Name: fluorescence in situ hybridization on dna halo preparations to reveal whole chromosomes, telomeres and gene loci
Uploaded: 2021-03-04T13:30:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci at JoVE.com

Vi vil gerne takke professor Michael Bittner for den venlige gave af kromosomarmmalerisonder. LG blev støttet af det EU-finansierede EURO-Laminopathies-projekt og Brunel Progeria Research Fund.

<ol>
	<li>Berezney, R., Coffey, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+nuclear+protein+matrix.">Identification of a nuclear protein matrix.</a> Biochemical Biophysical Research Communications. 60 (4), 1410-1417 (1974).</li><li>Haaf, T., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+ordering+of+YAC+contigs+using+extended+chromatin+and+chromosomes.">High resolution ordering of YAC contigs using extended chromatin and chromosomes.</a> Human Molecular Genetics. 3 (4), 629-633 (1994).</li><li>Parra, I., Windle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+visual+mapping+of+stretched+DNA+by+fluorescent+hybridization.">High resolution visual mapping of stretched DNA by fluorescent hybridization.</a> Nature Genetics. 5 (1), 17-21 (1993).</li><li>Senger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Released+chromatin:+linearized+DNA+for+high+resolution+fluorescence+in+situ+hybridization.">Released chromatin: linearized DNA for high resolution fluorescence in situ hybridization.</a> Human Molecular Genetics. 3 (8), 1275-1280 (1994).</li><li>Florijn, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+DNA+Fiber-FISH+for+genomic+DNA+mapping+and+colour+bar-coding+of+large+genes.">High-resolution DNA Fiber-FISH for genomic DNA mapping and colour bar-coding of large genes.</a> Human Molecular Genetics. 4 (5), 831-836 (1995).</li><li>Elcock, L. S., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+on+DNA+halo+preparations+and+extended+chromatin+fibres.">Fluorescence in situ hybridization on DNA halo preparations and extended chromatin fibres.</a> Methods Molecular Biology. 659, 21-31 (2010).</li><li>Heiskanen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+mapping+by+fiber-FISH.">Visual mapping by fiber-FISH.</a> Genomics. 30 (1), 31-36 (1995).</li><li>Bensimon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+and+sensitive+detection+of+DNA+by+a+moving+interface.">Alignment and sensitive detection of DNA by a moving interface.</a> Science. 265 (5181), 2096-2098 (1994).</li><li>Michalet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+molecular+combing:+stretching+the+whole+human+genome+for+high-resolution+studies.">Dynamic molecular combing: stretching the whole human genome for high-resolution studies.</a> Science. 277 (5331), 1518-1523 (1997).</li><li>Wilson, R. H., Coverley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+DNA+replication+and+the+nuclear+matrix.">Relationship between DNA replication and the nuclear matrix.</a> Genes Cells. 18 (1), 17-31 (2013).</li><li>Wilson, R. H. C., Coverley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation-induced+changes+in+the+DNA-nuclear+matrix+interface,+revealed+by+high-throughput+analysis+of+DNA+halos.">Transformation-induced changes in the DNA-nuclear matrix interface, revealed by high-throughput analysis of DNA halos.</a> Science Reports. 7 (1), 6475 (2017).</li><li>Iarovaia, O. V., Akopov, S. B., Nikolaev, L. G., Sverdlov, E. D., Razin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+transcription+within+chromosomal+DNA+loops+flanked+by+MAR+elements+causes+an+association+of+loop+DNA+with+the+nuclear+matrix.">Induction of transcription within chromosomal DNA loops flanked by MAR elements causes an association of loop DNA with the nuclear matrix.</a> Nucleic Acids Research. 33 (13), 4157-4163 (2005).</li><li>Tandara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+DNA+integrity+testing:+big+halo+is+a+good+predictor+of+embryo+quality+and+pregnancy+after+conventional+IVF.">Sperm DNA integrity testing: big halo is a good predictor of embryo quality and pregnancy after conventional IVF.</a> Andrology. 2 (5), 678-686 (2014).</li><li>Repping, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+spermHALO-FISH+to+determine+DAZ+gene+copy+number.">The use of spermHALO-FISH to determine DAZ gene copy number.</a> Mol Human Reproduction. 9 (4), 183-188 (2003).</li><li>Bikkul, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farnesyltransferase+inhibitor+and+rapamycin+correct+aberrant+genome+organisation+and+decrease+DNA+damage+respectively,+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+fibroblasts.">Farnesyltransferase inhibitor and rapamycin correct aberrant genome organisation and decrease DNA damage respectively, in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts.</a> Biogerontology. 19 (6), 579-602 (2018).</li><li>Telenius, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degenerate+oligonucleotide-primed+PCR:+general+amplification+of+target+DNA+by+a+single+degenerate+primer.">Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer.</a> Genomics. 13 (3), 718-725 (1992).</li><li>Bridger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+pKi-67+with+satellite+DNA+of+the+human+genome+in+early+G1+cells.">Association of pKi-67 with satellite DNA of the human genome in early G1 cells.</a> Chromosome Research. 6, 13-24 (1998).</li><li>Sales Gil, R., Vagnarelli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67:+More+Hidden+behind+a+'Classic+Proliferation+Marker'.">Ki-67: More Hidden behind a 'Classic Proliferation Marker'.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 747-748 (2018).</li><li>Bikkul, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+elongation+through+hTERT+immortalization+leads+to+chromosome+repositioning+in+control+cells+and+genomic+instability+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+fibroblasts,+expressing+a+novel+SUN1+isoform.">Telomere elongation through hTERT immortalization leads to chromosome repositioning in control cells and genomic instability in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts, expressing a novel SUN1 isoform.</a> Genes Chromosomes Cancer. 58 (6), 341-356 (2019).</li><li>Jackson, D. A., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+a+filamentous+nucleoskeleton+with+a+23+nm+axial+repeat.">Visualization of a filamentous nucleoskeleton with a 23 nm axial repeat.</a> EMBO Journal. 7, 3667-3677 (1988).</li><li>Albrethsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+the+nuclear+matrix+proteome.">Unravelling the nuclear matrix proteome.</a> Journal of Proteomics. 72, 71-81 (2009).</li><li>Mika, S., Rost, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMPdb:+Database+of+nuclear+matrix+proteins.">NMPdb: Database of nuclear matrix proteins.</a> Nucleic Acids Research. 33, 160-163 (2005).</li><li>Gavrilov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=of+the+nuclear+matrix-bound+chromatin+hubs+by+a+new+M3C+experimental+procedure.">of the nuclear matrix-bound chromatin hubs by a new M3C experimental procedure.</a> Nucleic Acids Research. 38, 8051-8060 (2010).</li><li>Sjakste, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+nuclear+matrix+proteins+in+malignant+transformation+and+cancer+diagnosis.">Role of the nuclear matrix proteins in malignant transformation and cancer diagnosis.</a> Experimental Oncology. 26 (3), 170-178 (2004).</li><li>Leman, E. S., Getzenberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+structure+as+a+source+of+cancer+specific+biomarkers.">Nuclear structure as a source of cancer specific biomarkers.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 104 (6), 1988-1993 (2008).</li><li>Volpi, E. V., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH+glossary:+an+overview+of+the+fluorescence+in+situ+hybridization+technique.">FISH glossary: an overview of the fluorescence in situ hybridization technique.</a> Biotechniques. 45 (4), 385-386 (2008).</li><li>Bridger, J. M., Foster, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+and+the+Genome.">Senescence and the Genome.</a> Human Interphase Chromosomes. , (2021).</li><li>Foster, H. A., Griffin, D. K., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interphase+chromosome+positioning+in+in+vitro+porcine+cells+and+ex+vivo+porcine+tissues.">Interphase chromosome positioning in in vitro porcine cells and ex vivo porcine tissues.</a> BMC Cell Biology. 13 (1), 30 (2012).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

DNA-halo-metoden er en fremragende metode til valg ved analyse af interaktioner mellem nukleoskelettet og genomet, men der er nogle kritiske trin, der også skal overholdes. En af de vigtigste parametre er optimeringen af cellesåningstætheden. Hvis celler bliver overflydende, vil DNA-haloerne overlappe med naboceller, hvilket gør det umuligt at udføre analysen. CSK og ekstraktionsbuffere skal altid gøres friske på anvendelsesdagen, idet spermin, spermidin og digitonin tilsættes ekstraktionsbufferen ved afslutningen af fremstillingsprocessen for at opretholde deres biologiske aktivitet. Hvis du udfører Halo-FISH, er det ekstremt vigtigt at bruge den korrekte denatureringstemperatur for DNA-haloerne for at gøre det muligt for sonden eller malingen efterfølgende at hybridisere.
Elektronmikroskopi er blevet brugt til at visualisere den nukleare matrix, hvor filamentøse strukturer identificeres20. Imidlertid er elektronmikroskopi begrænset, da matrixforeninger med kromatin ikke let kan udledes. Faktisk er DNA Halo-metoden mere alsidig sammenlignet med elektronmikroskopi, da specifikke gener, kromosomer og celletilstande alle kan undersøges. Desuden undersøges proteomisk analyse af nukleare matrixproteiner21,22. Denne metode er god til sammenligning af nukleare matrixkomponenter, især når man sammenligner syge celler, men den giver ikke den rumlige fordeling og vedhæftede filer, der fremhæves af standard DNA Halo-teknikken.
DNA Halo-assays har begrænsninger. For det første, da matrixen ekstraheres, kan dette kun udføres på faste celler, så levende billeddannelse er ikke mulig. Selvom DNA Halo-metoden er relativt hurtig og nem at udføre, kan den samlede proces være tidskrævende, når cellekultur, sondegenerering, Halo-FISH og analyse alle tages i betragtning.
Billedoptagelse af DNA-haloer og HALO-FISH ved hjælp af superopløsningsmikroskopi ville i høj grad forbedre opløsningen af DNA-specifikke sonder og antistoffer. Da fluorkromer lettere kan opløses spektralt, kan det desuden være muligt at bruge et antal DNA-sonder i et enkelt eksperiment, hvilket giver endnu mere information. Forbedringer i molekylærbiologiske teknikker såsom kromosom konformation capture (3C) er blevet brugt til at bestemme interaktioner af gen loci og analysere den rumlige organisation på kromatin i cellen. DNA Halo-assays og 3C kan kombineres, et udtryk kendt som M3C23, hvilket igen demonstrerer tilpasningsevnen af DNA Halo-teknikken.
De originale data, der præsenteres her, skal demonstrere mulighederne for genomadfærdsforhør og hvordan man præsenterer disse data. Med disse data har vi vist, at det er muligt at bestemme signifikante forskelle i genombinding ved hjælp af (1) kromosommalingssonder, i denne undersøgelse afslørede kromosom 18 at være det mindst bundne kromosom ud af de analyserede (figur 3); (2) Gen-loci med signifikante forskelle mellem to gen-loci og (figur 4) (3) telomerer, som er mindre stærkt bundet i hvilende celler sammenlignet med prolifererende og senescerende celler (figur 5). Vi er i stand til at skelne mellem prolifererende og ikke-prolifererende celler via tilstedeværelsen af proliferationsmarkøren Ki67-antigenet, som er et uopløseligt protein, så forbliver hos de resterende kerner eller ved hjælp af inkorporering af nukleotider for at fremhæve celler, der har været igennem S-fase inden for en bestemt tidsperiode (figur 2). Denne teknik har også gjort det muligt for os at analysere genomadfærd i celler, der er kompromitteret i deres nukleoskeletoner, dvs. laminopaticeller, og her og i Bikkul et al., 2018 afslører vi, at genomet kan være mindre tæt knyttet sammenlignet med kontrolceller og kan gendannes ved behandling med specifikke lægemidler, der forbedrer effekten af lamin A-mutationen i klassiske HGPS-celler15. Vi viser dog nye data her for de atypiske HGPS AGO8466-celler, der mangler en lamin A-mutation, men indeholder en usædvanlig form af LINC-kompleksproteinet SUN1 19, som kromosom13 er mindre tæt knyttet til (figur 6).
HALO-FISH er en unik metode, der gør det muligt at studere genomiske interaktioner med nukleoskelettet i kombination med indirekte immunfluorescens for at løse proteiner, der ikke fjernes fra ekstraktionsproceduren. Det er blevet påvist, at nukleoskelettet er modificeret i forskellige sygdomme såsom visse kræfttyper19 og betydningen af nogle nukleoskeletassocierede proteiner som diagnostiske biomarkører24,25. Denne teknik har således en vigtig rolle i undersøgelsen af nukleoskelettets virkning på kromatinorganisation/disorganisering i sygdom 15,24,25,27 og er ikke begrænset til humane celler, med kromosommale malersonder fra andre dyr, den samme DNA-halo-protokol kunne anvendes 28.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated from:
Lauren S. Godwin1 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire
to:
Lauren S. Godwin1 
Emily Roberts2 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

Den "nukleare matrix" blev først beskrevet af Berezney og Coffey i 19741. Efter at have udført ekstraktioner med høje saltmolariteter og nukleasebehandling på rotteleverkerner, identificerede de en proteinholdig strukturel ramme. DNA-halo-proceduren blev efterfølgende tilpasset fra denne metode og involverer fjernelse af opløselige proteiner, således at kun den nukleare matrix (NM) og NM-associerede proteiner og kromosomer vedvarer. DNA-bindingsregioner er placeret i bunden af DNA-sløjfer og kaldes matrixbundne regioner (MAR'er) eller stilladsfastgørelsesregioner (SAR'er), som er resistente over for ekstraktion med høje saltkoncentrationer og henholdsvis ionisk vaskemiddel lithium-3,5-diiodosalicylat (LIS). I DNA-haloer er DNA forbundet med MAR'er / SAR'er bundet inden for den resterende kerne, mens DNA-sløjferne strækker sig væk fra disse steder og danner DNA-haloen. Vi ved nu, at genomet er forankret via lamina associerede domæner (LAD'er) til den nukleare lamina og gennem nukleolære associerede regioner (NAD'er) og muligvis gennem andre nukleare strukturer såsom specifikke nukleare legemer.
DNA-halo-metoden kan bruges til fysisk kortlægning af DNA, gener og kromosomale regioner, da det udvidede DNA og kromatin giver en større opløsning, fordi kromatinet strippes for histoner, og DNA'et strækkes ud 2,3,4,5,6. Der er dog nogle begrænsninger, når du bruger DNA-haloer til denne applikation. For eksempel kan DNA, der er tæt forbundet med resterende kerner af DNA-haloer, være utilgængeligt for sonder, hvilket forhindrer det i analyse og fysisk kortlægning6. Andre teknikker som fiber-FISH 2,4,5,7 og molekylær kæmning 8 muliggør også fysisk kortlægning og har fordelen ved at være relativt hurtig og nem at udføre. Begge bruges fortrinsvis til DNA-kortlægning af gener frem for DNA-haloer. Disse metoder ekstraherer kromatinfibre ved anvendelse af opløsningsmiddel- eller saltekstraktioner fra kernen, men molekylær kæmning har tendens til at have bedre reproducerbarhed 8,9.
Der er et stigende bevis for, at nukleoskelettet har en rolle i at understøtte vigtige nukleare processer, såsom fastgørelsessteder for DNA, kromatinmodellering, DNA-transkription, DNA-reparation og DNA-replikation11,12. Som sådan blev DNA-halo-teknikken udviklet til at undersøge interaktionerne mellem nukleoskelettet og genomet under disse cellulære aktiviteter og er rutinemæssigt blevet brugt og rapporteret i forskning. Denne teknik er også blevet brugt til at undersøge interaktioner mellem genomet og nukleoskelettet i forhold til sygdomsprogression med malignitetsassocierede ændringer i nuklear struktur, der identificeres11.
DNA-halo-teknikken er også blevet brugt til at undersøge forholdet mellem genomet og nukleoskelettet under udvikling og differentiering12. En række undersøgelser har brugt en variation af DNA-halo-teknikken kendt som halosperm13 eller SpermHalo-FISH, hvis den kombineres med FISH14. Spermatozokromatin er tæt bundet til proteiner kendt som protamin, og denne teknik blev udviklet for at forbedre adgangen til sæd-DNA. Halosperm er blevet brugt til at undersøge integriteten af spermatozoer DNA og afgøre, om DNA-skader er til stede. Spermatozoer med mindre DNA-skade korrelerer med en større DNA-halostørrelse, mens spermatozoer med øgede niveauer af fragmenteret og beskadiget DNA havde enten små haloer eller slet ingen. Således kan halosperm bruges som en potentiel prognostisk markør for embryokvalitet og vellykket graviditet med IVF13. Dette eksempel understreger de potentielle kliniske anvendelser af denne teknik. I vores arbejde har vi brugt HALO-FISH til at vurdere ændringer i genomadfærd og effekten af specifikke lægemiddelbehandlinger i den for tidligt aldrende sygdom Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome (HGPS)15.
Sammen fremhæver disse og andre undersøgelser bredden af processer/anvendelser, som DNA-halo-teknikken kan bruges til at studere og anvendeligheden af teknikken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10388739</td>
			<td>Used to create DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-2&#8242;-deoxy-uridine&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5002-100MG</td>
			<td>Labelled nucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503-100MG</td>
			<td>Labelled nucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Technical</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15562141</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A939-50G</td>
			<td>Check product size of DOP-PCR and nick translation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atypical type 2 HGPS fibroblasts (AG08466)</td>
			<td>Coriell Institute</td>
			<td>AG08466</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16269751</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-16-dUTP</td>
			<td>Roche Diagnostics&#160;</td>
			<td>11093711103</td>
			<td>Labelled nucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378-25G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Classical Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) fibroblasts (AG06297)&#160;</td>
			<td>Coriell Institute</td>
			<td>AG0297</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12608596</td>
			<td>Holds 5 slides or 8 slides back to back</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cot-1 DNA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15279011</td>
			<td>Block nonspecific hybridization in HALO FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>693520-1L</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4030</td>
			<td>Hybridisation mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D141</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-dUTP&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11093088910</td>
			<td>Labelled nucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Cy3</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>443611</td>
			<td>Probe precipitation and HALO FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Cell culture serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10523525</td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18421</td>
			<td>Spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herring sperm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7290</td>
			<td>Probe precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HXP&#8482; Lamp (metal halide microscope lamp)</td>
			<td>OSRAM</td>
			<td>HXP-R120W45C VIS</td>
			<td>Image capture of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10313680</td>
			<td>Cleaning microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516-25ML</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi PCR Kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK2103</td>
			<td>PCR Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM4000 fluorescent microscope with DFC365 FX camera and LAS AF (Version: 4.5.0) image acquisition software.</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Image capture of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani agar&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13274843</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Component of CSK buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10284580</td>
			<td>Cleaning and sterilizing microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-BrdU antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>B2531-100UL</td>
			<td>BrdU visualisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn calf serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16010159</td>
			<td>Cell culture serum and blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nick translation kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR grade water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>693520-1L</td>
			<td>PCR and DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1851</td>
			<td>Component of CSK and extraction buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190-100G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadriPERM&#174; 4 X 12</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>94.6077.307</td>
			<td>Square cell culture dish, polysterene with four compartments.&#160; This has hydrophobic surface, is sterile, non-pyrogenic/endotoxin-fee and non-cytotoxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Ki67 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ZRB1007-25UL</td>
			<td>Proliferation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6513</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber cement</td>
			<td>Halford&#39;s</td>
			<td>101836</td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-50</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6022-25G</td>
			<td>Spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Probe precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>Component of CSK, extraction and SSC buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8532</td>
			<td>Component of SSC buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate&#160;</td>
			<td></td>
			<td>L3771-100G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4264</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Cy3&#160;</td>
			<td>Amersham Life Sciences Ltd, Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>pa43001</td>
			<td>Probe antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>Component of CSK buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>CSK buffer+A66:D68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost&#8482; microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12372098</td>
			<td>Microscope slides: 1 mm thickness, 76 mm length, 26 mm width. Uncoated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swine anti-rabbit TRITC&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TELO-PNA FISH KIT</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>K532511-8</td>
			<td>Delineation of telomeres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253-100G</td>
			<td>Column buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>Component of CSK buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10158962</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416- 100ML</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mountant containing DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole human chromosome probes</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td></td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10108202</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence in situ hybridization on dna halo preparations to reveal whole chromosomes, telomeres and gene loci

Genomet er forbundet med flere strukturer inde i cellekerner for at regulere dets aktivitet og forankre det på bestemte steder. Disse strukturer er kollektivt kendt som nukleoskeletet og omfatter den nukleare lamina, nukleolerne og nukleare organer. Selvom der findes mange varianter af fluorescens in situ hybridisering (FISH) for at studere genomet og dets organisation, er disse ofte begrænset af opløsning og giver utilstrækkelig information om genomets tilknytning til nukleare strukturer. DNA-halo-metoden bruger høje saltkoncentrationer og ikke-ioniske vaskemidler til at generere DNA-sløjfer, der forbliver forankret til strukturer i kerner gennem tilknytningsregioner i genomet. Her ekstraheres opløselige nukleare proteiner, såsom histoner, lipider og DNA, der ikke er tæt bundet til den nukleare matrix. Dette fører til dannelsen af en halo af ikke-bundet DNA, der omgiver en resterende kerne, som selv indeholder DNA tæt forbundet med interne nukleare strukturer og ekstraktionsresistente proteiner. Disse udvidede DNA-strenge muliggør øget opløsning og kan lette fysisk kortlægning. I kombination med FISH har denne metode den ekstra fordel, at den studerer genomiske interaktioner med alle de strukturer, som genomet er forankret af. Denne teknik, kaldet HALO-FISH, er meget alsidig, hvorved DNA-haloer kan kobles med nukleinsyresonder for at afsløre genloci, hele kromosomer, alfa-satellit, telomerer og endda RNA. Denne teknik giver et indblik i nuklear organisation og funktion i normale celler og i sygdomsprogression som ved kræft.

Denne metode til DNA-haloforberedelse har hjulpet os i vores bestræbelser på at bestemme forskelle i genomadfærd inden for unge og gamle celler, men også i celler afledt af for tidlige aldringssygdomme med afvigende nukleoskeletale proteiner15. Figur 1 viser eksempler på DNA-haloer, hvor det er muligt at se kanten af en restkerne, DNA'et, der forbliver i den resterende kerne, og det ikke-bundne DNA, der er spoleret ud i det omkringliggende område og skaber en DNA-halo. Det viser også analysen, der viser, hvordan restkernen opnås og NE- og CTE-målingerne. Det er muligt at skelne mellem prolifererende og ikke-prolifererende celler ved enten at inkorporere et mærket nukleotid, såsom BrdU, når celler er i S-fase eller anvende den diagnostiske proliferationsmarkør anti-pKi67, som afslører nukleoler, og regioner af heterochromatin i G1-celler17,18. Primære celler dyrket i højt serum uden at opnå sammenløb, der er negative for proliferationsmarkørerne, antages at være senescerende. Primære celler dyrket i lavt serum eller er blevet sammenflydende, dvs. kontakthæmmede, der er negative for proliferationsmarkørerne, anses for hvilende og ville være i stand til at komme ind i den proliferative cellecyklus igen givet de korrekte næringsstoffer og situation. At være i stand til at skelne mellem Ki67 positive og negative celler har gjort det muligt for os at bestemme forskelle mellem spredende, hvilende og senescerende humane dermale fibroblaster. Figur 2 viser DNA-haloer af prolifererende humane dermale fibroblaster skabt af celler, hvor BrdU blev inkorporeret i dem under DNA-replikation, en mekanisme, der ikke forekommer i ikke-prolifererende celler og efterfølgende farvet med anti-BrdU-antistof. Farvning med det proliferative markør anti-pKi67-antistof er også synligt i figur 2. Dette er et robust antigen og overlever FISH-protokollen og kan derfor farves til post-FISH og formontering. Således er prolifererende celler positive (røde) for BrdU og anti-pKi67 (røde) i venstre kolonne og ikke-prolifererende celler, faktisk vises senescerende celler i figur 2 i højre kolonne. De grønne signaler er individuelle telomerer, der afsløres med et telomer PNA FISH/FITC-sæt. Kombination af immunfluorescens med DNA-haloer muliggør analyse under forskellige celletilstande, som vist i figur 2, når man undersøger proliferationerende, hvilende og senescerende celler. Afhængigt af det valgte antistof kan andre betingelser undersøges, såsom differentiering, DNA-skade via bestråling osv.
Kromosomområder kan også visualiseres inden for DNA-haloer ved hjælp af FISH. På grund af præparatet, der tillader spolering af DNA ud af kernerne, kan kromosomets territoriesform forstyrres, med mindre eller større mængder af kromosomet, der findes i DNA-haloen, afhængigt af forankringen af genomet inde i den resterende kerne og dens strukturer. Figur 3 afslører et panel af DNA-haloer, hvorved individuelle kromosomer er blevet afsløret med specifikke helarmskromosommalingssonder (røde) for kromosomer 1, 13, 17 og 18. Anti-pKi67 (grøn) er blevet brugt til at markere prolifererende celler og dets fravær inden for samme kultur på det samme dias, der betegner senescerende celler. Det fremgår meget tydeligt af billederne og de data, der præsenteres som CTE/NE, at det lille genfattige kromosom 18 er et kromosom, der har få bindinger og spoler længere ud i DNA-haloen væk fra restkernerne og er signifikant længere væk fra midten af restkernerne end de andre kromosomer. Dette gælder dog også for kromosom 1. Ved hjælp af proliferativ markør anti-pKi67 har det også været muligt at sammenligne formering med senescerende celler inden for samme kultur og på samme dias, og denne analyse har afsløret, at kromosomer inden for disse to meget forskellige cellestatusser ikke er signifikant forskellige fra hinanden med hensyn til binding med de resterende nukleare strukturer.
Interessant nok viser gener også statistisk signifikante forskelle mellem prolifererende og senescerende celler med hensyn til at forblive inden for en resterende kerne eller være placeret i DNA-haloen. Figur 4 viser dette med gen-loci afgrænset af mærkede BAC-sonder i rødt og anti-Ki67 i grønt. Der er ingen signifikante forskelle mellem genplaceringer i de prolifererende versus de senescerende celler efter et DNA Halo-præparat. Der er dog betydeligt flere catenin alpha 1 CTNNA1 loci inden for DNA-haloen end cyclin D1 CNDD1 loci, hvor der er meget få. Figur 5 viser DNA-halopræparater med telomerer i grønt. Baggrunden efterlades bevidst høj for at gøre det muligt at visualisere telomersignaler i DNA-haloen. I dette sæt data hvilende celler, dvs. celler, der har været serum sultet i 7 dage, er inkluderet, og interessant nok er der signifikant flere telomerer, der ikke er fastgjort og placeret i DNA-haloerne i hvilende celler end for prolifererende og senescerende celler. I figur 5a kan andelen af telomerer i DNA-haloen observeres, især for billedet 'Eksperiment 2'. Dette svarer til figur 5b , hvor den gennemsnitlige procentdel af telomerer i DNA-halo er ca. 17% i hvilende celler. Der er nogle tegn på, at ikke alle telomerer i senescerende celler kan ses, da nogle af dem måske er meget korte.
Denne metode til DNA-halo har været vellykket for os at undersøge genominteraktionsændringer i kerner i syge celler15. Figur 6 viser forskelle i kromosombinding i primære kontrolfibroblaster og i syge celler med typisk (lamin A-mutation) og atypisk Hutchinson-Gilford Progeria-syndrom, der udtrykker en anden SUN1-isoform og ingen lamin A-mutation19. Kromosomerne 1 og 13 viser statistisk signifikante forskelle i deres binding inden for de resterende kerner sammenlignet med kontrol-DNA-haloer. Figur 6b korrelerer placeringen af hele kromosomområdet med restkernen og DNA-haloen. Værdier på 1 eller mindre angiver, at kromosomet er placeret inden for den resterende kerne, og værdier over 1 demonstrerer kromosomer eller dele af kromosomer i DNA-haloen.
Samlet set fremhæver dette nytten af HALO-FISH til at undersøge genomiske interaktioner mellem hele kromosomer, specifikke gener og telomerer under en række forhold, der påvirker cellecyklussen (proliferation, hviletilstand og ældning) eller inden for sygdomsceller, f.eks. progeria og kræftcellelinjer. Faktisk indebærer forskellene i interaktioner mellem disse tilstande, at nukleoskeletet har en vigtig rolle i reguleringen af nøgleprocesser i kernen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig01.jpg"> Figur 1: HDF-ekstraheret kerne, der viser restkernen og DNA-haloen og oversigt over analysemetode. a) En HDF-kerne fremstillet ved hjælp af DNA-haloanalyse og modfarvet med DAPI. Den farvestrålende restkerne viser DNA forankret til nukleoskelettet, og dette er omgivet af det ikke-bundne DNA, der danner en glorie af DNA. Forstørrelse = x 100; skalabjælke 10 μm. (b) Den blå kanal fanger den DAPI-farvede kerne og omgivende DNA. Den resterende kerne vælges og fjernes ved hjælp af ImageJ. Pilen viser afstanden fra kernecentret til den resterende nukleare kant (NE). c) Den røde kanal viser sondesignalet. d) Billedet med betegnelsen »resultat« er resultatet af at lægge den røde kanal oven på billedet af den blå kanal. dette tillader afstanden fra kernecentret til den fjerneste kromosomområdekant (CTE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig02.jpg"> Figur 2: DNA-halopræparat med telomer PNA FISH på prolifererende og senescerende HDF'er. Telomere PNA FISH på HDF'er udsat for DNA-halo-assay. Telomersignaler visualiseres i grønt (FITC), rest- og halo-DNA blev modfarvet ved hjælp af DAPI (blå), og prolifererende kerner blev detekteret ved hjælp af enten anti-BrdU- eller anti-pKi67-antistoffer via indirekte immunfluorescens i rødt (TRITC). Forstørrelse = x 100; skalabjælke 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig03.jpg"> Figur 3: Nukleoskelet-kromosominteraktioner og analyse ved hjælp af DNA-halo-assay. a) 2D-FISH med sonder, der er specifikke for kromosomerne 1, 13, 15, 17 og 18, blev udført på HDF'er, der blev underkastet DNA-halo-præparation. Hele kromosomer blev malet i rødt (Cy3), og kerner blev undersøgt med pKi67 for at afgøre, om de spredte sig eller var senescerende. Prolifererende celler (pKi67+) blev afgrænset i grønt (FITC), mens senescerende celler forblev ufarvede (pKi67-), dvs. intet grønt signal detekteret. Forstørrelse = x 100; skalabjælke 10 μm. b) Nukleoskelettets kromosomforankring i syd- og senescerende HDF'er, der har gennemgået HALO-FISH. Målinger viser forholdet mellem den fjerneste kromosomkant (CTE) og respektive nukleare kant (NE) for kromosomer 1, 13, 15, 17 og 18 i prolifererende (pKi67+) og senescerende (pKi67-) celler. Fejlbjælker repræsenterer ± SEM. (c) Modificeret boksplotrepræsentation af kromosomterritoriekant (CTE) til respektive kernekant (NE) af specifikke kromosomer i pKi67+ og pKi67- kerner. Q1 = nedre kvartil; Min = laveste registrerede værdi Med = median; Max = registreret maksimalværdi Q3 = øvre kvartil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig04.jpg"> Figur 4: Genspecifikke interaktioner i HDF'er ved hjælp af HALO-FISH. a) DNA-halo-ekstraherede kerner blev undersøgt med genspecifikke sonder (CCND1 og CTNNA1) for at undersøge deres forankring til NM på prolifererende og senescerende celler. Gensignalerne vises med rødt (Cy3), og anti-pKi67 viser celler, der formerer sig, og signalet visualiseres i grønt (FITC). For det prolifererende CCND1-billede er den resterende kerne indesluttet i den hvide cirkel, og mellemrummet mellem den hvide og grønne cirkel viser DNA-haloen. Forstørrelse = x 100; skalabjælke 10 μm. (b) Genspecifikke signaler for CCND1 og CTNNA1 sammenlignes mellem restkernen og DNA-haloen og også mellem prolifererende og senescerende celler. Fejlbjælker repræsenterer ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig05.jpg"> Figur 5: DNA-halo-analyse på hvilende HDF'er undersøgt med telomer PNA-FISH. (a) Hviletilstand for HDF blev induceret ved dyrkning i lavt serummedium i 7 dage. DNA-halo-analysen blev udført, og PNA-FISH muliggjorde visualisering af telomerer ved hjælp af FITC-signal (grøn), og den resterende kerne og omgivende DNA-halo blev modfarvet med DAPI (blå). Celler blev også farvet med anti-pKi67-antistof for at sikre, at kerner ikke spredte sig. Dette blev gentaget ved to separate lejligheder. Forstørrelse = x 100; skalabjælke 10 μm. (b) Sammenligning af den gennemsnitlige procentdel af telomerer lokaliseret i DNA-haloen i spredende, senescerende og hvilende HDF-celler. Fejlbjælker repræsenterer ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig06.jpg"> Figur 6: Undersøgelse af hele kromosomforankring til nukleoskelettet i HGPS-celler ved hjælp af HALO-FISH26. a) Kontrolkerner af HDF (2DD), klassisk HGPS (AG06297) og atypisk type 2 HGPS (AG08466) gennemgik DNA-halo-forberedelse og derefter 2D-FISH ved hjælp af hele kromosommalinger til kromosom 1, 13, 15 og 17. Hele kromosomer er afbildet i grønt (FITC), og DNA blev modfarvet med DAPI (blå). Forstørrelse = x 100; skalabjælke 10 μm. (b) Placeringen af kromosomer i ekstraherede kerner blev bestemt ved at måle forholdet mellem den gennemsnitlige kromosomområdekant (CTE) og kernekanten (NE). Et forhold over 1 viser, at den fjerneste CTE ligger uden for den tilsvarende NE inden for DNA-haloen, mens et forhold under 1 betyder, at den fjerneste CTE ligger inden for NE inden for den resterende kerne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Vælgere</td>
			<td>Volumen(μL)</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>5XDOP-PCRbuffer</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>dNTPmix (udenTTP) (2mM)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>dTTP(2mM)</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Biotin-16-dUTPorDigoxigenin-11-dUTP</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>DOPprimer(20μM)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>TaqDNAPolymerase(1U/μL)</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>PCRgradewater</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td>Skabelon</td>
			<td>5</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Tabel, der viser DOP-PCR-komponenter og volumener for en 1x reaktion
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Skridt</td>
			<td>Cykler</td>
			<td>Temp (grad Celsius)</td>
			<td>Tidspunkt</td>
		</tr><tr><td>Indledende denaturering</td>
			<td>1</td>
			<td>95</td>
			<td>3 minutter</td>
		</tr><tr><td>Denaturering</td>
			<td rowspan="3">34</td>
			<td>98</td>
			<td>20 sek.</td>
		</tr><tr><td>Primer udglødning</td>
			<td>62</td>
			<td>1 min</td>
		</tr><tr><td>Forlængelse</td>
			<td>72</td>
			<td>30 s</td>
		</tr><tr><td>Endelig forlængelse</td>
			<td>1</td>
			<td>72</td>
			<td>5 minutter</td>
		</tr><tr><td>Køling</td>
			<td></td>
			<td>4</td>
			<td>Holde</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2: Tabel, der viser DOP-PCR-cyklus, temperatur og tidsprofil.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Konstituerende</td>
			<td>Volumen(μL)</td>
		</tr><tr><td>10x NT-buffer (0,5 M Tris-HCl pH-værdi 8,50 mM MgCl2, 0,5 mg/ml BSA)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>0,1 M beta-mercaptoethanol</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>10X nukleotidlager (0,5 mM dATP, 0,5 mM dCTP, 0,5 mM dGTP, 0,5 mM dTTP, 0,5 mg/ml biotin-16-dUTP)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Dnase I (1 ng/ml)</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>DNApolymerase I</td>
			<td>5U pr. μg DNA</td>
		</tr><tr><td>DNA-skabelon (1 μg)</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>DEPC-behandlet vand</td>
			<td>Til 50 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 3: Tabel, der viser nick-oversættelseskomponenter og -volumener for en enkelt sonde.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci at JoVE.com

Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

Kombination af DNA-halopræparater med fluorescens in situ-hybridisering muliggør højopløsningsanalyse af genomiske interaktioner med nukleoskelettet. Vedhæftet genom fører til hybridiserede fluorescerende signaler placeret i de resterende ekstraherede kerner, mens ikke-bundet genom er i DNA-haloen, der omgiver de resterende kerner.

Fluorescens in situ hybridisering på DNA halo præparater til at afsløre hele kromosomer, telomerer og gen loci

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These ...

Denne protokol kan bruges til at vurdere vedhæftede filer til nukleoskelettet i stedet for at bruge DamID-sekventering, og det er et enkelt celleassay. Den største fordel ved at bruge denne metode er, at den er omkostningseffektiv og let tilgængelig. Det kan fremhæve funktionelle forskelle mellem gener og kromosomer, der normalt ikke forekommer med andre visualiseringsteknikker.Rumlige og funktionelle organisationer inden for genomet i behandlede kræft- og progeriaceller og genomiske adfærdsforskelle i senescerende celler kan vurderes ved hjælp af denne protokol. Denne metode kan anvendes på enhver celle eller vævstype i hele levetiden og af enhver sygdom. Det kan også bruges i modelorganismer, hvor sonder er tilgængelige.Til at begynde med skal du forberede 500 ml 10% saltsyre og hælde den i et stort bægerglas. Dråbemikroskopet glider enkeltvis ned i syren og inkuberer dem i en time ved stuetemperatur på en ryster, der er indstillet til to G.Dekanter syren fra bægerglasset og vask objektglassene 10 gange i postevand. Derefter yderligere 10 gange i deioniseret vand.Skyl diasene i methanol to gange og opbevar dem i methanol indtil sterilisering. Tip diasene på et papirhåndklæde for at tørre og pakk dem ind i folie til sterilisering i en autoklave eller varm ovn. Voks celler i det passende medium med serum i mindst 48 timer ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid, indtil 60 til 70% sammenløb er nået.Høst hver celletype og tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer. Frø en gange 10 til de fem celler i 10 ml medium pr. Dias. Fjern kulturskålen, der indeholder dias og vedhæftede celler fra inkubatoren.Kassér mediet, og mærk diasene med en blyant. Anbring dem derefter i en coplin-krukke indeholdende 50 ml iskold cytoskeletbuffer. Inkuber krukken i 15 minutter på is eller ved fire grader Celsius.Kassér cytoskeletbufferen, og skyl hurtigt diasene i 50 ml engangs-DNA-halobuffer tre gange ved at dyppe dem i en coplin-krukke med bufferen. Overfør dias til en coplin-krukke indeholdende 50 ml ekstraktionsbuffer og inkuber i fire minutter ved stuetemperatur. Derefter inkuberes diasene fortløbende i 50 ml 10 gange, fem gange, to gange og en gang DNA-halobuffer i et minut hver.Når du er færdig, dyppes diasene gennem en sekventiel ethanolserie på 10, 30, 70 og 95% ethanol. Tag diasene gennem en sekventiel 50 milliliter ethanolserie på 70, 90 og 100% ethanol i fem minutter hver. Lufttør dem på en varmeplade.Bages derefter i en 70 grader Celsius ovn i fem minutter. Denaturer diasene ved at placere dem i 70% formamid to gange SSC-opløsning i to minutter ved 70 grader Celsius. Læg de denaturerede dias i 50 ml iskold 70% ethanol i fem minutter.Flyt dem derefter gennem en ethanolserie på 90, 95 og 100% ved stuetemperatur i fem minutter hver. Når du er færdig, lufttørres diasene på en varmeplade. Denaturer DNA-sonderne ved 75 grader Celsius i 10 minutter i en varm blok eller vandbad.Derefter inkuberes de ved 37 grader Celsius i 30 minutter, før de pipetteres 10 mikroliter på det passende dias. Overlejr sonden med et 21 x 21 millimeter dæksel og forsegl den med gummicement. Inkuber diasene i mindst 18 timer ved 37 grader Celsius i et befugtet hybridiseringskammer.Efter inkubationen skal du forsigtigt fjerne gummicementen med tang. Derefter inkuberes diasene i 50 ml 50% formamid to gange SSC-opløsning ved pH syv, der er forvarmet til 45 grader Celsius i tre fem minutters inkubationer. Placer derefter diasene i 50 ml 0,1 gange SSC-opløsning, der er forvarmet til 60 grader Celsius, men anbragt i et 45 grader Celsius vandbad.Inkuber i fem minutter og udskift bufferen to gange i fem minutters inkubationer. Anbring diasene i en coplin-krukke indeholdende 50 ml fire gange SSC-opløsning ved stuetemperatur og inkuber i 15 minutter med tre bufferændringer. For at forhindre ikke-specifik antistofbinding påføres 100 mikroliter 4% BSA fire gange SSC-opløsning på hvert dias og overlejres med et stykke paraffinfilm.Inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter. Derefter inkuberes diasene med 100 mikroliter streptavidin Cy3 fortyndet en ud af 200 i en time ved stuetemperatur for at detektere den mærkede sonde. Anbring diasene i en coplin-krukke indeholdende 50 ml fire gange SSC-opløsning ved stuetemperatur og inkuber i 15 minutter med tre bufferændringer.Monter diasene i 20 mikroliter af en monteringsopløsning indeholdende DAPI og overlay med en 22 x 50 millimeter coverslip. Visualiser DNA-haloer og kromosomområder ved hjælp af et epifluorescensmikroskop med et 100X oliemål. DNA-haloforberedelse gør det muligt at se kanten af en restkerne, DNA'et, der forbliver inden for den resterende kerne, og det ikke-bundne DNA, der er spoleret ud i det omkringliggende område.DNA-haloer af prolifererende humane dermale fibroblaster blev skabt af celler med inkorporeret BRDU og efterfølgende farvet med anti-BRDU-antistof. Prolifererende celler var positive for BRDU og anti-pKi-67. Denne protokol blev brugt til at visualisere kromosomområder inden for DNA-haloer.Individuelle kromosomer blev mærket med specifikke helarmskromosommalingssonder til kromosomer 1, 13, 17 og 18. Anti-pKi-67 blev brugt til at markere prolifererende celler og dets fravær inden for samme kultur. DNA-halopræparater med telomerer i grønt er vist her.Det er muligt at observere andelen af telomerer i DNA-haloen, især i eksperimentets to-billede. Den gennemsnitlige procentdel af telomerer var ca. 17% i hvilende celler. Forskelle i kromosombinding blev påvist i primære kontrolfibroblaster og i syge celler med typisk og atypisk Hutchinson-Gilford progeriasyndrom, der udtrykte en anden Sun1-isoform og ingen Lamin A-mutation.Kromosomerne et og 13 viser statistisk signifikante forskelle i deres binding inden for de resterende kerner sammenlignet med kontrollerede DNA-haloer. Placeringen af hele kromosomområdet var korreleret med den resterende kerne og DNA-halo. Når du forsøger denne protokol, skal du sørge for, at cellerne podes med den korrekte tæthed og ekstraheres på det rigtige tidspunkt.Efter denne procedure kan indirekte immunofluorescens og RNA FISH udføres.

Research

JoVE Journal

Biology

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioaktivt In situ Hybridisering til påvisning af Forskellige genekspressionsmønstre i Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Påvisning af viralt RNA ved fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput fysisk kortlægning af kromosomer under anvendelse Automatiseret<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Analyse af enkeltcelle-gentransskription ved RNA Fluorescent<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...