Name: fluorescence in situ hybridization on dna halo preparations to reveal whole chromosomes, telomeres and gene loci
Uploaded: 2021-03-04T13:30:00
Duration: 9 min 7 s
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Nous tenons à remercier le professeur Michael Bittner pour l’aimable cadeau des sondes de peinture de bras chromosomiques. LG a été soutenu par le projet EURO-Laminopathies financé par l’UE et le Fonds de recherche Brunel Progeria.

<ol>
	<li>Berezney, R., Coffey, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+nuclear+protein+matrix.">Identification of a nuclear protein matrix.</a> Biochemical Biophysical Research Communications. 60 (4), 1410-1417 (1974).</li><li>Haaf, T., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+ordering+of+YAC+contigs+using+extended+chromatin+and+chromosomes.">High resolution ordering of YAC contigs using extended chromatin and chromosomes.</a> Human Molecular Genetics. 3 (4), 629-633 (1994).</li><li>Parra, I., Windle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+visual+mapping+of+stretched+DNA+by+fluorescent+hybridization.">High resolution visual mapping of stretched DNA by fluorescent hybridization.</a> Nature Genetics. 5 (1), 17-21 (1993).</li><li>Senger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Released+chromatin:+linearized+DNA+for+high+resolution+fluorescence+in+situ+hybridization.">Released chromatin: linearized DNA for high resolution fluorescence in situ hybridization.</a> Human Molecular Genetics. 3 (8), 1275-1280 (1994).</li><li>Florijn, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+DNA+Fiber-FISH+for+genomic+DNA+mapping+and+colour+bar-coding+of+large+genes.">High-resolution DNA Fiber-FISH for genomic DNA mapping and colour bar-coding of large genes.</a> Human Molecular Genetics. 4 (5), 831-836 (1995).</li><li>Elcock, L. S., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+on+DNA+halo+preparations+and+extended+chromatin+fibres.">Fluorescence in situ hybridization on DNA halo preparations and extended chromatin fibres.</a> Methods Molecular Biology. 659, 21-31 (2010).</li><li>Heiskanen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+mapping+by+fiber-FISH.">Visual mapping by fiber-FISH.</a> Genomics. 30 (1), 31-36 (1995).</li><li>Bensimon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+and+sensitive+detection+of+DNA+by+a+moving+interface.">Alignment and sensitive detection of DNA by a moving interface.</a> Science. 265 (5181), 2096-2098 (1994).</li><li>Michalet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+molecular+combing:+stretching+the+whole+human+genome+for+high-resolution+studies.">Dynamic molecular combing: stretching the whole human genome for high-resolution studies.</a> Science. 277 (5331), 1518-1523 (1997).</li><li>Wilson, R. H., Coverley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+DNA+replication+and+the+nuclear+matrix.">Relationship between DNA replication and the nuclear matrix.</a> Genes Cells. 18 (1), 17-31 (2013).</li><li>Wilson, R. H. C., Coverley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation-induced+changes+in+the+DNA-nuclear+matrix+interface,+revealed+by+high-throughput+analysis+of+DNA+halos.">Transformation-induced changes in the DNA-nuclear matrix interface, revealed by high-throughput analysis of DNA halos.</a> Science Reports. 7 (1), 6475 (2017).</li><li>Iarovaia, O. V., Akopov, S. B., Nikolaev, L. G., Sverdlov, E. D., Razin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+transcription+within+chromosomal+DNA+loops+flanked+by+MAR+elements+causes+an+association+of+loop+DNA+with+the+nuclear+matrix.">Induction of transcription within chromosomal DNA loops flanked by MAR elements causes an association of loop DNA with the nuclear matrix.</a> Nucleic Acids Research. 33 (13), 4157-4163 (2005).</li><li>Tandara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+DNA+integrity+testing:+big+halo+is+a+good+predictor+of+embryo+quality+and+pregnancy+after+conventional+IVF.">Sperm DNA integrity testing: big halo is a good predictor of embryo quality and pregnancy after conventional IVF.</a> Andrology. 2 (5), 678-686 (2014).</li><li>Repping, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+spermHALO-FISH+to+determine+DAZ+gene+copy+number.">The use of spermHALO-FISH to determine DAZ gene copy number.</a> Mol Human Reproduction. 9 (4), 183-188 (2003).</li><li>Bikkul, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farnesyltransferase+inhibitor+and+rapamycin+correct+aberrant+genome+organisation+and+decrease+DNA+damage+respectively,+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+fibroblasts.">Farnesyltransferase inhibitor and rapamycin correct aberrant genome organisation and decrease DNA damage respectively, in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts.</a> Biogerontology. 19 (6), 579-602 (2018).</li><li>Telenius, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degenerate+oligonucleotide-primed+PCR:+general+amplification+of+target+DNA+by+a+single+degenerate+primer.">Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer.</a> Genomics. 13 (3), 718-725 (1992).</li><li>Bridger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+pKi-67+with+satellite+DNA+of+the+human+genome+in+early+G1+cells.">Association of pKi-67 with satellite DNA of the human genome in early G1 cells.</a> Chromosome Research. 6, 13-24 (1998).</li><li>Sales Gil, R., Vagnarelli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67:+More+Hidden+behind+a+'Classic+Proliferation+Marker'.">Ki-67: More Hidden behind a 'Classic Proliferation Marker'.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 747-748 (2018).</li><li>Bikkul, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+elongation+through+hTERT+immortalization+leads+to+chromosome+repositioning+in+control+cells+and+genomic+instability+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+fibroblasts,+expressing+a+novel+SUN1+isoform.">Telomere elongation through hTERT immortalization leads to chromosome repositioning in control cells and genomic instability in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts, expressing a novel SUN1 isoform.</a> Genes Chromosomes Cancer. 58 (6), 341-356 (2019).</li><li>Jackson, D. A., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+a+filamentous+nucleoskeleton+with+a+23+nm+axial+repeat.">Visualization of a filamentous nucleoskeleton with a 23 nm axial repeat.</a> EMBO Journal. 7, 3667-3677 (1988).</li><li>Albrethsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+the+nuclear+matrix+proteome.">Unravelling the nuclear matrix proteome.</a> Journal of Proteomics. 72, 71-81 (2009).</li><li>Mika, S., Rost, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMPdb:+Database+of+nuclear+matrix+proteins.">NMPdb: Database of nuclear matrix proteins.</a> Nucleic Acids Research. 33, 160-163 (2005).</li><li>Gavrilov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=of+the+nuclear+matrix-bound+chromatin+hubs+by+a+new+M3C+experimental+procedure.">of the nuclear matrix-bound chromatin hubs by a new M3C experimental procedure.</a> Nucleic Acids Research. 38, 8051-8060 (2010).</li><li>Sjakste, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+nuclear+matrix+proteins+in+malignant+transformation+and+cancer+diagnosis.">Role of the nuclear matrix proteins in malignant transformation and cancer diagnosis.</a> Experimental Oncology. 26 (3), 170-178 (2004).</li><li>Leman, E. S., Getzenberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+structure+as+a+source+of+cancer+specific+biomarkers.">Nuclear structure as a source of cancer specific biomarkers.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 104 (6), 1988-1993 (2008).</li><li>Volpi, E. V., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH+glossary:+an+overview+of+the+fluorescence+in+situ+hybridization+technique.">FISH glossary: an overview of the fluorescence in situ hybridization technique.</a> Biotechniques. 45 (4), 385-386 (2008).</li><li>Bridger, J. M., Foster, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+and+the+Genome.">Senescence and the Genome.</a> Human Interphase Chromosomes. , (2021).</li><li>Foster, H. A., Griffin, D. K., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interphase+chromosome+positioning+in+in+vitro+porcine+cells+and+ex+vivo+porcine+tissues.">Interphase chromosome positioning in in vitro porcine cells and ex vivo porcine tissues.</a> BMC Cell Biology. 13 (1), 30 (2012).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La méthode du halo d’ADN est une excellente méthode de choix pour analyser les interactions entre le nucléosquelette et le génome, mais certaines étapes critiques doivent également être respectées. L’un des paramètres les plus importants est l’optimisation de la densité d’ensemencement cellulaire. Si les cellules deviennent confluentes, les halos d’ADN se chevaucheront avec les cellules voisines, ce qui rendra impossible l’analyse. Le CSK et les tampons d’extraction doivent toujours être renouvelés le jour de l’utilisation avec de la spermine, de la spermidine et de la digitonine ajoutées au tampon d’extraction à la fin du processus de préparation pour maintenir leur activité biologique. Si vous effectuez Halo-FISH, il est extrêmement important d’utiliser la température de dénaturation correcte des halos d’ADN pour permettre à la sonde ou à la peinture de s’hybrider par la suite.
La microscopie électronique a été utilisée pour visualiser la matrice nucléaire, les structures filamenteuses étant identifiées20. Cependant, la microscopie électronique est limitée car les associations matricielles avec la chromatine ne peuvent pas être facilement déduites. En effet, la méthode DNA Halo est plus polyvalente que la microscopie électronique car des gènes, des chromosomes et des états cellulaires spécifiques peuvent tous être examinés. En outre, l’analyse protéomique des protéines de la matrice nucléaire est à l’étude21,22. Cette méthode est bonne pour comparer les composants de la matrice nucléaire, en particulier lors de la comparaison de cellules malades, mais elle ne fournit pas la distribution spatiale et les attachements mis en évidence par la technique standard DNA Halo.
Les tests ADN Halo ont des limites. Tout d’abord, lorsque la matrice est extraite, cela ne peut être effectué que sur des cellules fixes, de sorte que l’imagerie en direct n’est pas possible. Bien que la méthode DNA Halo soit relativement rapide et facile à réaliser, le processus global peut prendre beaucoup de temps lorsque la culture cellulaire, la génération de sonde, Halo-FISH et l’analyse sont toutes prises en compte.
La capture d’images de DNA Halos et de HALO-FISH à l’aide de la microscopie à super-résolution améliorerait considérablement la résolution des sondes et des anticorps spécifiques à l’ADN. En outre, comme les fluorochromes peuvent être résolus plus facilement spectralement, il peut être possible d’utiliser un certain nombre de sondes ADN dans une seule expérience, fournissant encore plus d’informations. Des améliorations dans les techniques de biologie moléculaire telles que la capture de conformation chromosomique (3C) ont été utilisées pour déterminer les interactions des loci de gènes et analyser l’organisation spatiale de la chromatine dans la cellule. Les tests DNA Halo et 3C peuvent être combinés, un terme connu sous le nom de M3C23, démontrant à nouveau l’adaptabilité de la technique DNA Halo.
Les données originales présentées ici visent à démontrer les possibilités d’interrogation du comportement du génome et comment présenter ces données. Avec ces données, nous avons démontré qu’il est possible de déterminer des différences significatives dans l’attachement du génome en utilisant (1) des sondes de peinture chromosomique, dans cette étude révélant que le chromosome 18 est le chromosome le moins attaché parmi ceux analysés (Figure 3); (2) Loci géniques présentant des différences significatives entre deux loci géniques et (Figure 4) (3) Télomères, qui sont moins fortement attachés dans les cellules quiescentes que les cellules proliférantes et sénescentes (Figure 5). Nous sommes en mesure de différencier les cellules proliférantes et non proliférantes grâce à la présence du marqueur de prolifération antigène Ki67 qui est une protéine insoluble qui reste donc avec les noyaux résiduels ou en utilisant l’incorporation de nucléotides pour mettre en évidence les cellules qui ont traversé la phase S dans un laps de temps spécifique (Figure 2). Cette technique nous a également permis d’analyser le comportement du génome dans les cellules qui sont compromises dans leurs nucléo-squelettes, c’est-à-dire les cellules de laminopathie, et ici et dans Bikkul et al., 2018, nous révélons que le génome peut être moins étroitement attaché par rapport aux cellules témoins et peut être restauré lors du traitement avec des médicaments spécifiques qui améliorent l’effet de la mutation lamin A dans les cellules HGPS classiques15. Cependant, nous montrons ici de nouvelles données pour les cellules HGPS AGO8466 atypiques, dépourvues d’une mutation lamin A mais contenant une forme inhabituelle de la protéine complexe LINC SUN1 19 dans laquelle le chromosome13 est moins étroitement attaché (Figure 6).
HALO-FISH est une méthode unique qui permet l’étude des interactions génomiques avec le nucléosquelette en combinaison avec l’immunofluorescence indirecte pour résoudre les protéines non retirées de la procédure d’extraction. Il a été démontré que le nucléosquelette est modifié dans diverses maladies telles que certains types de cancer19 et l’importance de certaines protéines associées au nucléosquelette comme biomarqueurs diagnostiques24,25. Ainsi, cette technique a un rôle important dans l’examen de l’effet du nucléosquelette sur l’organisation/désorganisation de la chromatine dans la maladie 15,24,25,27 et n’est pas limitée aux cellules humaines, avec des sondes de peinture chromosomique d’autres animaux, le même protocole ADN-halo pourrait être utilisé 28.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated from:
Lauren S. Godwin1 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire
to:
Lauren S. Godwin1 
Emily Roberts2 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

La « matrice nucléaire » a été décrite pour la première fois par Berezney et Coffey en 19741. Après avoir effectué des extractions avec des molarités salines élevées et un traitement par nucléase sur des noyaux de foie de rat, ils ont identifié un cadre structurel protéique. La procédure du halo d’ADN a ensuite été adaptée à partir de cette méthode et implique l’élimination des protéines solubles de sorte que seules la matrice nucléaire (NM) et les protéines et chromosomes associés au NM persistent. Les régions d’attachement de l’ADN sont situées à la base des boucles d’ADN et sont appelées régions attachées à la matrice (MAR) ou régions d’attache d’échafaudage (SAR), qui sont résistantes à l’extraction avec des concentrations élevées de sel et de détergent ionique lithium-3,5-diiodosalicylate (LIS) respectivement. Dans les halos d’ADN, l’ADN associé aux MAR/SAR est lié dans le noyau résiduel tandis que les boucles d’ADN s’étendent loin de ces sites et forment le halo d’ADN. Nous savons maintenant que le génome est ancré via des domaines associés à la lame nucléaire (LAD) à la lame nucléaire et à travers des régions associées nucléolaires (NAD) et éventuellement à travers d’autres structures nucléaires telles que des corps nucléaires spécifiques.
La méthode du halo d’ADN peut être utilisée pour la cartographie physique de l’ADN, des gènes et des régions chromosomiques car l’ADN étendu et la chromatine offrent une plus grande résolution car la chromatine est dépouillée des histones et l’ADN est étiré 2,3,4,5,6. Cependant, il existe certaines limitations lors de l’utilisation de halos d’ADN pour cette application. Par exemple, l’ADN étroitement associé aux noyaux résiduels des halos d’ADN peut être inaccessible aux sondes, ce qui l’empêche de procéder à l’analyse et à la cartographie physique6. D’autres techniques telles que la fibre-FISH 2,4,5,7 et le peignage moléculaire 8 permettent également une cartographie physique et ont l’avantage d’être relativement rapides et faciles à réaliser. Les deux sont utilisés de préférence pour la cartographie de l’ADN des gènes sur les halos d’ADN. Ces méthodes extraient les fibres de chromatine via l’utilisation d’extractions par solvant ou sel du noyau, cependant, le peignage moléculaire tend à avoir une meilleure reproductibilité 8,9.
Il existe de plus en plus de preuves que le nucléosquelette joue un rôle dans le soutien de processus nucléaires clés, tels que les sites de fixation de l’ADN, le remodelage de la chromatine, la transcription de l’ADN, la réparation de l’ADN et la réplication de l’ADN11,12. En tant que telle, la technique du halo d’ADN a été développée pour étudier les interactions entre le nucléosquelette et le génome au cours de ces activités cellulaires et a été couramment utilisée et rapportée dans la recherche. Cette technique a également été utilisée pour étudier les interactions entre le génome et le nucléosquelette en relation avec la progression de la maladie avec des changements associés à la malignité dans la structure nucléaire identifiés11.
La technique du halo d’ADN a également été utilisée pour étudier la relation entre le génome et le nucléosquelette au cours du développement et de la différenciation12. Un certain nombre d’études ont utilisé une variante de la technique du halo d’ADN connue sous le nom d’halosperme13 ou SpermHalo-FISH si elle est couplée à FISH14. La chromatine des spermatozoïdes est étroitement liée aux protéines connues sous le nom de protamines et cette technique a été développée pour améliorer l’accès à l’ADN des spermatozoïdes. L’halosperme a été utilisé pour étudier l’intégrité de l’ADN des spermatozoïdes et déterminer si des dommages à l’ADN sont présents. Les spermatozoïdes avec moins de dommages à l’ADN sont corrélés à une plus grande taille de halo d’ADN, tandis que les spermatozoïdes avec des niveaux accrus d’ADN fragmenté et endommagé avaient de petits halos ou pas du tout. Ainsi, l’halosperme peut être utilisée comme marqueur pronostique potentiel de la qualité de l’embryon et de la réussite de la grossesse avec la FIV13. Cet exemple met l’accent sur les applications cliniques potentielles de cette technique. Dans notre travail, nous avons utilisé HALO-FISH pour évaluer les changements dans le comportement du génome et l’effet de traitements médicamenteux spécifiques dans la maladie du vieillissement prématuré Syndrome de Hutchinson-Gilford Progeria (HGPS)15.
Ensemble, ces études, et d’autres, mettent en évidence l’étendue des processus / applications que la technique du halo d’ADN peut être utilisée pour étudier et l’utilité de la technique.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10388739</td>
			<td>Used to create DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-2&#8242;-deoxy-uridine&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5002-100MG</td>
			<td>Labelled nucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503-100MG</td>
			<td>Labelled nucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Technical</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15562141</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A939-50G</td>
			<td>Check product size of DOP-PCR and nick translation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atypical type 2 HGPS fibroblasts (AG08466)</td>
			<td>Coriell Institute</td>
			<td>AG08466</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16269751</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-16-dUTP</td>
			<td>Roche Diagnostics&#160;</td>
			<td>11093711103</td>
			<td>Labelled nucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378-25G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Classical Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) fibroblasts (AG06297)&#160;</td>
			<td>Coriell Institute</td>
			<td>AG0297</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12608596</td>
			<td>Holds 5 slides or 8 slides back to back</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cot-1 DNA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15279011</td>
			<td>Block nonspecific hybridization in HALO FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>693520-1L</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4030</td>
			<td>Hybridisation mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D141</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-dUTP&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11093088910</td>
			<td>Labelled nucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Cy3</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>443611</td>
			<td>Probe precipitation and HALO FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Cell culture serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10523525</td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18421</td>
			<td>Spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herring sperm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7290</td>
			<td>Probe precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HXP&#8482; Lamp (metal halide microscope lamp)</td>
			<td>OSRAM</td>
			<td>HXP-R120W45C VIS</td>
			<td>Image capture of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10313680</td>
			<td>Cleaning microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516-25ML</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi PCR Kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK2103</td>
			<td>PCR Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM4000 fluorescent microscope with DFC365 FX camera and LAS AF (Version: 4.5.0) image acquisition software.</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Image capture of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani agar&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13274843</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Component of CSK buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10284580</td>
			<td>Cleaning and sterilizing microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-BrdU antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>B2531-100UL</td>
			<td>BrdU visualisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn calf serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16010159</td>
			<td>Cell culture serum and blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nick translation kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR grade water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>693520-1L</td>
			<td>PCR and DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1851</td>
			<td>Component of CSK and extraction buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190-100G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadriPERM&#174; 4 X 12</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>94.6077.307</td>
			<td>Square cell culture dish, polysterene with four compartments.&#160; This has hydrophobic surface, is sterile, non-pyrogenic/endotoxin-fee and non-cytotoxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Ki67 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ZRB1007-25UL</td>
			<td>Proliferation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6513</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber cement</td>
			<td>Halford&#39;s</td>
			<td>101836</td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-50</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6022-25G</td>
			<td>Spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Probe precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>Component of CSK, extraction and SSC buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8532</td>
			<td>Component of SSC buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate&#160;</td>
			<td></td>
			<td>L3771-100G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4264</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Cy3&#160;</td>
			<td>Amersham Life Sciences Ltd, Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>pa43001</td>
			<td>Probe antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>Component of CSK buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>CSK buffer+A66:D68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost&#8482; microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12372098</td>
			<td>Microscope slides: 1 mm thickness, 76 mm length, 26 mm width. Uncoated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swine anti-rabbit TRITC&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TELO-PNA FISH KIT</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>K532511-8</td>
			<td>Delineation of telomeres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253-100G</td>
			<td>Column buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>Component of CSK buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10158962</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416- 100ML</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mountant containing DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole human chromosome probes</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td></td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10108202</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence in situ hybridization on dna halo preparations to reveal whole chromosomes, telomeres and gene loci

Le génome est associé à plusieurs structures à l’intérieur des noyaux cellulaires, afin de réguler son activité et de l’ancrer à des endroits spécifiques. Ces structures sont collectivement connues sous le nom de nucléosquelette et comprennent la lame nucléaire, les nucléoles et les corps nucléaires. Bien qu’il existe de nombreuses variantes de l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) pour étudier le génome et son organisation, elles sont souvent limitées par la résolution et fournissent des informations insuffisantes sur l’association du génome avec les structures nucléaires. La méthode du halo d’ADN utilise des concentrations élevées de sel et des détergents non ioniques pour générer des boucles d’ADN qui restent ancrées aux structures des noyaux par le biais de régions d’attachement dans le génome. Ici, les protéines nucléaires solubles, telles que les histones, les lipides et l’ADN qui ne sont pas étroitement liés à la matrice nucléaire, sont extraites. Cela conduit à la formation d’un halo d’ADN non attaché entourant un noyau résiduel qui contient lui-même de l’ADN étroitement associé à des structures nucléaires internes et à des protéines résistantes à l’extraction. Ces brins d’ADN étendus permettent une résolution accrue et peuvent faciliter la cartographie physique. En combinaison avec FISH, cette méthode présente l’avantage supplémentaire d’étudier les interactions génomiques avec toutes les structures par lesquelles le génome est ancré. Cette technique, appelée HALO-FISH, est très polyvalente où les halos d’ADN peuvent être couplés à des sondes d’acide nucléique pour révéler les loci de gènes, les chromosomes entiers, les satellites alpha, les télomères et même l’ARN. Cette technique donne un aperçu de l’organisation et de la fonction nucléaires dans les cellules normales et de la progression de la maladie comme avec le cancer.

Cette méthode de préparation du halo d’ADN nous a aidés dans nos efforts pour déterminer les différences de comportement du génome au sein des cellules jeunes et âgées, mais aussi dans les cellules dérivées de maladies de vieillissement prématuré avec des protéines nucléosquelettiques aberrantes15. La figure 1 montre des exemples de halos d’ADN où il est possible de voir le bord d’un noyau résiduel, l’ADN restant dans le noyau résiduel et l’ADN non attaché qui s’est enroulé dans la zone environnante créant un halo d’ADN. Il décrit également l’analyse montrant comment le noyau résiduel est obtenu et les mesures NE et CTE. Il est possible de différencier les cellules proliférantes des cellules non proliférantes en incorporant un nucléotide marqué tel que BrdU lorsque les cellules sont en phase S ou en utilisant le marqueur de prolifération diagnostique anti-pKi67, qui révèle les nucléoles et les régions d’hétérochromatine dans les cellules G117,18. Les cellules primaires cultivées dans le sérum élevé sans atteindre la confluence, qui sont négatives pour les marqueurs de prolifération, sont supposées être sénescentes. Les cellules primaires cultivées dans le sérum bas ou devenues confluentes, c’est-à-dire inhibées par le contact qui sont négatives pour les marqueurs de prolifération, sont considérées comme quiescentes et seraient capables de réintégrer le cycle cellulaire prolifératif si les nutriments et la situation sont corrects. La capacité de différencier les cellules Ki67 positives et négatives nous a permis de déterminer les différences entre les fibroblastes dermiques humains proliférants, quiescents et sénescents. La figure 2 montre les halos d’ADN de fibroblastes dermiques humains en prolifération créés à partir de cellules où le BrdU y a été incorporé lors de la réplication de l’ADN, un mécanisme qui ne se produit pas dans les cellules non proliférantes, et ensuite coloré avec des anticorps anti-BrdU. La coloration avec le marqueur prolifératif anti-anticorps pKi67 est également visible sur la figure 2. Il s’agit d’un antigène robuste qui survit au protocole FISH et peut donc être coloré pour le post-FISH et le prémontage. Ainsi, les cellules proliférantes sont positives (rouge) pour BrdU et anti-pKi67 (rouge) dans la colonne de gauche et les cellules non proliférantes, en effet les cellules sénescentes de la figure 2 sont affichées dans la colonne de droite. Les signaux verts sont des télomères individuels révélés avec un kit PNA FISH/FITC de télomères. La combinaison de l’immunofluorescence avec des halos d’ADN permet une analyse au cours de différents états cellulaires, comme le montre la figure 2 lors de l’étude de cellules proliférantes, quiescentes et sénescentes. Selon l’anticorps choisi, d’autres conditions peuvent être examinées, telles que la différenciation, les dommages à l’ADN par irradiation, etc.
Les territoires chromosomiques peuvent également être visualisés dans des halos d’ADN à l’aide de FISH. En raison de la préparation permettant l’enroulement de l’ADN hors des noyaux, la forme du territoire chromosomique peut être perturbée, avec des quantités plus ou moins grandes du chromosome trouvées dans le halo d’ADN, en fonction de l’ancrage du génome à l’intérieur du noyau résiduel et de ses structures. La figure 3 révèle un panel de halos d’ADN dans lesquels des chromosomes individuels ont été révélés avec des sondes de peinture chromosomiques spécifiques du bras entier (rouge) pour les chromosomes 1, 13, 17 et 18. Anti-pKi67 (vert) a été utilisé pour marquer les cellules proliférantes et son absence dans la même culture, sur la même lame, désignant les cellules sénescentes. Il est très évident d’après les images et les données présentées comme CTE / NE que le petit chromosome 18 pauvre en gènes est un chromosome qui a peu d’attaches et qui s’enroule plus loin dans le halo d’ADN loin des noyaux résiduels et est significativement plus éloigné du centre des noyaux résiduels que les autres chromosomes. Cependant, cela est également vrai pour le chromosome 1. En utilisant le marqueur prolifératif anti-pKi67, il a également été possible de comparer la prolifération avec des cellules sénescentes, au sein de la même culture et sur la même lame, et cette analyse a révélé que les chromosomes au sein de ces deux statuts cellulaires très différents ne sont pas significativement différents l’un de l’autre, en ce qui concerne la fixation avec les structures nucléaires résiduelles.
Fait intéressant, les gènes montrent également des différences statistiquement significatives entre les cellules proliférantes et sénescentes en ce qui concerne le fait de rester dans un noyau résiduel ou d’être situé dans le halo d’ADN. La figure 4 le démontre avec des loci génétiques délimités par des sondes BAC marquées en rouge et anti-Ki67 en vert. Il n’y a pas de différences significatives entre les emplacements des gènes dans les cellules proliférantes par rapport aux cellules sénescentes, après une préparation de halo d’ADN. Cependant, il y a significativement plus de loci de caténine alpha 1 CTNNA1 dans le halo d’ADN que de loci de cycline D1 CNDD1 , où il y en a très peu. La figure 5 montre les préparations de halo d’ADN avec des télomères en vert. L’arrière-plan est laissé délibérément haut pour permettre aux signaux des télomères d’être visualisés dans le halo d’ADN. Dans cet ensemble de données sur les cellules quiescentes, c’est-à-dire que les cellules qui ont été affamées de sérum pendant 7 jours ont été incluses et, il est intéressant de noter qu’il y a beaucoup plus de télomères non attachés et situés dans les halos d’ADN dans les cellules quiescentes que pour les cellules proliférantes et sénescentes. Sur la figure 5a , la proportion de télomères dans le halo d’ADN peut être observée, en particulier pour l’image « Expérience 2 ». Cela correspond à la figure 5b où le pourcentage moyen de télomères dans le halo d’ADN est d’environ 17% dans les cellules quiescentes. Il existe des preuves que tous les télomères dans les cellules sénescentes ne peuvent pas être considérés comme certains d’entre eux peut-être très courts.
Cette méthode de halo d’ADN nous a permis d’étudier les altérations de l’interaction du génome dans les noyaux des cellules malades15. La figure 6 montre des différences dans l’attachement chromosomique dans les fibroblastes de contrôle primaire et dans les cellules malades présentant un syndrome typique (mutation de la lamine A) et atypique de Hutchinson-Gilford Progeria, exprimant une isoforme SUN1 différente et aucune mutation de la lamine A19. Les chromosomes 1 et 13 montrent des différences statistiquement significatives dans leur attachement dans les noyaux résiduels par rapport aux halos d’ADN témoins. La figure 6b met en corrélation la position de l’ensemble du territoire chromosomique au noyau résiduel et au halo d’ADN. Les valeurs de 1 ou moins indiquent que le chromosome est situé dans le noyau résiduel et les valeurs supérieures à 1 indiquent les chromosomes ou les parties de chromosomes dans le halo d’ADN.
Dans l’ensemble, cela met en évidence l’utilité de HALO-FISH dans l’étude des interactions génomiques de chromosomes entiers, de gènes spécifiques et de télomères dans diverses conditions qui affectent le cycle cellulaire (prolifération, quiescence et sénescence) ou au sein des cellules pathogènes, par exemple la progéria et les lignées cellulaires cancéreuses. En effet, les différences d’interactions entre ces états impliquent que le nucléosquelette joue un rôle important dans la régulation des processus clés au sein du noyau.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig01.jpg"> Figure 1 : Noyau extrait par HDF affichant le noyau résiduel et le halo d’ADN et aperçu de la méthode d’analyse. a) Un noyau HDF préparé par dosage du halo ADN et contre-coloré avec du DAPI. Le noyau résiduel coloré de couleurs vives montre de l’ADN ancré au nucléosquelette et celui-ci est entouré par l’ADN non attaché qui forme un halo d’ADN. Grossissement = x 100; barre d’échelle 10 μm. (b) Le canal bleu capture le noyau coloré par DAPI et l’ADN environnant. Le noyau résiduel est sélectionné et éliminé à l’aide d’ImageJ. La flèche représente la distance entre le centre nucléaire et le bord nucléaire résiduel (NE). c) Le canal rouge indique le signal de la sonde. d) L’image portant la mention « Résultat » est le résultat de la superposition du canal rouge sur l’image du canal bleu; cela permet la distance entre le centre nucléaire et le bord du territoire chromosomique (CTE) le plus éloigné. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig02.jpg"> Figure 2 : Préparation du halo d’ADN avec le télomère PNA FISH sur les HDF proliférants et sénescents. Télomère PNA FISH sur HDF soumis à un test de halo d’ADN. Les signaux des télomères sont visualisés en vert (FITC), l’ADN résiduel et halo a été contre-coloré à l’aide de DAPI (bleu) et les noyaux proliférants ont été détectés à l’aide d’anticorps anti-BrdU ou anti-pKi67 via une immunofluorescence indirecte en rouge (TRITC). Grossissement = x 100; Barre d’échelle 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig03.jpg"> Figure 3 : Interactions nucléosquelettique-chromosome et analyse à l’aide du test du halo de l’ADN. a) Le 2D-FISH avec des sondes spécifiques des chromosomes 1, 13, 15, 17 et 18 a été réalisé sur des HDF soumis à une préparation de halo d’ADN. Les chromosomes entiers ont été peints en rouge (Cy3) et les noyaux ont été sondés avec pKi67 pour déterminer s’ils proliféraient ou sénescents. Les cellules proliférantes (pKi67+) ont été délimitées en vert (FITC), tandis que les cellules sénescentes sont restées non colorées (pKi67-), c’est-à-dire qu’aucun signal vert n’a été détecté. Grossissement = x 100; barre d’échelle 10 μm. b) Ancrage chromosomique par le nucléosquelette dans les HDF proliférants et sénescents ayant subi HALO-FISH. Les mesures montrent le rapport entre le bord du territoire chromosomique (CTE) le plus éloigné et le bord nucléaire (NE) respectif pour les chromosomes 1, 13, 15, 17 et 18 dans les cellules proliférantes (pKi67+) et sénescentes (pKi67-). Les barres d’erreur représentent ± SEM. (c) Représentation modifiée du bord du territoire chromosomique (CTE) au bord nucléaire respectif (NE) de chromosomes spécifiques dans les noyaux pKi67+ et pKi67-. Q1 = quartile inférieur; Min = valeur la plus basse enregistrée; Med = médiane; Max = valeur maximale enregistrée; Q3 = quartile supérieur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig04.jpg"> Figure 4 : Interactions spécifiques aux gènes dans les HDF à l’aide de HALO-FISH. a) Les noyaux extraits du halo d’ADN ont été sondés à l’aide de sondes génétiques spécifiques (CCND1 et CTNNA1) afin d’étudier leur ancrage au NM sur des cellules proliférantes et sénescentes. Les signaux génétiques sont affichés en rouge (Cy3) et l’anti-pKi67 représente les cellules proliférantes et le signal est visualisé en vert (FITC). Pour l’image CCND1 proliférante, le noyau résiduel est enfermé dans le cercle blanc, et l’espace entre le cercle blanc et le cercle vert représente le halo d’ADN. Grossissement = x 100; barre d’échelle 10 μm. (b) Les signaux spécifiques aux gènes pour CCND1 et CTNNA1 sont comparés entre le noyau résiduel et le halo d’ADN, ainsi qu’entre les cellules proliférantes et sénescentes. Les barres d’erreur représentent ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a> 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig05.jpg"> Figure 5 : Test de halo d’ADN sur des HDF quiescents sondés avec le télomère PNA-FISH. a) La quiescence des HDF a été induite par culture dans un milieu sérique bas pendant 7 jours. Le test de halo d’ADN a été effectué et PNA-FISH a permis la visualisation des télomères par signal FITC (vert) et le noyau résiduel et le halo d’ADN environnant ont été contre-colorés avec DAPI (bleu). Les cellules ont également été colorées avec des anticorps anti-pKi67 pour s’assurer que les noyaux ne proliféraient pas. Cela s’est répété à deux reprises. Grossissement = x 100; barre d’échelle 10 μm. (b) Comparaison du pourcentage moyen de télomères localisés dans le halo d’ADN dans les cellules HDF proliférantes, sénescentes et quiescentes. Les barres d’erreur représentent ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a> 
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig06.jpg"> Figure 6: Examen de l’ancrage chromosomique entier au nucléosquelette dans les cellules HGPS à l’aide de HALO-FISH26. a) Les noyaux de contrôle HDF (2DD), HGPS classique (AG06297) et HGPS atypique de type 2 (AG08466) ont subi une préparation au halo d’ADN, puis 2D-FISH en utilisant des peintures chromosomiques entières pour les chromosomes 1, 13, 15 et 17. Les chromosomes entiers sont représentés en vert (FITC) et l’ADN a été contre-coloré avec DAPI (bleu). Grossissement = x 100; barre d’échelle 10 μm. (b) Le positionnement des chromosomes dans les noyaux extraits a été déterminé en mesurant le rapport entre le bord moyen du territoire chromosomique (CTE) et le bord nucléaire (NE). Un rapport supérieur à 1 démontre que le CTE le plus éloigné se trouve à l’extérieur du NE correspondant dans le halo d’ADN, tandis qu’un rapport inférieur à 1 signifie que le CTE le plus éloigné se trouve dans le NE dans le noyau résiduel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Constituants</td>
			<td>Volume (μL)</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>5XDOP-PCRbuffer</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>dNTPmix(sansTTP)(2mM)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>dTTP (2mM)</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Biotine-16-dUTPoudigoxigénine-11-dUTP</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>DOPprimer(20μM)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>TaqDNAPolymérase (1U/μL)</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>PCRgradeeau</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td>Modèle</td>
			<td>5</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Tableau montrant les composants et les volumes de la DP-PCR pour une réaction 1x
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Pas</td>
			<td>Cycles</td>
			<td>Temp (degré centigrade)</td>
			<td>Heure</td>
		</tr><tr><td>Dénaturation initiale</td>
			<td>1</td>
			<td>95</td>
			<td>3 min</td>
		</tr><tr><td>Dénaturation</td>
			<td rowspan="3">34</td>
			<td>98</td>
			<td>20 s</td>
		</tr><tr><td>Recuit d’apprêt</td>
			<td>62</td>
			<td>1 min</td>
		</tr><tr><td>Extension</td>
			<td>72</td>
			<td>30 s</td>
		</tr><tr><td>Prolongation finale</td>
			<td>1</td>
			<td>72</td>
			<td>5 min</td>
		</tr><tr><td>Refroidissement</td>
			<td></td>
			<td>4</td>
			<td>Tenir</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Tableau montrant le cycle DOP-PCR, la température et le profil temporel.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Constituant</td>
			<td>Volume (μL)</td>
		</tr><tr><td>10x tampon NT (0,5M Tris-HCl pH 8,50 mM MgCl2, 0,5 mg/ml BSA)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>0,1 M bêta-mercaptoéthanol</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>10X Stock de nucléotides (0,5 mM dATP, 0,5 mM dCTP, 0,5 mM dGTP, 0,5 mM dTTP, 0,5 mg/ml de biotine-16-dUTP)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Dnase I (1 ng/ml)</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>ADN polymérase I</td>
			<td>5U par μg d’ADN</td>
		</tr><tr><td>Modèle d’ADN (1 μg)</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Eau traitée DEPC</td>
			<td>À 50 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 3 : Tableau montrant les composants et les volumes de translation des entailles pour une sonde.

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Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

La combinaison de préparations de halo d’ADN avec l’hybridation in situ par fluorescence permet une analyse à haute résolution des interactions génomiques avec le nucléosquelette. Le génome attaché conduit à des signaux fluorescents hybridés situés dans les noyaux extraits résiduels, tandis que le génome non attaché est dans le halo d’ADN entourant les noyaux résiduels.

Hybridation in situ par fluorescence sur des préparations de halo d’ADN pour révéler des chromosomes entiers, des télomères et des loci de gènes

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These ...

Ce protocole peut être utilisé pour évaluer les attaches au nucléosquelette plutôt que d’utiliser le séquençage DamID, et il s’agit d’un test à cellule unique. Le principal avantage de l’utilisation de cette méthode est qu’elle est rentable et facilement accessible. Il peut mettre en évidence des différences fonctionnelles entre les gènes et les chromosomes qui ne se produisent pas normalement avec d’autres techniques de visualisation.Les organisations spatiales et fonctionnelles au sein du génome dans les cellules cancéreuses et progériales traitées et les différences comportementales génomiques dans les cellules sénescentes peuvent être évaluées à l’aide de ce protocole. Cette méthode peut être appliquée à n’importe quel type de cellule ou de tissu tout au long de la vie et de n’importe quelle maladie. Il peut également être utilisé dans des organismes modèles où des sondes sont disponibles.Pour commencer, préparez 500 millilitres d’acide chlorhydrique à 10% et versez-le dans un grand bécher. Déposer les lames de microscope individuellement dans l’acide et les incuber pendant une heure à température ambiante sur un shaker réglé sur deux G.Decant l’acide du bécher et laver les lames 10 fois à l’eau du robinet. Puis 10 fois de plus dans l’eau désionisée.Rincez deux fois les lames dans du méthanol et conservez-les dans du méthanol jusqu’à la stérilisation. Renversez les lames sur une serviette en papier pour les sécher et enveloppez-les dans du papier d’aluminium pour les stériliser dans un autoclave ou un four chaud. Cultiver des cellules dans le milieu approprié avec du sérum pendant au moins 48 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone jusqu’à ce que 60 à 70% de confluence soit atteinte.Récoltez chaque type de cellule et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Ensemencez une fois 10 à cinq cellules dans 10 millilitres de milieu par lame. Retirez la boîte de culture contenant les lames et les cellules attachées de l’incubateur.Jetez le support et étiquetez les lames à l’aide d’un crayon. Ensuite, placez-les dans un pot de coplin contenant 50 millilitres de tampon de cytosquelette glacé. Incuber le pot pendant 15 minutes sur de la glace ou à quatre degrés Celsius.Jetez le tampon du cytosquelette et rincez rapidement les lames dans 50 millilitres de tampon de halo d’ADN à trois reprises en les trempant dans un pot de coplin avec le tampon. Transférer les lames dans un pot de coplin contenant 50 millilitres de tampon d’extraction et incuber pendant quatre minutes à température ambiante. Ensuite, incuber consécutivement les lames dans 50 millilitres de 10 fois, cinq fois, deux fois et une fois tampon de halo d’ADN pendant une minute chacune.Lorsque vous avez terminé, trempez les lames dans une série séquentielle d’éthanol de 10, 30, 70 et 95% d’éthanol. Prenez les diapositives à travers une série séquentielle d’éthanol de 50 millilitres de 70, 90 et 100% d’éthanol pendant cinq minutes chacune. Séchez-les à l’air sur une plaque chauffante.Ensuite, faites cuire dans un four à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes. Dénaturez les lames en les plaçant dans du formamide à 70% deux fois une solution de SSC pendant deux minutes à 70 degrés Celsius. Placez les lames dénaturées dans 50 millilitres d’éthanol glacé à 70% pendant cinq minutes.Ensuite, déplacez-les à travers une série d’éthanol de 90, 95 et 100% à température ambiante pendant cinq minutes chacun. Lorsque vous avez terminé, séchez à l’air libre les lames sur une plaque chauffante. Dénaturez les sondes d’ADN à 75 degrés Celsius pendant 10 minutes dans un bloc chaud ou un bain-marie.Ensuite, incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avant de pipeter 10 microlitres sur la lame appropriée. Superposez la sonde avec un couvercle de 21 millimètres sur 21 et scellez-la avec du ciment en caoutchouc. Incuber les lames pendant au moins 18 heures à 37 degrés Celsius dans une chambre d’hybridation humidifiée.Après l’incubation, retirez délicatement le ciment en caoutchouc avec une pince. Incuber ensuite les lames dans 50 millilitres de 50% formamide deux fois une solution de SSC à pH sept qui a été préchauffée à 45 degrés Celsius pour trois incubations de cinq minutes. Ensuite, placez les lames dans 50 millilitres de solution 0,1 fois SSC qui a été préchauffée à 60 degrés Celsius, mais placée dans un bain-marie de 45 degrés Celsius.Incuber pendant cinq minutes et remplacer le tampon deux fois pour des incubations de cinq minutes. Placez les lames dans un pot de coplin contenant 50 millilitres de solution quatre fois SSC à température ambiante et incuber pendant 15 minutes avec trois changements de tampon. Pour éviter la liaison d’anticorps non spécifiques, appliquez 100 microlitres de solution 4% BSA quatre fois SSC sur chaque lame et superposez-la avec un morceau de film de paraffine.Incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Incuber ensuite les lames avec 100 microlitres de streptavidine Cy3 diluée une sur 200 pendant une heure à température ambiante pour détecter la sonde marquée. Placez les lames dans un pot de coplin contenant 50 millilitres de solution quatre fois SSC à température ambiante et incuber pendant 15 minutes avec trois changements de tampon.Montez les lames dans 20 microlitres d’une solution de montage contenant DAPI et superposez avec une glissière de couverture de 22 x 50 millimètres. Visualisez les halos d’ADN et les territoires chromosomiques à l’aide d’un microscope à épifluorescence avec un objectif d’huile 100X. La préparation du halo d’ADN permet de voir le bord d’un noyau résiduel, l’ADN restant dans le noyau résiduel et l’ADN non attaché qui s’est déplacé dans la zone environnante.Des halos d’ADN de fibroblastes dermiques humains en prolifération ont été créés à partir de cellules avec BRDU incorporé et ensuite colorés avec des anticorps anti-BRDU. Les cellules proliférantes étaient positives pour BRDU et anti-pKi-67. Ce protocole a été utilisé pour visualiser les territoires chromosomiques dans les halos d’ADN.Les chromosomes individuels ont été marqués avec des sondes de peinture chromosomiques spécifiques du bras entier pour les chromosomes 1, 13, 17 et 18. L’anti-pKi-67 a été utilisé pour marquer la prolifération des cellules et son absence au sein d’une même culture. Les préparations de halo d’ADN avec des télomères en vert sont montrées ici.Il est possible d’observer la proportion de télomères dans le halo d’ADN, en particulier dans l’image de l’expérience deux. Le pourcentage moyen de télomères était d’environ 17% dans les cellules quiescentes. Des différences dans l’attachement chromosomique ont été détectées dans les fibroblastes de contrôle primaire et dans les cellules malades atteintes du syndrome typique et atypique de Hutchinson-Gilford progeria, exprimant une isoforme Sun1 différente et aucune mutation Lamin A.Les chromosomes un et 13 montrent des différences statistiquement significatives dans leur attachement dans les noyaux résiduels par rapport aux halos d’ADN contrôlés. La position de l’ensemble du territoire chromosomique était corrélée au noyau résiduel et au halo d’ADN. Lorsque vous essayez ce protocole, assurez-vous que les cellules sont ensemencées à la bonne densité et extraites au bon moment.Suite à cette procédure, une immunofluorescence indirecte et ARN FISH peuvent être effectuées.

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