalık mekanizmalarını incelemek için kullanıyoruz, aynı zamanda insan ve fare nöronlarıyla ortak kültürlerde. Bu protokolün bilgilendirici olacağını umuyoruz ve herhangi bir sorunuz varsa lütfen ulaşın. Teşekkürler.Hücre bankalarından veya cilt biyopsilerinden elde edilebilen birincil insan derisi fibroblastlarını kullanın. %5 CO2 doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede kültür hücreleri. Deneyde kullanılmadan önce çözülme sonrası en az bir ila iki pasaj için geçiş hücreleri.Hücreler hazır olduğunda, oda sıcaklığında 15 ila 20 dakika boyunca PBS'de seyreltilmiş 1:200 konsantrasyonda insan fibronektinli altı kuyulu bir plakanın kuyusunu kaplayın. Fibroblast medyasını tablo 1'de gösterildiği gibi hazırlayın. Hücreler kaplanmaya hazır olduğunda, fibronektinleri tabaktan çıkarın ve hemen hücre çözeltisi veya iki mil fibroblast ortamı ekleyin.Ortam eklemeden önce yemeğin kurumasına izin vermeyin. Hücrelerin ne kadar hızlı büyüdüğüne bağlı olarak, insan fibronektin kaplı altı kuyu plakasının iki kuyusunda 150.000 ila 200.000 fibroblast plaka. %5 CO2 doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede kültür hücreleri.Tohumlamadan sonraki gün, mikroskop altındaki fibroblastları kontrol edin ve hücre yoğunluğunun dört retroviral vektörle birlikte% 70 ila% 85 Arasında olduğunu doğrulayın:Eki3/4, Klf4, Sox2 ve c-Myc. Hızlı büyüyen için 10 veya yavaş büyüyen fibroblastlar için 15 enfeksiyon çokluğu kullanın. Transdüksiyon verimliliği her vektör için% 70 veya daha fazla pozitif hücreyi aşmalıdır.Kuyu başına toplam bir mil hacim için viral karışıma düzenli fibroblast ortamı ekleyin. İkinci iyi tedavi edilmemiş bırakın ve bir gecede kuluçkaya yatmak için hücreleri doku kültürü inkübatörüne geri döndürün. Transdüksiyondan sonraki gün, hücreleri PBS ile bir kez yıkayın ve bir mil taze fibroblast ortamı ekleyin.%5 CO2 doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede kültür hücreleri. Ertesi gün, tablo birde gösterildiği gibi dönüştürme ortamı hazırlayın ve artık fibroblast ortamından kurtulmak için pbs ile bir kez hücreleri yıkayın, ardından bir mil dönüştürme ortamı ekleyin. Tedavi edilmeyen kuyunun medyasını da dönüştürme ortamı olarak değiştirin.Mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyin ve morfolojideki değişiklikleri izleyin. Hücre ortamı, dönüştürme işlemi boyunca her gün bir ila iki mil dönüştürme ortamı ve sonraki iNPC kültürü için değiştirilmelidir. Hücrelerin ortamın kalan %30'unda kapalı kalmasını sağlarken% 70 medyayı kuyudan dikkatlice çıkararak ortamı değiştirin.Bir ila iki mil dönüştürme ortamıyla hücreleri gözlemlemeye ve medyayı günlük olarak değiştirmeye devam edin. Dönüşüm medyasında yaklaşık beş ila altı gün sonra veya hücreler çok yoğun hale geldiğinde, onları bir ila iki veya maksimum bir ila üç arasında iletin. Accutase'yi ısıtın ve oda sıcaklığında 15 ila 20 dakika pbs'de 1:200 seyreltilmiş bir mil toplam fibronektin ile altı kuyulu bir plakada uygun sayıda kuyuyu kaplayın.Hücreleri, herhangi bir hücreyi ayırmadan PBS ile dikkatlice yıkayın. PBS'yi hücrelere nazikçe uygulamak için kuyunun duvarını kullanın. PBS'yi pipetlerle veya aspirasyon yaparak dikkatlice çıkarın.500 mikrolitre Accutase ekleyin ve bir doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede iki ila üç dakika kuluçkaya yatır. Çoğu hücrenin ayrıldığını doğrulamak için mikroskop altında kontrol edin. Hücreler çıktıysa, iki mil taze dönüştürme ortamı ekleyin ve kümeleri ayrıştırmak için iki ila üç kez yavaşça yukarı ve aşağı pipet ekleyin.Hücreleri 15 millik bir tüpte toplayın ve Accutase'yi daha da seyreltmek için üç mils ortam ekleyin. Oda sıcaklığında 200 G'da dört dakika santrifüjleyin. Hücre peletinden süpernatant çıkarın ve hücreleri bir mil taze ortamda yeniden biriktirin.Hücre kümelerini çözmek için iki ila üç kez yavaşça pipet yukarı ve aşağı. Fibronektin kaplamalı altı kuyudan çıkarın ve her kuyuya hemen bir mil taze ortam ekleyin. 1:2'lik bir bölünme oranı için, bir kuyuya 500 mikrolitre, ikinci bir kuyuya da 500 mikrolitre ekleyin.Kuzey-güney doğu-batı yönünde altı kuyuyu hafifçe sallayarak hücreleri dağıtın ve 37 derece doku kültürü inkübatörü koyun. Ertesi gün mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyin ve bir ila iki mil ile ortam değiştirin. Hücreler yeniden bölünmeye hazır olana kadar her gün ortam değiştirin.FGF içeren NPC medyasını, tablo 1'de görüldüğü gibi EGF veya heparin olmadan daha fazla konsantrasyonda hazırlayın. Bu yeni bölmede, dönüşüm medyasındaki hücrelerin bir kuyusunun tohumunun, diğerinin de NPC medyasında. Bir ila iki mil NPC ortamıyla iNPC'lerin medyasını her gün değiştirmeye devam edin.Astrosit ortamlarını tablo bire göre hazırlayın. Taze iNPC'lerden astrosit yapmak için, iNPC'leri doğrudan 10 mil astrosit ortamlarında 10 santimetre fibronektin kaplı plakalarda tohumlayın, böylece ertesi gün yaklaşık% 10 iklüzyondurlar. %5 CO2 doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede kültür hücreleri.Kaplamadan üç gün sonra 10 mil astrosit ortamla ortamı değiştirin. Hücreleri beş ila yedi gün boyunca farklı tutun. Deneme için tohumlama için, 2.Önerilen tohumlama yoğunlukları tablo ikiye dahildir. İndüklenmiş astrositler oluşturmak için iNPC'lerin nasıl bölümlendirılacağına ilişkin yönergeler tablo üç'te bulunur. Dondurulmuş iNPC stoklarından astrosit yapmak için, sıvı azot depolama tankından porsiyon stok dosyasını çıkarın ve 37 santigrat derecede hızla çözün.Hücreler çözülür çözülmez, beş mil astrosit ortamı içeren 15 millik bir tüpte pipet hücresi çözeltisi. 200 G oda sıcaklığında dört dakika santrifüjleyin. Bir mil taze astrosit ortamında süpernatant ve resuspend çıkarın.Fibronektin kaplı 10 santimetrelik bir yemeğe dokuz mil taze astrosit ortamı ekleyin ve kuzey-güney doğu-batı hareketinde hücreleri hafifçe dağıtarak bir mil hücre çözeltisi ekleyin. %5 CO2 doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede kültür hücreleri. Bu protokol, Yamanaka faktörlerini içeren retrovirüsler kullanarak doğrudan insan derisi fibroblastlarından iNPC'lerin hızlı ve kolay üretilmesini sağlar.Bu yöntem, kök hücre durumunu ve klon seçimi ihtiyacını atlayarak klonal varyasyonu önlemeye izin verir. Hücreler dönüşüm sürecinden geçerken akılda tutulması gereken önemli adımlar fibroblast tohumlama yoğunluğu, ortam pH'ı ve hücrelerin optimum bir izdiahta tutulmasıdır. Dönüşüm işlemi sırasında optimum izdiah ve morfoloji değişikliklerine örnekler şekil 1'de bulunabilir.Dönüştürme işlemi tamamlandıktan sonra, NPC'ler fibroblast belirteçlerinin ve morfolojisinin güçlü bir şekilde azaltılmış ifadesini veya ifadesini göstermez ve NPC'ye özgü hücre işaretlerini ifade edecektir. Ayrıca, indüklenmiş nöronlar, oligodendrositler ve astrositler gibi farklı hücre hatları üretmek için de kullanılabilirler. Deneyimlerimize göre, özellikle indüklenmiş astrositler, saf popülasyonlarda tekrarlanabilir çok sayıda üretilebildiği için ilaç ve hastalık mekanizması testi için çok değerlidir.İndüklenen astrositler, bölme sırasında küçük bir hücre aliquot'u veya daha önce dondurulmuş bir iNPC kısmı alınarak ve doğrudan astrosit ortamlarında kaplama yapılarak iNPC'lerden ayırt edilebilir. Bu işlem sırasında önemli hususlar, yüksek tohumlama yoğunluğunun farklılaşma sürecini engellediği gösterildiği için iNPC'lerin ilk tohumlama yoğunluğunu düşük tutmak ve asitleşmenin sağlıklı astrositleri bile aktive edebileceği için medya pH'ına ek dikkat gösterilmesidir. Özetle, doğrudan dönüşüm protokolü, hasta cilt örneklerinden nöral progenitör hücreler yapabilmek için çok hızlı bir yöntemdir.Bu, aynı anda daha fazla sayıda hücre örneğini incelemeyi ve hastalık bağlamındaki çeşitliliğe gerçekten bakmayı sağlar. Bunun, nöral progenitör hücreler, nöronlar, aynı zamanda ortak kültürde veya kendileri tarafından uyuşturucu testi veya mekanistik çalışmalar için de kullanılabilecek astrositler yapmak için kullanabileceğiniz çok güçlü bir test olduğunu hissediyoruz.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Bozulmamış Duyu Organ Öncü Hücreler Canlı hücre Görüntüleme Drosophila Pupa

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neuroblast Test: Akım Sitometri Kullanımı Farklılaşan Nöral Kök Hücre Döl nöronal Progenitör Hücrelerinin üretilmesi ve zenginleştirilmesi için bir Testi

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

İnsan Fetal Beyin gelen Progenitör-türetilmiş Oligodendrosit Kültür Sistemi

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

İnsan Pluripotent dan Sinir Crest Progenitör Hücreler besleyici ücretsiz Derivasyon Kök Hücre

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modelleme Astrositom Patogenez<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Kortikal Astrositler veya Şartlı, Genetiği fareler ile Nöral Kök Hücreler kullanma

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Yetişkin İnsan Fibroblastları türetilmesi ve Genişletilebilir Sinir Progenitör Hücreler içine Doğrudan Dönüşüm

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Fare Hipokampal Astrositler Seks Farkları sonra<em&gt; In-Vitro</em&gt; İskemi

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modelleme nöronal ölüm ve fare birincil serebellar granül nöronlar dejenerasyon

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Lipidomics and Transcriptomics in Neurological Diseases

Nörolojik Hastalıklarda Lipidomik ve Transkriptomik

Lipids serve as the primary interface to brain insults or stimuli conducive to neurological diseases and are a reservoir for the synthesis of lipids with ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

Fibroblastların ve Schwann Hücrelerinin İn vitro duyusal ve motor sinirlerden arındırması

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...