Name: fluorescence in situ hybridization on dna halo preparations to reveal whole chromosomes, telomeres and gene loci
Uploaded: 2021-03-04T13:30:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci at JoVE.com

نود أن نشكر البروفيسور مايكل بيتنر على الهدية الكريمة لمجسات طلاء ذراع الكروموسوم. تم دعم LG من قبل مشروع EURO-Laminopathies الممول من الاتحاد الأوروبي وصندوق أبحاث Brunel Progeria.

<ol>
	<li>Berezney, R., Coffey, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+nuclear+protein+matrix.">Identification of a nuclear protein matrix.</a> Biochemical Biophysical Research Communications. 60 (4), 1410-1417 (1974).</li><li>Haaf, T., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+ordering+of+YAC+contigs+using+extended+chromatin+and+chromosomes.">High resolution ordering of YAC contigs using extended chromatin and chromosomes.</a> Human Molecular Genetics. 3 (4), 629-633 (1994).</li><li>Parra, I., Windle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+visual+mapping+of+stretched+DNA+by+fluorescent+hybridization.">High resolution visual mapping of stretched DNA by fluorescent hybridization.</a> Nature Genetics. 5 (1), 17-21 (1993).</li><li>Senger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Released+chromatin:+linearized+DNA+for+high+resolution+fluorescence+in+situ+hybridization.">Released chromatin: linearized DNA for high resolution fluorescence in situ hybridization.</a> Human Molecular Genetics. 3 (8), 1275-1280 (1994).</li><li>Florijn, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+DNA+Fiber-FISH+for+genomic+DNA+mapping+and+colour+bar-coding+of+large+genes.">High-resolution DNA Fiber-FISH for genomic DNA mapping and colour bar-coding of large genes.</a> Human Molecular Genetics. 4 (5), 831-836 (1995).</li><li>Elcock, L. S., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+on+DNA+halo+preparations+and+extended+chromatin+fibres.">Fluorescence in situ hybridization on DNA halo preparations and extended chromatin fibres.</a> Methods Molecular Biology. 659, 21-31 (2010).</li><li>Heiskanen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+mapping+by+fiber-FISH.">Visual mapping by fiber-FISH.</a> Genomics. 30 (1), 31-36 (1995).</li><li>Bensimon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+and+sensitive+detection+of+DNA+by+a+moving+interface.">Alignment and sensitive detection of DNA by a moving interface.</a> Science. 265 (5181), 2096-2098 (1994).</li><li>Michalet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+molecular+combing:+stretching+the+whole+human+genome+for+high-resolution+studies.">Dynamic molecular combing: stretching the whole human genome for high-resolution studies.</a> Science. 277 (5331), 1518-1523 (1997).</li><li>Wilson, R. H., Coverley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+DNA+replication+and+the+nuclear+matrix.">Relationship between DNA replication and the nuclear matrix.</a> Genes Cells. 18 (1), 17-31 (2013).</li><li>Wilson, R. H. C., Coverley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation-induced+changes+in+the+DNA-nuclear+matrix+interface,+revealed+by+high-throughput+analysis+of+DNA+halos.">Transformation-induced changes in the DNA-nuclear matrix interface, revealed by high-throughput analysis of DNA halos.</a> Science Reports. 7 (1), 6475 (2017).</li><li>Iarovaia, O. V., Akopov, S. B., Nikolaev, L. G., Sverdlov, E. D., Razin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+transcription+within+chromosomal+DNA+loops+flanked+by+MAR+elements+causes+an+association+of+loop+DNA+with+the+nuclear+matrix.">Induction of transcription within chromosomal DNA loops flanked by MAR elements causes an association of loop DNA with the nuclear matrix.</a> Nucleic Acids Research. 33 (13), 4157-4163 (2005).</li><li>Tandara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+DNA+integrity+testing:+big+halo+is+a+good+predictor+of+embryo+quality+and+pregnancy+after+conventional+IVF.">Sperm DNA integrity testing: big halo is a good predictor of embryo quality and pregnancy after conventional IVF.</a> Andrology. 2 (5), 678-686 (2014).</li><li>Repping, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+spermHALO-FISH+to+determine+DAZ+gene+copy+number.">The use of spermHALO-FISH to determine DAZ gene copy number.</a> Mol Human Reproduction. 9 (4), 183-188 (2003).</li><li>Bikkul, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farnesyltransferase+inhibitor+and+rapamycin+correct+aberrant+genome+organisation+and+decrease+DNA+damage+respectively,+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+fibroblasts.">Farnesyltransferase inhibitor and rapamycin correct aberrant genome organisation and decrease DNA damage respectively, in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts.</a> Biogerontology. 19 (6), 579-602 (2018).</li><li>Telenius, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degenerate+oligonucleotide-primed+PCR:+general+amplification+of+target+DNA+by+a+single+degenerate+primer.">Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer.</a> Genomics. 13 (3), 718-725 (1992).</li><li>Bridger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+pKi-67+with+satellite+DNA+of+the+human+genome+in+early+G1+cells.">Association of pKi-67 with satellite DNA of the human genome in early G1 cells.</a> Chromosome Research. 6, 13-24 (1998).</li><li>Sales Gil, R., Vagnarelli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67:+More+Hidden+behind+a+'Classic+Proliferation+Marker'.">Ki-67: More Hidden behind a 'Classic Proliferation Marker'.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 747-748 (2018).</li><li>Bikkul, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+elongation+through+hTERT+immortalization+leads+to+chromosome+repositioning+in+control+cells+and+genomic+instability+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+fibroblasts,+expressing+a+novel+SUN1+isoform.">Telomere elongation through hTERT immortalization leads to chromosome repositioning in control cells and genomic instability in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts, expressing a novel SUN1 isoform.</a> Genes Chromosomes Cancer. 58 (6), 341-356 (2019).</li><li>Jackson, D. A., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+a+filamentous+nucleoskeleton+with+a+23+nm+axial+repeat.">Visualization of a filamentous nucleoskeleton with a 23 nm axial repeat.</a> EMBO Journal. 7, 3667-3677 (1988).</li><li>Albrethsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+the+nuclear+matrix+proteome.">Unravelling the nuclear matrix proteome.</a> Journal of Proteomics. 72, 71-81 (2009).</li><li>Mika, S., Rost, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMPdb:+Database+of+nuclear+matrix+proteins.">NMPdb: Database of nuclear matrix proteins.</a> Nucleic Acids Research. 33, 160-163 (2005).</li><li>Gavrilov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=of+the+nuclear+matrix-bound+chromatin+hubs+by+a+new+M3C+experimental+procedure.">of the nuclear matrix-bound chromatin hubs by a new M3C experimental procedure.</a> Nucleic Acids Research. 38, 8051-8060 (2010).</li><li>Sjakste, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+nuclear+matrix+proteins+in+malignant+transformation+and+cancer+diagnosis.">Role of the nuclear matrix proteins in malignant transformation and cancer diagnosis.</a> Experimental Oncology. 26 (3), 170-178 (2004).</li><li>Leman, E. S., Getzenberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+structure+as+a+source+of+cancer+specific+biomarkers.">Nuclear structure as a source of cancer specific biomarkers.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 104 (6), 1988-1993 (2008).</li><li>Volpi, E. V., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH+glossary:+an+overview+of+the+fluorescence+in+situ+hybridization+technique.">FISH glossary: an overview of the fluorescence in situ hybridization technique.</a> Biotechniques. 45 (4), 385-386 (2008).</li><li>Bridger, J. M., Foster, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+and+the+Genome.">Senescence and the Genome.</a> Human Interphase Chromosomes. , (2021).</li><li>Foster, H. A., Griffin, D. K., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interphase+chromosome+positioning+in+in+vitro+porcine+cells+and+ex+vivo+porcine+tissues.">Interphase chromosome positioning in in vitro porcine cells and ex vivo porcine tissues.</a> BMC Cell Biology. 13 (1), 30 (2012).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

تعد طريقة هالة الحمض النووي طريقة ممتازة للاختيار عند تحليل التفاعلات بين الهيكل النووي والجينوم ، ومع ذلك ، هناك بعض الخطوات الحاسمة التي يجب الالتزام بها أيضا. واحدة من أهم المعلمات هي تحسين كثافة بذر الخلية. إذا أصبحت الخلايا أكثر من التقارب ، فسوف تتداخل هالات الحمض النووي مع الخلايا المجاورة مما يجعل من المستحيل إجراء التحليل. يجب دائما جعل CSK ومخازن الاستخراج طازجة في يوم الاستخدام مع إضافة spermine و spermidine و digitonin إلى المخزن المؤقت للاستخراج في نهاية عملية التحضير للحفاظ على نشاطها البيولوجي. في حالة إجراء Halo-FISH ، من المهم للغاية استخدام درجة حرارة التمسخ الصحيحة لهالات الحمض النووي لتمكين المسبار أو الطلاء من التهجين لاحقا.
تم استخدام المجهر الإلكتروني لتصور المصفوفة النووية ، مع تحديد الهياكل الخيطية20. ومع ذلك ، فإن المجهر الإلكتروني محدود حيث لا يمكن بسهولة استنتاج ارتباطات المصفوفة مع الكروماتين. في الواقع ، تعد طريقة DNA Halo أكثر تنوعا مقارنة بالمجهر الإلكتروني حيث يمكن فحص جينات وكروموسومات وحالات خلايا معينة. علاوة على ذلك ، تتم دراسة التحليل البروتيني لبروتينات المصفوفة النووية21,22. هذه الطريقة جيدة لمقارنة مكونات المصفوفة النووية ، خاصة عند مقارنة الخلايا المريضة ، ومع ذلك ، فهي لا توفر التوزيع المكاني والمرفقات التي أبرزتها تقنية DNA Halo القياسية.
مقايسات هالة الحمض النووي لها حدود. أولا ، عند استخراج المصفوفة ، لا يمكن إجراء ذلك إلا على خلايا ثابتة ، لذا لا يمكن التصوير الحي. على الرغم من أن طريقة DNA Halo سريعة نسبيا وسهلة الأداء ، إلا أن العملية الإجمالية قد تستغرق وقتا طويلا عندما يتم أخذ زراعة الخلايا وتوليد المسبار و Halo-FISH والتحليل في الاعتبار.
من شأن التقاط صور لهالات الحمض النووي و HALO-FISH باستخدام الفحص المجهري فائق الدقة أن يحسن بشكل كبير من دقة المجسات والأجسام المضادة الخاصة بالحمض النووي. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأنه يمكن حل الفلوروكرومات بسهولة أكبر طيفيا ، فقد يكون من الممكن استخدام عدد من مجسات الحمض النووي في تجربة واحدة ، مما يوفر المزيد من المعلومات. تم استخدام التحسينات في تقنيات البيولوجيا الجزيئية مثل التقاط تشكل الكروموسوم (3C) لتحديد تفاعلات مواقع الجينات وتحليل التنظيم المكاني على الكروماتين في الخلية. يمكن الجمع بين فحوصات DNA Halo و 3C ، وهو مصطلح يعرف باسم M3C23 ، مما يدل مرة أخرى على قابلية التكيف لتقنية DNA Halo.
البيانات الأصلية المقدمة هنا هي لتوضيح إمكانيات استجواب سلوك الجينوم وكيفية تقديم تلك البيانات. من خلال هذه البيانات ، أثبتنا أنه من الممكن تحديد اختلافات كبيرة في ارتباط الجينوم باستخدام (1) مجسات طلاء الكروموسوم ، في هذه الدراسة التي تكشف أن الكروموسوم 18 هو أقل كروموسوم مرتبط من بين تلك التي تم تحليلها (الشكل 3) ؛ (2) مواضع الجينات ذات الاختلافات الكبيرة بين موقعين جينيين و (الشكل 4) (3) التيلوميرات ، والتي تكون أقل ارتباطا بقوة في الخلايا الهادئة مقارنة بالخلايا المتكاثرة والشيخوخة (الشكل 5). نحن قادرون على التمييز بين الخلايا المتكاثرة وغير المتكاثرة من خلال وجود مستضد Ki67 لعلامة الانتشار وهو بروتين غير قابل للذوبان لذلك يبقى مع النوى المتبقية أو باستخدام دمج النيوكليوتيدات لتسليط الضوء على الخلايا التي مرت بالطور S خلال فترة زمنية محددة (الشكل 2). لقد مكنتنا هذه التقنية أيضا من تحليل سلوك الجينوم في الخلايا التي تتعرض للخطر في هياكلها النووية ، أي خلايا اعتلال الصفيحة ، وهنا وفي Bikkul et al. ، 2018 ، نكشف أن الجينوم يمكن أن يكون أقل ارتباطا بإحكام عند مقارنته بالخلايا الضابطة ويمكن استعادته عند التعامل مع أدوية معينة تعمل على تحسين تأثير طفرة lamin A في خلايا HGPS الكلاسيكية15. ومع ذلك ، نعرض بيانات جديدة هنا لخلايا HGPS AGO8466 غير النمطية ، التي تفتقر إلى طفرة lamin A ولكنها تحتوي على شكل غير عادي من بروتين LINC المركب SUN1 19 الذي يكون الكروموسوم13 أقل ارتباطا به (الشكل 6).
HALO-FISH هي طريقة فريدة من نوعها من خلال تمكين دراسة التفاعلات الجينومية مع الهيكل النووي بالاشتراك مع التألق المناعي غير المباشر لحل البروتينات التي لم تتم إزالتها من إجراء الاستخراج. لقد ثبت أن الهيكل النووي يتم تعديله في أمراض مختلفة مثل بعض أنواع السرطان19 وأهمية بعض البروتينات المرتبطة بالهيكل النووي كمؤشرات حيوية تشخيصية24,25. وبالتالي ، فإن هذه التقنية لها دور مهم في فحص تأثير الهيكل النووي على تنظيم / عدم تنظيم الكروماتين في المرض15،24،25،27 ولا تقتصر على الخلايا البشرية ، مع مجسات اللوحة الكروموسومية من الحيوانات الأخرى ، يمكن استخدام نفس بروتوكول الحمض النووي - الهالة 28.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated from:
Lauren S. Godwin1 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire
to:
Lauren S. Godwin1 
Emily Roberts2 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

تم وصف "المصفوفة النووية" لأول مرة من قبل بيريزني وكوفي في عام 19741. بعد إجراء عمليات الاستخراج ذات المولاريات عالية الملح ومعالجة النيوكلياز على نوى كبد الفئران ، حددوا إطارا هيكليا بروتينيا. تم تكييف إجراء هالة الحمض النووي لاحقا من هذه الطريقة ويتضمن إزالة البروتينات القابلة للذوبان بحيث تستمر فقط المصفوفة النووية (NM) والبروتينات والكروموسومات المرتبطة ب NM. تقع مناطق ارتباط الحمض النووي في قاعدة حلقات الحمض النووي وتسمى المناطق المرفقة بالمصفوفة (MARs) أو مناطق ارتباط السقالة (SARs) ، والتي تقاوم الاستخراج بتركيزات عالية من الملح والمنظفات الأيونية ليثيوم 3،5-ديودوساليسيلات (LIS) على التوالي. في هالات الحمض النووي ، يرتبط الحمض النووي المرتبط ب MARs / SARs داخل النواة المتبقية بينما تمتد حلقات الحمض النووي بعيدا عن هذه المواقع وتشكل هالة الحمض النووي. نحن نعلم الآن أن الجينوم يرتكز عبر المجالات المرتبطة بالصفيحة (LADs) إلى الصفيحة النووية ومن خلال المناطق المرتبطة بالنوى (NADs) وربما من خلال الهياكل النووية الأخرى مثل الأجسام النووية المحددة.
يمكن استخدام طريقة هالة الحمض النووي لرسم الخرائط الفيزيائية للحمض النووي والجينات ومناطق الكروموسومات حيث يوفر الحمض النووي الممتد والكروماتين دقة أكبر لأن الكروماتين يتم تجريده من الهستونات ويتم تمديد الحمض النووي2،3،4،5،6. ومع ذلك ، هناك بعض القيود عند استخدام هالات الحمض النووي لهذا التطبيق. على سبيل المثال ، يمكن أن يكون الحمض النووي المرتبط ارتباطا وثيقا بالنوى المتبقية من هالات الحمض النووي غير قابل للوصول إلى المجسات مما يمنعه من التحليل ورسم الخرائط الفيزيائية6. تقنيات أخرى مثل fiber-FISH2،4،5،7 والتمشيط الجزيئي8 تتيح أيضا رسم الخرائط المادية وتتمتع بميزة كونها سريعة نسبيا وسهلة الأداء. كلاهما يستخدم بشكل تفضيلي لرسم خرائط الحمض النووي للجينات عبر هالات الحمض النووي. تستخرج هذه الطرق ألياف الكروماتين عن طريق استخدام المذيبات أو استخراج الملح من النواة ، ومع ذلك ، يميل التمشيط الجزيئي إلى أن يكون له قابلية استنساخ أفضل 8,9.
هناك أدلة متزايدة على أن الهيكل النووي له دور في دعم العمليات النووية الرئيسية ، مثل مواقع التعلق بالحمض النووي ، وإعادة تشكيل الكروماتين ، ونسخ الحمض النووي ، وإصلاح الحمض النووي ، وتكرار الحمض النووي11,12. على هذا النحو ، تم تطوير تقنية هالة الحمض النووي للتحقيق في التفاعلات بين الهيكل النووي والجينوم خلال هذه الأنشطة الخلوية وتم استخدامها بشكل روتيني والإبلاغ عنها في الأبحاث. كما تم استخدام هذه التقنية للتحقيق في التفاعلات بين الجينوم والهيكل النووي فيما يتعلق بتطور المرض مع تحديد التغيرات المرتبطة بالأورام الخبيثة في البنية النووية11.
كما تم استخدام تقنية هالة الحمض النووي للتحقيق في العلاقة بين الجينوم والهيكل النووي أثناء التطور والتمايز12. استخدم عدد من الدراسات تباينا في تقنية هالة الحمض النووي المعروفة باسم halosperm13 أو SpermHalo-FISH إذا اقترنت ب FISH14. يرتبط كروماتين الحيوانات المنوية ارتباطا وثيقا بالبروتينات المعروفة باسم البروتامين وقد تم تطوير هذه التقنية لتحسين الوصول إلى الحمض النووي للحيوانات المنوية. تم استخدام Halosperm للتحقق من سلامة الحمض النووي للحيوانات المنوية وتحديد ما إذا كان هناك تلف في الحمض النووي. ترتبط الحيوانات المنوية ذات الضرر الأقل في الحمض النووي بحجم هالة أكبر للحمض النووي ، في حين أن الحيوانات المنوية ذات المستويات المتزايدة من الحمض النووي المجزأ والتالف تحتوي إما على هالات صغيرة أو لا شيء على الإطلاق. وبالتالي ، يمكن استخدام هالوزبيرم البذور كعلامة تنبؤية محتملة لجودة الجنين والحمل الناجح مع التلقيح الاصطناعي13. يؤكد هذا المثال على التطبيقات السريرية المحتملة لهذه التقنية. في عملنا ، استخدمنا HALO-FISH لتقييم التغيرات في سلوك الجينوم وتأثير علاجات دوائية محددة في مرض الشيخوخة المبكرة متلازمة هتشينسون جيلفورد بروجيريا (HGPS)15.
تسلط هذه الدراسات وغيرها الضوء على اتساع نطاق العمليات / التطبيقات التي يمكن استخدام تقنية هالة الحمض النووي لدراستها وفائدتها.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10388739</td>
			<td>Used to create DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-2&#8242;-deoxy-uridine&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5002-100MG</td>
			<td>Labelled nucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503-100MG</td>
			<td>Labelled nucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Technical</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15562141</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A939-50G</td>
			<td>Check product size of DOP-PCR and nick translation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atypical type 2 HGPS fibroblasts (AG08466)</td>
			<td>Coriell Institute</td>
			<td>AG08466</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16269751</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-16-dUTP</td>
			<td>Roche Diagnostics&#160;</td>
			<td>11093711103</td>
			<td>Labelled nucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378-25G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Classical Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) fibroblasts (AG06297)&#160;</td>
			<td>Coriell Institute</td>
			<td>AG0297</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12608596</td>
			<td>Holds 5 slides or 8 slides back to back</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cot-1 DNA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15279011</td>
			<td>Block nonspecific hybridization in HALO FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>693520-1L</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4030</td>
			<td>Hybridisation mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D141</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-dUTP&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11093088910</td>
			<td>Labelled nucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Cy3</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>443611</td>
			<td>Probe precipitation and HALO FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Cell culture serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10523525</td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18421</td>
			<td>Spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herring sperm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7290</td>
			<td>Probe precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HXP&#8482; Lamp (metal halide microscope lamp)</td>
			<td>OSRAM</td>
			<td>HXP-R120W45C VIS</td>
			<td>Image capture of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10313680</td>
			<td>Cleaning microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516-25ML</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi PCR Kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK2103</td>
			<td>PCR Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM4000 fluorescent microscope with DFC365 FX camera and LAS AF (Version: 4.5.0) image acquisition software.</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Image capture of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani agar&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13274843</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Component of CSK buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10284580</td>
			<td>Cleaning and sterilizing microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-BrdU antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>B2531-100UL</td>
			<td>BrdU visualisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn calf serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16010159</td>
			<td>Cell culture serum and blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nick translation kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR grade water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>693520-1L</td>
			<td>PCR and DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1851</td>
			<td>Component of CSK and extraction buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190-100G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadriPERM&#174; 4 X 12</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>94.6077.307</td>
			<td>Square cell culture dish, polysterene with four compartments.&#160; This has hydrophobic surface, is sterile, non-pyrogenic/endotoxin-fee and non-cytotoxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Ki67 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ZRB1007-25UL</td>
			<td>Proliferation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6513</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber cement</td>
			<td>Halford&#39;s</td>
			<td>101836</td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-50</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6022-25G</td>
			<td>Spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Probe precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>Component of CSK, extraction and SSC buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8532</td>
			<td>Component of SSC buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate&#160;</td>
			<td></td>
			<td>L3771-100G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4264</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Cy3&#160;</td>
			<td>Amersham Life Sciences Ltd, Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>pa43001</td>
			<td>Probe antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>Component of CSK buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>CSK buffer+A66:D68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost&#8482; microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12372098</td>
			<td>Microscope slides: 1 mm thickness, 76 mm length, 26 mm width. Uncoated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swine anti-rabbit TRITC&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TELO-PNA FISH KIT</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>K532511-8</td>
			<td>Delineation of telomeres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253-100G</td>
			<td>Column buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>Component of CSK buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10158962</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416- 100ML</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mountant containing DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole human chromosome probes</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td></td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10108202</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence in situ hybridization on dna halo preparations to reveal whole chromosomes, telomeres and gene loci

يرتبط الجينوم بالعديد من الهياكل داخل نوى الخلية ، من أجل تنظيم نشاطه وتثبيته في مواقع محددة. تعرف هذه التراكيب مجتمعة باسم الهيكل النووي وتشمل الصفيحة النووية والنواة والأجسام النووية. على الرغم من وجود العديد من المتغيرات من التهجين الفلوري في الموقع (FISH) لدراسة الجينوم وتنظيمه ، إلا أنها غالبا ما تكون محدودة بالدقة وتوفر معلومات غير كافية عن ارتباط الجينوم بالهياكل النووية. تستخدم طريقة هالة الحمض النووي تركيزات عالية من الملح والمنظفات غير الأيونية لتوليد حلقات الحمض النووي التي تظل مثبتة على الهياكل داخل النوى من خلال مناطق التعلق داخل الجينوم. هنا ، يتم استخراج البروتينات النووية القابلة للذوبان ، مثل الهستونات والليبيدات والحمض النووي غير المرتبط بإحكام بالمصفوفة النووية. وهذا يؤدي إلى تكوين هالة من الحمض النووي غير المرتبط تحيط بنواة متبقية تحتوي في حد ذاتها على الحمض النووي المرتبط ارتباطا وثيقا بالهياكل النووية الداخلية والبروتينات المقاومة للاستخراج. تتيح خيوط الحمض النووي الممتدة هذه زيادة الدقة ويمكن أن تسهل رسم الخرائط المادية. بالاقتران مع FISH ، تتمتع هذه الطريقة بميزة إضافية تتمثل في دراسة التفاعلات الجينومية مع جميع الهياكل التي يرتكز عليها الجينوم. هذه التقنية ، التي يطلق عليها HALO-FISH ، متعددة الاستخدامات للغاية حيث يمكن أن تقترن هالات الحمض النووي بمجسات الحمض النووي للكشف عن مواقع الجينات والكروموسومات الكاملة وقمر ألفا والتيلوميرات وحتى الحمض النووي الريبي. توفر هذه التقنية نظرة ثاقبة للتنظيم النووي والوظيفة في الخلايا الطبيعية وفي تطور المرض كما هو الحال مع السرطان.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci at JoVE.com

Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

يتيح الجمع بين مستحضرات هالة الحمض النووي والتهجين الفلوري في الموقع إجراء تحليل عالي الدقة للتفاعلات الجينومية مع الهيكل النووي. يؤدي الجينوم المرفق إلى إشارات فلورية مهجنة تقع داخل النوى المستخرجة المتبقية ، في حين أن الجينوم غير المرتبط موجود في هالة الحمض النووي المحيطة بالنوى المتبقية.

التهجين الفلوري في الموقع على مستحضرات هالة الحمض النووي للكشف عن الكروموسومات الكاملة والتيلوميرات ومواقع الجينات

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These ...

يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقييم الارتباطات بالهيكل النووي بدلا من استخدام تسلسل DamID ، وهو فحص خلية واحدة. الميزة الرئيسية لاستخدام هذه الطريقة هي أنها فعالة من حيث التكلفة ويمكن الوصول إليها بسهولة. يمكن أن يسلط الضوء على الاختلافات الوظيفية بين الجينات والكروموسومات التي قد لا تحدث عادة مع تقنيات التصور الأخرى.يمكن تقييم المنظمات المكانية والوظيفية داخل الجينوم في خلايا السرطان والبروجيريا المعالجة والاختلافات السلوكية الجينومية في الخلايا الهرمة باستخدام هذا البروتوكول. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي نوع من الخلايا أو الأنسجة عبر العمر وأي مرض. يمكن استخدامه أيضا في الكائنات الحية النموذجية حيث تتوفر المجسات.للبدء ، تحضير 500 ملليلتر من حمض الهيدروكلوريك 10 ٪ وصبها في دورق كبير. إسقاط الشرائح المجهر بشكل فردي في الحمض واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على شاكر تعيين إلى اثنين G.صب الحمض من دورق وغسل الشرائح 10 مرات في ماء الصنبور. ثم 10 مرات أخرى في الماء منزوع الأيونات.شطف الشرائح في الميثانول مرتين والاحتفاظ بها في الميثانول حتى التعقيم. ضع الشرائح على منشفة ورقية لتجف ولفها بورق القصدير للتعقيم في الأوتوكلاف أو الفرن الساخن. تنمو الخلايا في الوسط المناسب مع المصل لمدة 48 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى يتم الوصول إلى التقاء 60 إلى 70٪.احصد كل نوع من الخلايا وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم. بذرة واحدة في 10 إلى الخلايا الخمس في 10 ملليلتر من الوسط لكل شريحة. قم بإزالة طبق الثقافة الذي يحتوي على الشرائح والخلايا المرفقة من الحاضنة.تجاهل الوسيط وقم بتسمية الشرائح باستخدام قلم رصاص. ثم ضعها في وعاء كوبلين يحتوي على 50 مل من المخزن المؤقت للهيكل الخلوي البارد الجليدي. احتضان الجرة لمدة 15 دقيقة على الجليد أو عند أربع درجات مئوية.تخلص من المخزن المؤقت للهيكل الخلوي واشطف الشرائح بسرعة في 50 ملليلترا من محلول هالة الحمض النووي لمرة واحدة ثلاث مرات عن طريق غمسها في جرة كوبلين مع المخزن المؤقت. نقل الشرائح إلى جرة كوبلين تحتوي على 50 مل من العازلة استخراج واحتضان لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم احتضان الشرائح على التوالي في 50 ملليلتر من 10 مرات ، خمس مرات ، مرتين ، ومرة واحدة هالة الحمض النووي العازلة لمدة دقيقة واحدة لكل منهما.عند الانتهاء ، اغمس الشرائح من خلال سلسلة إيثانول متسلسلة من الإيثانول 10 و 30 و 70 و 95٪. خذ الشرائح من خلال سلسلة متسلسلة من الإيثانول 50 ملليلتر من الإيثانول 70 و 90 و 100٪ لمدة خمس دقائق لكل منها. جففها بالهواء على طبق دافئ.ثم تخبز في فرن 70 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. قم بتشويه الشرائح عن طريق وضعها في 70٪ فورماميد مرتين محلول SSC لمدة دقيقتين عند 70 درجة مئوية. ضع الشرائح المشوهة في 50 ملليلتر من الثلج البارد 70٪ إيثانول لمدة خمس دقائق.ثم حركها عبر سلسلة إيثانول من 90 و 95 و 100٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق لكل منها. عند الانتهاء ، جفف الشرائح في الهواء على لوحة الاحتماء. قم بتشويه مجسات الحمض النووي عند 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في كتلة ساخنة أو حمام مائي.ثم احتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل سحب 10 ميكرولتر على الشريحة المناسبة. قم بتراكب المسبار بغطاء 21 × 21 ملم وختمه بالأسمنت المطاطي. احتضان الشرائح لمدة لا تقل عن 18 ساعة عند 37 درجة مئوية في غرفة تهجين مرطبة.بعد الحضانة ، قم بإزالة الأسمنت المطاطي بعناية بالملقط. ثم احتضان الشرائح في 50 ملليلتر من محلول فورماميد 50٪ مرتين SSC عند الرقم الهيدروجيني السابع الذي تم تسخينه مسبقا إلى 45 درجة مئوية لمدة ثلاث حضانات لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، ضع الشرائح في 50 ملليلترا من محلول SSC 0.1 مرة الذي تم تسخينه مسبقا إلى 60 درجة مئوية ، ولكن تم وضعه في حمام مائي 45 درجة مئوية.احتضان لمدة خمس دقائق واستبدال المخزن المؤقت مرتين لحضانة لمدة خمس دقائق. ضع الشرائح في جرة كوبلين تحتوي على 50 مل من محلول SSC أربع مرات في درجة حرارة الغرفة واحتضانها لمدة 15 دقيقة مع ثلاثة تغييرات من المخزن المؤقت. لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة ، ضع 100 ميكرولتر من محلول SSC 4٪ BSA أربع مرات على كل شريحة وقم بتغطيتها بقطعة من فيلم البارافين.احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم احتضان الشرائح مع 100 ميكرولتر من streptavidin Cy3 المخفف واحد في 200 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة للكشف عن التحقيق المسمى. ضع الشرائح في جرة كوبلين تحتوي على 50 مل من محلول SSC أربع مرات في درجة حرارة الغرفة واحتضانها لمدة 15 دقيقة مع ثلاثة تغييرات من المخزن المؤقت.قم بتركيب الشرائح في 20 ميكرولترا من محلول تركيب يحتوي على DAPI وتراكب مع غطاء 22 × 50 ملم. تصور هالات الحمض النووي ومناطق الكروموسوم باستخدام مجهر التألق مع هدف زيت 100X. يتيح تحضير هالة الحمض النووي رؤية حافة النواة المتبقية ، والحمض النووي المتبقي داخل النواة المتبقية ، والحمض النووي غير المرتبط الذي تم تخزينه في المنطقة المحيطة.تم إنشاء هالات الحمض النووي للخلايا الليفية الجلدية البشرية المتكاثرة من الخلايا ذات BRDU المدمجة ثم تلطخت لاحقا بالأجسام المضادة المضادة ل BRDU. كانت الخلايا المتكاثرة إيجابية ل BRDU ومضاد pKi-67. تم استخدام هذا البروتوكول لتصور مناطق الكروموسوم داخل هالات الحمض النووي.تم تمييز الكروموسومات الفردية بمجسات طلاء كروموسوم الذراع الكاملة المحددة للكروموسومات 1 و 13 و 17 و 18. تم استخدام Anti-pKi-67 لتحديد الخلايا المتكاثرة وغيابها داخل نفس الثقافة. يتم عرض مستحضرات هالة الحمض النووي مع التيلوميرات باللون الأخضر هنا.من الممكن ملاحظة نسبة التيلوميرات في هالة الحمض النووي ، خاصة في صورة التجربة الثانية. كان متوسط النسبة المئوية للتيلوميرات حوالي 17٪ في الخلايا الهادئة. تم الكشف عن اختلافات في ارتباط الكروموسوم في الخلايا الليفية الضابطة الأولية وفي الخلايا المريضة المصابة بمتلازمة هتشينسون جيلفورد بروجيريا النموذجية وغير النمطية ، معبرة عن شكل متماثل مختلف من Sun1 ولا توجد طفرة Lamin A.يظهر الكروموسومان واحد و 13 اختلافات ذات دلالة إحصائية في ارتباطهما داخل النوى المتبقية عند مقارنتهما بهالات الحمض النووي الخاضعة للرقابة. ارتبط موضع منطقة الكروموسوم بأكملها بالنواة المتبقية وهالة الحمض النووي. عند محاولة هذا البروتوكول ، تأكد من زرع الخلايا بالكثافة الصحيحة واستخراجها في الوقت المناسب.بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء التألق المناعي غير المباشر و RNA FISH.

Research

JoVE Journal

Biology

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

الجامعة جبل مزدوجة في الموقع التهجين لافراخ الدجاج في وقت مبكر

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

الزرد الجامع جبل الرفيع قرار مزدوج نيون في الموقع التهجين

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

مضان في الموقع التهجين (FISH) البروتوكول في الحيوانات المنوية البشرية

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

جبل به الجامعة في الموقع تهجين ارتباط البيولوجيا الجزيئية والعضوي

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

جبل كله<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين من E8.5 لأجنة الفئران E11.5

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

المشعة في الموقع التهجين، لتحديد متنوعة أنماط التعبير الجيني في الأنسجة

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

الكشف عن الحمض النووي الريبي الفيروسي بواسطة الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

الإنتاجية العالية لرسم الخرائط المادية للالكروموسومات باستخدام الآلي<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

تحليل النسخ الجيني وحيدة الخلية التي كتبها نيون RNA<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...