Name: fluorescence in situ hybridization on dna halo preparations to reveal whole chromosomes, telomeres and gene loci
Uploaded: 2021-03-04T13:30:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci at JoVE.com

ברצוננו להודות לפרופ' מיכאל ביטנר על המתנה הנדיבה של גשושיות צביעת זרועות כרומוזומים. LG נתמכה על ידי פרויקט EURO-Laminopathies במימון האיחוד האירופי וקרן המחקר Brunel Progria.

<ol>
	<li>Berezney, R., Coffey, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+nuclear+protein+matrix.">Identification of a nuclear protein matrix.</a> Biochemical Biophysical Research Communications. 60 (4), 1410-1417 (1974).</li><li>Haaf, T., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+ordering+of+YAC+contigs+using+extended+chromatin+and+chromosomes.">High resolution ordering of YAC contigs using extended chromatin and chromosomes.</a> Human Molecular Genetics. 3 (4), 629-633 (1994).</li><li>Parra, I., Windle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+visual+mapping+of+stretched+DNA+by+fluorescent+hybridization.">High resolution visual mapping of stretched DNA by fluorescent hybridization.</a> Nature Genetics. 5 (1), 17-21 (1993).</li><li>Senger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Released+chromatin:+linearized+DNA+for+high+resolution+fluorescence+in+situ+hybridization.">Released chromatin: linearized DNA for high resolution fluorescence in situ hybridization.</a> Human Molecular Genetics. 3 (8), 1275-1280 (1994).</li><li>Florijn, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+DNA+Fiber-FISH+for+genomic+DNA+mapping+and+colour+bar-coding+of+large+genes.">High-resolution DNA Fiber-FISH for genomic DNA mapping and colour bar-coding of large genes.</a> Human Molecular Genetics. 4 (5), 831-836 (1995).</li><li>Elcock, L. S., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+on+DNA+halo+preparations+and+extended+chromatin+fibres.">Fluorescence in situ hybridization on DNA halo preparations and extended chromatin fibres.</a> Methods Molecular Biology. 659, 21-31 (2010).</li><li>Heiskanen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+mapping+by+fiber-FISH.">Visual mapping by fiber-FISH.</a> Genomics. 30 (1), 31-36 (1995).</li><li>Bensimon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+and+sensitive+detection+of+DNA+by+a+moving+interface.">Alignment and sensitive detection of DNA by a moving interface.</a> Science. 265 (5181), 2096-2098 (1994).</li><li>Michalet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+molecular+combing:+stretching+the+whole+human+genome+for+high-resolution+studies.">Dynamic molecular combing: stretching the whole human genome for high-resolution studies.</a> Science. 277 (5331), 1518-1523 (1997).</li><li>Wilson, R. H., Coverley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+DNA+replication+and+the+nuclear+matrix.">Relationship between DNA replication and the nuclear matrix.</a> Genes Cells. 18 (1), 17-31 (2013).</li><li>Wilson, R. H. C., Coverley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation-induced+changes+in+the+DNA-nuclear+matrix+interface,+revealed+by+high-throughput+analysis+of+DNA+halos.">Transformation-induced changes in the DNA-nuclear matrix interface, revealed by high-throughput analysis of DNA halos.</a> Science Reports. 7 (1), 6475 (2017).</li><li>Iarovaia, O. V., Akopov, S. B., Nikolaev, L. G., Sverdlov, E. D., Razin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+transcription+within+chromosomal+DNA+loops+flanked+by+MAR+elements+causes+an+association+of+loop+DNA+with+the+nuclear+matrix.">Induction of transcription within chromosomal DNA loops flanked by MAR elements causes an association of loop DNA with the nuclear matrix.</a> Nucleic Acids Research. 33 (13), 4157-4163 (2005).</li><li>Tandara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+DNA+integrity+testing:+big+halo+is+a+good+predictor+of+embryo+quality+and+pregnancy+after+conventional+IVF.">Sperm DNA integrity testing: big halo is a good predictor of embryo quality and pregnancy after conventional IVF.</a> Andrology. 2 (5), 678-686 (2014).</li><li>Repping, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+spermHALO-FISH+to+determine+DAZ+gene+copy+number.">The use of spermHALO-FISH to determine DAZ gene copy number.</a> Mol Human Reproduction. 9 (4), 183-188 (2003).</li><li>Bikkul, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farnesyltransferase+inhibitor+and+rapamycin+correct+aberrant+genome+organisation+and+decrease+DNA+damage+respectively,+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+fibroblasts.">Farnesyltransferase inhibitor and rapamycin correct aberrant genome organisation and decrease DNA damage respectively, in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts.</a> Biogerontology. 19 (6), 579-602 (2018).</li><li>Telenius, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degenerate+oligonucleotide-primed+PCR:+general+amplification+of+target+DNA+by+a+single+degenerate+primer.">Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer.</a> Genomics. 13 (3), 718-725 (1992).</li><li>Bridger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+pKi-67+with+satellite+DNA+of+the+human+genome+in+early+G1+cells.">Association of pKi-67 with satellite DNA of the human genome in early G1 cells.</a> Chromosome Research. 6, 13-24 (1998).</li><li>Sales Gil, R., Vagnarelli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67:+More+Hidden+behind+a+'Classic+Proliferation+Marker'.">Ki-67: More Hidden behind a 'Classic Proliferation Marker'.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 747-748 (2018).</li><li>Bikkul, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+elongation+through+hTERT+immortalization+leads+to+chromosome+repositioning+in+control+cells+and+genomic+instability+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+fibroblasts,+expressing+a+novel+SUN1+isoform.">Telomere elongation through hTERT immortalization leads to chromosome repositioning in control cells and genomic instability in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts, expressing a novel SUN1 isoform.</a> Genes Chromosomes Cancer. 58 (6), 341-356 (2019).</li><li>Jackson, D. A., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+a+filamentous+nucleoskeleton+with+a+23+nm+axial+repeat.">Visualization of a filamentous nucleoskeleton with a 23 nm axial repeat.</a> EMBO Journal. 7, 3667-3677 (1988).</li><li>Albrethsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+the+nuclear+matrix+proteome.">Unravelling the nuclear matrix proteome.</a> Journal of Proteomics. 72, 71-81 (2009).</li><li>Mika, S., Rost, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMPdb:+Database+of+nuclear+matrix+proteins.">NMPdb: Database of nuclear matrix proteins.</a> Nucleic Acids Research. 33, 160-163 (2005).</li><li>Gavrilov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=of+the+nuclear+matrix-bound+chromatin+hubs+by+a+new+M3C+experimental+procedure.">of the nuclear matrix-bound chromatin hubs by a new M3C experimental procedure.</a> Nucleic Acids Research. 38, 8051-8060 (2010).</li><li>Sjakste, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+nuclear+matrix+proteins+in+malignant+transformation+and+cancer+diagnosis.">Role of the nuclear matrix proteins in malignant transformation and cancer diagnosis.</a> Experimental Oncology. 26 (3), 170-178 (2004).</li><li>Leman, E. S., Getzenberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+structure+as+a+source+of+cancer+specific+biomarkers.">Nuclear structure as a source of cancer specific biomarkers.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 104 (6), 1988-1993 (2008).</li><li>Volpi, E. V., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH+glossary:+an+overview+of+the+fluorescence+in+situ+hybridization+technique.">FISH glossary: an overview of the fluorescence in situ hybridization technique.</a> Biotechniques. 45 (4), 385-386 (2008).</li><li>Bridger, J. M., Foster, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+and+the+Genome.">Senescence and the Genome.</a> Human Interphase Chromosomes. , (2021).</li><li>Foster, H. A., Griffin, D. K., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interphase+chromosome+positioning+in+in+vitro+porcine+cells+and+ex+vivo+porcine+tissues.">Interphase chromosome positioning in in vitro porcine cells and ex vivo porcine tissues.</a> BMC Cell Biology. 13 (1), 30 (2012).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

שיטת הילת הדנ"א היא שיטת בחירה מצוינת בעת ניתוח אינטראקציות בין השלד הגרעין והגנום, עם זאת, ישנם כמה שלבים קריטיים שיש להקפיד עליהם. אחד הפרמטרים החשובים ביותר הוא אופטימיזציה של צפיפות הזריעה התא. אם התאים הופכים למפגש יתר, הילות הדנ"א יחפפו לתאים שכנים ולא יאפשרו לבצע את הניתוח. יש תמיד להפוך את מאגרי ה- CSK והמיצוי לטריים ביום השימוש עם הוספת זרע, זרע ודיגיטונין למאגר המיצוי בסוף תהליך ההכנה כדי לשמור על פעילותם הביולוגית. אם מבצעים Halo-FISH, חשוב מאוד להשתמש בטמפרטורת הדנטורציה הנכונה של הילות הדנ"א כדי לאפשר לגשושית או לצבע לבצע הכלאה לאחר מכן.
מיקרוסקופ אלקטרונים שימש כדי לדמיין את המטריצה הגרעינית, עם מבנים נימיים מזוהים20. עם זאת, מיקרוסקופ אלקטרונים מוגבל מכיוון שלא ניתן להסיק בקלות אסוציאציות מטריצה עם כרומטין. ואכן, שיטת הילה של DNA היא מגוונת יותר בהשוואה למיקרוסקופ אלקטרונים מכיוון שניתן לבחון גנים, כרומוזומים ומצבי תאים ספציפיים. יתר על כן, אנליזה פרוטאומית של חלבוני מטריצה גרעינית נחקרת21,22. שיטה זו טובה להשוואת רכיבי מטריצה גרעינית, במיוחד כאשר משווים תאים חולים, אולם היא אינה מספקת את הפיזור המרחבי ואת ההתקשרות המודגשת על ידי טכניקת הילת הדנ"א הסטנדרטית.
למבחני DNA Halo יש מגבלות. ראשית, כאשר המטריצה מחולצת, זה יכול להתבצע רק על תאים קבועים ולכן הדמיה חיה אינה אפשרית. למרות ששיטת Halo של הדנ"א מהירה יחסית וקלה לביצוע, התהליך הכולל עשוי לקחת בחשבון זמן רב כאשר נלקחים בחשבון תרבית תאים, יצירת גשושיות, Halo-FISH וניתוח.
לכידת תמונות של הילות DNA ו- HALO-FISH באמצעות מיקרוסקופיה ברזולוציית על תשפר מאוד את הרזולוציה של בדיקות ונוגדנים ספציפיים ל- DNA. בנוסף, מכיוון שניתן לפתור באופן ספקטרלי פלואורוכרומים בקלות רבה יותר, ייתכן שניתן יהיה להשתמש במספר בדיקות דנ"א בניסוי יחיד, ולספק מידע רב עוד יותר. שיפורים בטכניקות ביולוגיה מולקולרית כגון לכידת קונפורמציה של כרומוזומים (3C) שימשו כדי לקבוע אינטראקציות של אתרי גנים ולנתח את הארגון המרחבי על הכרומטין בתא. ניתן לשלב מבחני DNA Halo ו-3C, מונח המכונה M3C23, המדגים שוב את יכולת ההסתגלות של טכניקת ה-DNA Halo.
הנתונים המקוריים המוצגים כאן נועדו להדגים את האפשרויות לחקירת התנהגות גנומית וכיצד להציג נתונים אלה. בעזרת נתונים אלה הוכחנו כי ניתן לקבוע הבדלים משמעותיים בהתקשרות הגנום באמצעות (1) בדיקות צביעת כרומוזומים, במחקר זה התגלה כי כרומוזום 18 הוא הכרומוזום הכי פחות מחובר מבין אלה שנותחו (איור 3); (2) אתרי גנים עם הבדלים משמעותיים בין שני אתרי גנים ו(איור 4) (3) טלומרים, שמחוברים פחות חזק בתאים שקטים בהשוואה לתאים מתרבים ומזדקנים (איור 5). אנו מסוגלים להבדיל בין תאים מתרבים לתאים שאינם מתרבים באמצעות נוכחות של סמן ההתפשטות Ki67 antigen, שהוא חלבון בלתי מסיס ולכן נשאר עם הגרעינים השיוריים, או באמצעות שילוב של נוקלאוטידים כדי להדגיש תאים שעברו שלב S בתוך פרק זמן מסוים (איור 2). טכניקה זו גם אפשרה לנו לנתח את התנהגות הגנום בתאים שנפגעים בגרעין השלד שלהם, כלומר תאי למינופתיה וכאן וב- Bikkul et al., 2018 אנו מגלים כי הגנום יכול להיות מחובר פחות חזק בהשוואה לתאי ביקורת וניתן לשחזר אותו כאשר מטפלים בתרופות ספציפיות המשפרות את השפעת מוטציית למין A בתאי HGPS קלאסיים15. אולם אנו מראים כאן נתונים חדשים עבור תאי HGPS AGO8466 לא טיפוסיים, חסרי מוטציית למין A אך מכילים צורה יוצאת דופן של חלבון קומפלקס LINC SUN1 19 שכרומוזום13 מחובר אליו פחות חזק (איור 6).
HALO-FISH היא שיטה ייחודית המאפשרת לחקור אינטראקציות גנומיות עם השלד הגרעיני בשילוב עם אימונופלואורסנציה עקיפה לפתרון חלבונים שלא הוסרו מהליך המיצוי. הוכח כי השלד הנוקלאוסקלטוני משתנה במחלות שונות כגון סוגי סרטן מסוימים19 וחשיבותם של כמה חלבונים הקשורים לשלד גרעיני כסמנים ביולוגיים אבחוניים24,25. לפיכך, לטכניקה זו יש תפקיד חשוב בבחינת השפעת השלד הנוקלאוסקלטוני על ארגון/חוסר ארגון הכרומטין במחלה 15,24,25,27 ואינה מוגבלת לתאים אנושיים, עם בדיקות צביעה כרומוזומליות מבעלי חיים אחרים, ניתן להשתמש באותו פרוטוקול DNA-הילה 28.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated from:
Lauren S. Godwin1 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire
to:
Lauren S. Godwin1 
Emily Roberts2 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

"המטריצה הגרעינית" תוארה לראשונה על ידי ברזני וקופי בשנת 19741. לאחר ביצוע מיצויים עם טוחנות מלח גבוהות וטיפול בנוקלאז על גרעיני כבד חולדה, הם זיהו מסגרת מבנית חלבונית. הליך הילת הדנ"א הותאם לאחר מכן משיטה זו וכולל הסרה של חלבונים מסיסים כך שרק המטריצה הגרעינית (NM) והחלבונים והכרומוזומים הקשורים לננומטר ימשיכו להתקיים. אזורי חיבור DNA ממוקמים בבסיס לולאות DNA ונקראים אזורים מחוברים מטריצה (MARs) או אזורי חיבור פיגומים (SARs), אשר עמידים למיצוי עם ריכוזי מלח גבוהים ודטרגנט יוני ליתיום-3,5-diiodosalicylate (LIS) בהתאמה. בהילות דנ"א, דנ"א הקשור ל-MARs/SARs קשור בתוך הגרעין השיורי, בעוד שלולאות הדנ"א מתרחקות מאתרים אלה ויוצרות את הילת הדנ"א. כיום אנו יודעים שהגנום מעוגן באמצעות תחומים הקשורים ללמינה (LADs) ללמינה הגרעינית ודרך אזורים הקשורים לגרעין (NADs) ואולי דרך מבנים גרעיניים אחרים כגון גופים גרעיניים ספציפיים.
שיטת הילת הדנ"א יכולה לשמש למיפוי פיזי של דנ"א, גנים ואזורים כרומוזומליים מכיוון שהדנ"א והכרומטין המורחבים מספקים רזולוציה גדולה יותר מכיוון שהכרומטין מופשט מהיסטונים והדנ"א נמתחהחוצה 2,3,4,5,6. עם זאת, ישנן כמה מגבלות בעת שימוש הילות DNA עבור יישום זה. לדוגמה, דנ"א הקשור באופן הדוק לגרעינים שיוריים של הילות דנ"א יכול להיות בלתי נגיש לגשושיות ובכך למנוע ממנו ניתוח ומיפוי פיזי6. טכניקות אחרות כגון fiber-FISH 2,4,5,7 וסירוק מולקולרי 8 מאפשרות גם הן מיפוי פיזי ויש להן יתרון בכך שהן מהירות וקלות יחסית לביצוע. שניהם משמשים באופן מועדף למיפוי DNA של גנים על פני הילות DNA. שיטות אלה לחלץ סיבי כרומטין באמצעות שימוש מיצוי ממס או מלח מן הגרעין, עם זאת, סירוק מולקולרי נוטה להיות רבייה טובה יותר 8,9.
ישנן ראיות הולכות וגדלות לכך שלשלד הנוקלאוסקלטון יש תפקיד בתמיכה בתהליכים גרעיניים מרכזיים, כגון אתרי התקשרות לדנ"א, עיצוב מחדש של כרומטין, שעתוק DNA, תיקון DNA ושכפול DNA11,12. ככזו, טכניקת הילת הדנ"א פותחה כדי לחקור את יחסי הגומלין בין השלד והגנום במהלך פעילויות תאיות אלה ושימשה באופן שגרתי ודווחה במחקר. טכניקה זו שימשה גם לחקר אינטראקציות בין הגנום לבין השלד הנוקלאוסקלטוני ביחס להתקדמות המחלה, כאשר זוהו שינויים הקשורים לממאירות במבנה הגרעין11.
טכניקת הילת הדנ"א שימשה גם לחקר הקשר בין הגנום לשלד במהלך ההתפתחות וההתמיינות12. מספר מחקרים השתמשו בווריאציה של טכניקת הילת הדנ"א הידועה בשם הלוספרם13 או SpermHalo-FISH בשילוב עם FISH14. כרומטין הזרע קשור קשר הדוק לחלבונים המכונים פרוטמינים וטכניקה זו פותחה כדי לשפר את הגישה לדנ"א של הזרע. הלוספרם שימש כדי לחקור את שלמות הדנ"א של זרעונים ולקבוע אם קיים נזק לדנ"א. זרעונים עם פחות נזק לדנ"א קשורים לגודל הילת דנ"א גדול יותר, בעוד שלזרעונים עם רמות מוגברות של דנ"א מקוטע ופגום היו הילות קטנות או כלל לא. לפיכך, הלוספרם יכול לשמש כסמן פרוגנוסטי פוטנציאלי של איכות העובר והריון מוצלח עם הפריה חוץ גופית13. דוגמה זו מדגישה את היישומים הקליניים הפוטנציאליים של טכניקה זו. בעבודתנו השתמשנו ב- HALO-FISH כדי להעריך שינויים בהתנהגות הגנום ואת ההשפעה של טיפולים תרופתיים ספציפיים במחלת ההזדקנות המוקדמת תסמונת האצ'ינסון-גילפורד פרוגריה (HGPS)15.
יחד, מחקרים אלה ואחרים, מדגישים את רוחב התהליכים/יישומים שניתן להשתמש בהם בטכניקת הילת הדנ"א כדי לחקור את הטכניקה ואת תועלתה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10388739</td>
			<td>Used to create DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-2&#8242;-deoxy-uridine&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5002-100MG</td>
			<td>Labelled nucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503-100MG</td>
			<td>Labelled nucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Technical</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15562141</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A939-50G</td>
			<td>Check product size of DOP-PCR and nick translation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atypical type 2 HGPS fibroblasts (AG08466)</td>
			<td>Coriell Institute</td>
			<td>AG08466</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16269751</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-16-dUTP</td>
			<td>Roche Diagnostics&#160;</td>
			<td>11093711103</td>
			<td>Labelled nucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378-25G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Classical Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) fibroblasts (AG06297)&#160;</td>
			<td>Coriell Institute</td>
			<td>AG0297</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12608596</td>
			<td>Holds 5 slides or 8 slides back to back</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cot-1 DNA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15279011</td>
			<td>Block nonspecific hybridization in HALO FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>693520-1L</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4030</td>
			<td>Hybridisation mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D141</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-dUTP&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11093088910</td>
			<td>Labelled nucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Cy3</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>443611</td>
			<td>Probe precipitation and HALO FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Cell culture serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10523525</td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18421</td>
			<td>Spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herring sperm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7290</td>
			<td>Probe precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HXP&#8482; Lamp (metal halide microscope lamp)</td>
			<td>OSRAM</td>
			<td>HXP-R120W45C VIS</td>
			<td>Image capture of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10313680</td>
			<td>Cleaning microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516-25ML</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi PCR Kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK2103</td>
			<td>PCR Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM4000 fluorescent microscope with DFC365 FX camera and LAS AF (Version: 4.5.0) image acquisition software.</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Image capture of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani agar&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13274843</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Component of CSK buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10284580</td>
			<td>Cleaning and sterilizing microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-BrdU antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>B2531-100UL</td>
			<td>BrdU visualisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn calf serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16010159</td>
			<td>Cell culture serum and blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nick translation kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR grade water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>693520-1L</td>
			<td>PCR and DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1851</td>
			<td>Component of CSK and extraction buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190-100G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadriPERM&#174; 4 X 12</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>94.6077.307</td>
			<td>Square cell culture dish, polysterene with four compartments.&#160; This has hydrophobic surface, is sterile, non-pyrogenic/endotoxin-fee and non-cytotoxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Ki67 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ZRB1007-25UL</td>
			<td>Proliferation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6513</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber cement</td>
			<td>Halford&#39;s</td>
			<td>101836</td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-50</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6022-25G</td>
			<td>Spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Probe precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>Component of CSK, extraction and SSC buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8532</td>
			<td>Component of SSC buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate&#160;</td>
			<td></td>
			<td>L3771-100G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4264</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Cy3&#160;</td>
			<td>Amersham Life Sciences Ltd, Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>pa43001</td>
			<td>Probe antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>Component of CSK buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>CSK buffer+A66:D68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost&#8482; microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12372098</td>
			<td>Microscope slides: 1 mm thickness, 76 mm length, 26 mm width. Uncoated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swine anti-rabbit TRITC&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TELO-PNA FISH KIT</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>K532511-8</td>
			<td>Delineation of telomeres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253-100G</td>
			<td>Column buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>Component of CSK buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10158962</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416- 100ML</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mountant containing DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole human chromosome probes</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td></td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10108202</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence in situ hybridization on dna halo preparations to reveal whole chromosomes, telomeres and gene loci

הגנום משויך למספר מבנים בתוך גרעיני התא, על מנת לווסת את פעילותו ולעגן אותה במקומות ספציפיים. מבנים אלה ידועים באופן קולקטיבי בשם גרעין השלד וכוללים את הלמינה הגרעינית, הגרעינים וגופים גרעיניים. למרות שקיימות גרסאות רבות של הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) כדי לחקור את הגנום ואת ארגונו, אלה מוגבלות לעתים קרובות על ידי רזולוציה ומספקות מידע לא מספיק על הקשר של הגנום עם מבנים גרעיניים. שיטת הילת הדנ"א משתמשת בריכוזי מלח גבוהים ודטרגנטים לא יוניים כדי ליצור לולאות דנ"א שנשארות מעוגנות למבנים בתוך גרעינים דרך אזורי התקשרות בתוך הגנום. כאן מופקים חלבונים גרעיניים מסיסים, כגון היסטונים, ליפידים ודנ"א שאינם קשורים היטב למטריצה הגרעינית. זה מוביל להיווצרות הילה של דנ"א לא מחובר סביב גרעין שיורי אשר עצמו מכיל DNA הקשור קשר הדוק עם מבנים גרעיניים פנימיים וחלבונים עמידים מיצוי. גדילי דנ"א מורחבים אלה מאפשרים רזולוציה מוגברת ויכולים להקל על מיפוי פיזי. בשילוב עם FISH, לשיטה זו יש יתרון נוסף של חקר אינטראקציות גנומיות עם כל המבנים שהגנום מעוגן בהם. טכניקה זו, המכונה HALO-FISH, היא רב-תכליתית ביותר לפיה ניתן לשלב הילות DNA עם בדיקות חומצות גרעין כדי לחשוף לוקי גנים, כרומוזומים שלמים, לוויין אלפא, טלומרים ואפילו RNA. טכניקה זו מספקת תובנה לגבי ארגון גרעיני ותפקוד בתאים נורמליים ובהתקדמות מחלות כגון עם סרטן.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci at JoVE.com

Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

שילוב של תכשירי הילה של DNA עם הכלאה פלואורסצנטית באתרו מאפשר ניתוח ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות גנומיות עם השלד הנוקלאו-שלד. גנום מחובר מוביל לאותות פלואורסצנטיים היברידיים הממוקמים בתוך הגרעינים השיוריים שחולצו, בעוד שהגנום שאינו מחובר נמצא בהילת הדנ"א המקיפה את הגרעינים השיוריים.

הכלאה פלואורסצנטית באתרה על תכשירי הילה של DNA לחשיפת כרומוזומים שלמים, טלומרים ומיקומי גנים

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These ...

פרוטוקול זה יכול לשמש להערכת קבצים מצורפים לשלד הגרעין במקום להשתמש בריצוף DamID, וזה מבחן תא בודד. היתרון העיקרי בשימוש בשיטה זו הוא שהיא חסכונית ונגישה בקלות. זה יכול להדגיש הבדלים פונקציונליים בין גנים וכרומוזומים שעשויים שלא להתרחש בדרך כלל עם טכניקות הדמיה אחרות.ניתן להעריך באמצעות פרוטוקול זה ארגונים מרחביים ותפקודיים בתוך הגנום בתאי סרטן ופרוגריה מטופלים והבדלים התנהגותיים גנומיים בתאים מזדקנים. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל סוג תא או רקמה לאורך תוחלת החיים ושל כל מחלה. זה יכול לשמש גם אורגניזמים מודל שבו בדיקות זמינות.כדי להתחיל, להכין 500 מיליליטר של 10% חומצה הידרוכלורית ויוצקים אותו לתוך גדולה. יש לזרוק את המגלשות במיקרוסקופ בנפרד לתוך החומצה ולדגור עליהן במשך שעה בטמפרטורת החדר על שייקר שנקבע לשני G.Decant את החומצה מהכוס ולשטוף את המגלשות 10 פעמים במי ברז. לאחר מכן 10 פעמים נוספות במים נטולי יונים.שוטפים את המגלשות במתנול פעמיים ושומרים אותן במתנול עד לעיקור. הטו את המגלשות על מגבת נייר לייבוש ועטפו אותן בנייר כסף לעיקור באוטוקלאבה או בתנור חם. לגדל תאים בתווך המתאים עם סרום לפחות 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני עד 60 עד 70% מפגש הוא הגיע.קצור כל סוג תא וספור את התאים באמצעות המוציטומטר. זרעו פעם אחת 10 לחמשת התאים ב-10 מיליליטר של מדיום לכל שקופית. מוציאים את צלחת התרבית המכילה את המגלשות והתאים המחוברים מהאינקובטור.מחק את המדיום ותייג את השקופיות באמצעות עיפרון. לאחר מכן הניחו אותם בצנצנת קופלין המכילה 50 מיליליטר של חיץ שלד ציטו-שלד קר כקרח. דוגרים על הצנצנת במשך 15 דקות על קרח או בארבע מעלות צלזיוס.השליכו את חיץ השלד הציטו-שלד ושטפו במהירות את השקופיות ב-50 מיליליטר של חיץ הילה חד-פעמי של DNA שלוש פעמים על ידי טבילתם בצנצנת קופלין עם החיץ. מעבירים את המגלשות לצנצנת קופלין המכילה 50 מיליליטר של חיץ מיצוי ודגרים במשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן דוגרים ברצף על השקופיות ב-50 מיליליטר של 10 פעמים, חמש פעמים, פעמיים ופעם אחת מאגר הילת DNA למשך דקה אחת כל אחת.בסיום, טבלו את המגלשות בסדרת אתנול רציפה של 10, 30, 70 ו-95% אתנול. קח את השקופיות דרך סדרה רציפה של אתנול 50 מיליליטר של 70, 90 ו-100% אתנול למשך חמש דקות כל אחת. יבשו אותם באוויר על צלחת חימום.ואז אופים בתנור 70 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. נטרלו את השקופיות על ידי הכנסתן לפורממיד 70% פעמיים בתמיסת SSC למשך שתי דקות בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס. הניחו את המגלשות המפורקות ב-50 מיליליטר אתנול קר כקרח למשך חמש דקות.לאחר מכן העבירו אותם דרך סדרת אתנול של 90, 95 ו-100% בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות כל אחד. בסיום, יבשו את המגלשות באוויר על צלחת חימום. דנטורציה של בדיקות DNA ב 75 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות בלוק חם או אמבט מים.לאחר מכן לדגור אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפני pipeting 10 מיקרוליטר על המגלשה המתאימה. כסו את הגשושית בכיסוי 21 על 21 מ"מ ואטמו אותה במלט גומי. דוגרים על המגלשות למשך 18 שעות לפחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתא הכלאה לח.לאחר הדגירה, בזהירות להסיר את מלט גומי עם מלקחיים. לאחר מכן דוגרים על המגלשות ב-50 מיליליטר של 50% פורממיד פעמיים תמיסת SSC ב-pH שבע שחוממה מראש ל-45 מעלות צלזיוס במשך שלוש דגירות של חמש דקות. לאחר מכן, מקם את המגלשות ב 50 מיליליטר של 0.1 פעמים תמיסת SSC כי כבר מחומם מראש ל 60 מעלות צלזיוס, אבל ממוקם באמבט מים 45 מעלות צלזיוס.דוגרים במשך חמש דקות ומחליפים את החיץ פעמיים לאינקובציות של חמש דקות. מניחים את המגלשות בצנצנת קופלין המכילה 50 מיליליטר של תמיסת SSC פי ארבעה בטמפרטורת החדר ודגרים במשך 15 דקות עם שלושה החלפות חיץ. כדי למנוע קשירת נוגדנים לא ספציפיים, יש למרוח 100 מיקרוליטר של 4% BSA ארבע פעמים על כל שקופית ולכסות אותה בחתיכת סרט פרפין.יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן לדגור על שקופיות עם 100 מיקרוליטר של streptavidin Cy3 מדולל אחד ל 200 במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי לזהות את הבדיקה המסומנת. מניחים את המגלשות בצנצנת קופלין המכילה 50 מיליליטר של תמיסת SSC פי ארבעה בטמפרטורת החדר ודגרים במשך 15 דקות עם שלושה החלפות חיץ.הרכיבו את המגלשות ב-20 מיקרוליטר של תמיסת הרכבה המכילה DAPI ושכבת-על עם כיסוי בגודל 22 על 50 מילימטר. דמיינו הילות DNA ואזורי כרומוזומים באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עם מטרת שמן 100X. הכנת הילת דנ"א מאפשרת לראות את קצה הגרעין השיורי, את הדנ"א שנותר בתוך הגרעין השיורי, ואת הדנ"א הלא מחובר שזרם החוצה אל הסביבה.הילות DNA של פיברובלסטים עוריים אנושיים מתרבים נוצרו מתאים עם BRDU משולב ולאחר מכן הוכתמו בנוגדן נגד BRDU. תאים מתרבים היו חיוביים עבור BRDU ואנטי pKi-67. פרוטוקול זה שימש להמחשת טריטוריות כרומוזומים בתוך הילות DNA.כרומוזומים בודדים סומנו בבדיקות ספציפיות לצביעת כרומוזומי זרוע שלמה עבור כרומוזומים 1, 13, 17 ו-18. Anti-pKi-67 שימש לסימון תאים מתרבים והיעדרם באותה תרבית. תכשירי הילת דנ"א עם טלומרים בירוק מוצגים כאן.אפשר לראות את שיעור הטלומרים בהילת הדנ"א, במיוחד בניסוי שתי תמונות. האחוז הממוצע של הטלומרים היה כ-17% בתאים שקטים. הבדלים בחיבור הכרומוזומים התגלו בפיברובלסטים של בקרה ראשונית ובתאים חולים עם תסמונת פרוגריה טיפוסית ולא טיפוסית של האצ'ינסון-גילפורד, המבטאים איזופורם Sun1 שונה וללא מוטציה של Lamin A.כרומוזומים 1 ו-13 מראים הבדלים מובהקים סטטיסטית בהתקשרותם בתוך הגרעינים השיוריים בהשוואה להילות דנ"א מבוקרות. המיקום של כל טריטוריית הכרומוזומים היה מתואם עם הגרעין השיורי והילה של הדנ"א. בעת ניסיון פרוטוקול זה, ודא כי התאים נזרעים בצפיפות הנכונה ומופקים בזמן הנכון.בעקבות הליך זה, immunofluorescence עקיף ו RNA FISH ניתן לבצע.

Research

JoVE Journal

Biology

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

פלואורסצנציה באתרו הכלאה (FISH) פרוטוקול של זרע אדם

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

שימוש הר שלם באתרו הכלאה קישור לביולוגיה מולקולרית האורגניזם

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

הר שלם<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של E8.5 לעוברי E11.5 עכבר

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

רדיואקטיבי באתרו הכלאה לזיהוי תבניות ביטוי מגוונות גנים רקמות

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

זיהוי של רנ&quot;א נגיפי על ידי הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

תפוקה גבוהה מיפוי פיזי של הכרומוזומים באמצעות אוטומטי<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

ניתוח של שעתוק גנים מהתא הבודד על ידי RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה (דגים)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...