Name: fluorescence in situ hybridization on dna halo preparations to reveal whole chromosomes, telomeres and gene loci
Uploaded: 2021-03-04T13:30:00
Duration: 9 min 7 s
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염색체 팔 페인팅 프로브의 친절한 선물에 대해 Michael Bittner 교수에게 감사드립니다. LG는 EU가 자금을 지원하는 EURO-Laminopathies 프로젝트와 Brunel Progeria Research Fund의 지원을 받았습니다.

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	<li>Berezney, R., Coffey, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+nuclear+protein+matrix.">Identification of a nuclear protein matrix.</a> Biochemical Biophysical Research Communications. 60 (4), 1410-1417 (1974).</li><li>Haaf, T., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+ordering+of+YAC+contigs+using+extended+chromatin+and+chromosomes.">High resolution ordering of YAC contigs using extended chromatin and chromosomes.</a> Human Molecular Genetics. 3 (4), 629-633 (1994).</li><li>Parra, I., Windle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+visual+mapping+of+stretched+DNA+by+fluorescent+hybridization.">High resolution visual mapping of stretched DNA by fluorescent hybridization.</a> Nature Genetics. 5 (1), 17-21 (1993).</li><li>Senger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Released+chromatin:+linearized+DNA+for+high+resolution+fluorescence+in+situ+hybridization.">Released chromatin: linearized DNA for high resolution fluorescence in situ hybridization.</a> Human Molecular Genetics. 3 (8), 1275-1280 (1994).</li><li>Florijn, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+DNA+Fiber-FISH+for+genomic+DNA+mapping+and+colour+bar-coding+of+large+genes.">High-resolution DNA Fiber-FISH for genomic DNA mapping and colour bar-coding of large genes.</a> Human Molecular Genetics. 4 (5), 831-836 (1995).</li><li>Elcock, L. S., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+on+DNA+halo+preparations+and+extended+chromatin+fibres.">Fluorescence in situ hybridization on DNA halo preparations and extended chromatin fibres.</a> Methods Molecular Biology. 659, 21-31 (2010).</li><li>Heiskanen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+mapping+by+fiber-FISH.">Visual mapping by fiber-FISH.</a> Genomics. 30 (1), 31-36 (1995).</li><li>Bensimon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+and+sensitive+detection+of+DNA+by+a+moving+interface.">Alignment and sensitive detection of DNA by a moving interface.</a> Science. 265 (5181), 2096-2098 (1994).</li><li>Michalet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+molecular+combing:+stretching+the+whole+human+genome+for+high-resolution+studies.">Dynamic molecular combing: stretching the whole human genome for high-resolution studies.</a> Science. 277 (5331), 1518-1523 (1997).</li><li>Wilson, R. H., Coverley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+DNA+replication+and+the+nuclear+matrix.">Relationship between DNA replication and the nuclear matrix.</a> Genes Cells. 18 (1), 17-31 (2013).</li><li>Wilson, R. H. C., Coverley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation-induced+changes+in+the+DNA-nuclear+matrix+interface,+revealed+by+high-throughput+analysis+of+DNA+halos.">Transformation-induced changes in the DNA-nuclear matrix interface, revealed by high-throughput analysis of DNA halos.</a> Science Reports. 7 (1), 6475 (2017).</li><li>Iarovaia, O. V., Akopov, S. B., Nikolaev, L. G., Sverdlov, E. D., Razin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+transcription+within+chromosomal+DNA+loops+flanked+by+MAR+elements+causes+an+association+of+loop+DNA+with+the+nuclear+matrix.">Induction of transcription within chromosomal DNA loops flanked by MAR elements causes an association of loop DNA with the nuclear matrix.</a> Nucleic Acids Research. 33 (13), 4157-4163 (2005).</li><li>Tandara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+DNA+integrity+testing:+big+halo+is+a+good+predictor+of+embryo+quality+and+pregnancy+after+conventional+IVF.">Sperm DNA integrity testing: big halo is a good predictor of embryo quality and pregnancy after conventional IVF.</a> Andrology. 2 (5), 678-686 (2014).</li><li>Repping, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+spermHALO-FISH+to+determine+DAZ+gene+copy+number.">The use of spermHALO-FISH to determine DAZ gene copy number.</a> Mol Human Reproduction. 9 (4), 183-188 (2003).</li><li>Bikkul, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farnesyltransferase+inhibitor+and+rapamycin+correct+aberrant+genome+organisation+and+decrease+DNA+damage+respectively,+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+fibroblasts.">Farnesyltransferase inhibitor and rapamycin correct aberrant genome organisation and decrease DNA damage respectively, in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts.</a> Biogerontology. 19 (6), 579-602 (2018).</li><li>Telenius, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degenerate+oligonucleotide-primed+PCR:+general+amplification+of+target+DNA+by+a+single+degenerate+primer.">Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer.</a> Genomics. 13 (3), 718-725 (1992).</li><li>Bridger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+pKi-67+with+satellite+DNA+of+the+human+genome+in+early+G1+cells.">Association of pKi-67 with satellite DNA of the human genome in early G1 cells.</a> Chromosome Research. 6, 13-24 (1998).</li><li>Sales Gil, R., Vagnarelli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67:+More+Hidden+behind+a+'Classic+Proliferation+Marker'.">Ki-67: More Hidden behind a 'Classic Proliferation Marker'.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 747-748 (2018).</li><li>Bikkul, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+elongation+through+hTERT+immortalization+leads+to+chromosome+repositioning+in+control+cells+and+genomic+instability+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+fibroblasts,+expressing+a+novel+SUN1+isoform.">Telomere elongation through hTERT immortalization leads to chromosome repositioning in control cells and genomic instability in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts, expressing a novel SUN1 isoform.</a> Genes Chromosomes Cancer. 58 (6), 341-356 (2019).</li><li>Jackson, D. A., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+a+filamentous+nucleoskeleton+with+a+23+nm+axial+repeat.">Visualization of a filamentous nucleoskeleton with a 23 nm axial repeat.</a> EMBO Journal. 7, 3667-3677 (1988).</li><li>Albrethsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+the+nuclear+matrix+proteome.">Unravelling the nuclear matrix proteome.</a> Journal of Proteomics. 72, 71-81 (2009).</li><li>Mika, S., Rost, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMPdb:+Database+of+nuclear+matrix+proteins.">NMPdb: Database of nuclear matrix proteins.</a> Nucleic Acids Research. 33, 160-163 (2005).</li><li>Gavrilov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=of+the+nuclear+matrix-bound+chromatin+hubs+by+a+new+M3C+experimental+procedure.">of the nuclear matrix-bound chromatin hubs by a new M3C experimental procedure.</a> Nucleic Acids Research. 38, 8051-8060 (2010).</li><li>Sjakste, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+nuclear+matrix+proteins+in+malignant+transformation+and+cancer+diagnosis.">Role of the nuclear matrix proteins in malignant transformation and cancer diagnosis.</a> Experimental Oncology. 26 (3), 170-178 (2004).</li><li>Leman, E. S., Getzenberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+structure+as+a+source+of+cancer+specific+biomarkers.">Nuclear structure as a source of cancer specific biomarkers.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 104 (6), 1988-1993 (2008).</li><li>Volpi, E. V., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH+glossary:+an+overview+of+the+fluorescence+in+situ+hybridization+technique.">FISH glossary: an overview of the fluorescence in situ hybridization technique.</a> Biotechniques. 45 (4), 385-386 (2008).</li><li>Bridger, J. M., Foster, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+and+the+Genome.">Senescence and the Genome.</a> Human Interphase Chromosomes. , (2021).</li><li>Foster, H. A., Griffin, D. K., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interphase+chromosome+positioning+in+in+vitro+porcine+cells+and+ex+vivo+porcine+tissues.">Interphase chromosome positioning in in vitro porcine cells and ex vivo porcine tissues.</a> BMC Cell Biology. 13 (1), 30 (2012).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

DNA 후광 방법은 뉴클레오스켈레톤과 게놈 간의 상호 작용을 분석할 때 선택하는 훌륭한 방법이지만 준수해야 하는 몇 가지 중요한 단계도 있습니다. 가장 중요한 매개 변수 중 하나는 세포 파종 밀도의 최적화입니다. 세포가 과도하게 융합되면 DNA 후광이 이웃 세포와 겹쳐 분석을 수행할 수 없게 됩니다. CSK 및 추출 완충액은 생물학적 활성을 유지하기 위해 준비 과정이 끝날 때 추출 완충액에 스페르민, 스페르미딘 및 디지토닌을 첨가하여 사용 당일에 항상 신선하게 만들어야 합니다. Halo-FISH를 수행하는 경우 DNA 후광의 정확한 변성 온도를 사용하여 프로브 또는 페인트가 이후에 혼성화될 수 있도록 하는 것이 매우 중요합니다.
전자 현미경은 필라멘트 구조가 확인된 핵 매트릭스를 시각화하는 데 사용되어 왔다20. 그러나 전자 현미경은 염색질과의 매트릭스 연관성을 쉽게 추론할 수 없기 때문에 제한적입니다. 실제로 DNA Halo 방법은 특정 유전자, 염색체 및 세포 상태를 모두 검사할 수 있기 때문에 전자 현미경에 비해 더 다재다능합니다. 또한, 핵 매트릭스 단백질의 단백질체 분석이 연구되고 있다21,22. 이 방법은 특히 병든 세포를 비교할 때 핵 매트릭스 구성 요소를 비교하는 데 유용하지만 표준 DNA Halo 기술로 강조된 공간 분포 및 부착을 제공하지 않습니다.
DNA Halo 분석에는 한계가 있습니다. 첫째, 매트릭스가 추출될 때 고정된 세포에서만 수행할 수 있으므로 라이브 이미징이 불가능합니다. DNA Halo 방법은 비교적 빠르고 쉽게 수행할 수 있지만 세포 배양, 프로브 생성, Halo-FISH 및 분석을 모두 고려할 때 전체 프로세스에 시간이 많이 소요될 수 있습니다.
초해상도 현미경을 사용한 DNA Halos 및 HALO-FISH의 이미지 캡처는 DNA 특이적 프로브 및 항체의 해상도를 크게 향상시킬 것입니다. 또한, 형광색소는 스펙트럼으로 더 쉽게 분리될 수 있기 때문에 단일 실험에서 많은 DNA 프로브를 사용하여 더 많은 정보를 제공할 수 있습니다. 염색체 형태 포획(3C)과 같은 분자 생물학 기술의 개선은 유전자좌의 상호 작용을 결정하고 세포의 염색질에 대한 공간 조직을 분석하는 데 사용되었습니다. DNA 헤일로 분석과 3C를 결합할 수 있으며, 이는 M3C23으로 알려진 용어로, DNA 헤일로 기술의 적응성을 다시 보여줍니다.
여기에 제시된 원본 데이터는 게놈 행동 조사의 가능성과 이러한 데이터를 제시하는 방법을 보여주기 위한 것입니다. 이러한 데이터를 통해 우리는 (1) 염색체 페인팅 프로브를 사용하여 게놈 부착의 유의미한 차이를 결정할 수 있음을 입증했으며, 이 연구에서 18번 염색체가 분석된 염색체 중 가장 적게 부착된 염색체임을 밝혔습니다(그림 3). (2) 두 유전자좌 사이에 상당한 차이가 있는 유전자좌(그림 4) (3) 증식 및 노화 세포에 비해 정지 세포에서 덜 강하게 부착되는 텔로미어(그림 5). 우리는 불용성 단백질인 증식 마커 Ki67 항원의 존재를 통해 증식 세포와 비증식 세포를 구별할 수 있으며, 이는 잔류 핵과 함께 남아 있거나 특정 기간 내에 S상을 통과한 세포를 강조하기 위해 뉴클레오티드의 결합을 사용합니다(그림 2). 이 기술을 통해 우리는 핵골격, 즉 laminopathy 세포에서 손상된 세포의 게놈 거동을 분석 할 수 있었으며 Bikkul et al., 2018 우리는 게놈이 대조군 세포와 비교할 때 덜 밀접하게 부착 될 수 있으며 고전적인 HGPS 세포에서 lamin A 돌연변이의 효과를 개선하는 특정 약물로 치료할 때 회복 될 수 있음을 밝혔습니다15. 그러나, 우리는 라민 A 돌연변이가 없지만 염색체 13이 덜 밀접하게 부착되어있는 LINC 복합체 단백질 SUN19 1의 특이한 형태를 포함하는 비정형 HGPS AGO8466 세포에 대한 새로운 데이터를 보여준다 (그림 6).
HALO-FISH는 추출 절차에서 제거되지 않은 단백질을 분해하기 위해 간접 면역형광과 함께 뉴클레오스켈레톤과의 게놈 상호작용 연구를 가능하게 하는 독특한 방법입니다. 뉴클레오스켈레톤은 특정 암 유형19과 같은 다양한 질병에서 변형되고 진단 바이오마커로서 일부 뉴클레오스켈레톤 관련 단백질의 중요성이 입증되었습니다24,25. 따라서, 이 기술은 질병 15,24,25,27에서 염색질 조직/해체에 대한 뉴클레오스켈레톤의 효과를 조사 하는 데 중요한 역할을 하며, 인간 세포에 국한되지 않고, 다른 동물의 염색체 페인팅 프로브를 사용하여 동일한 DNA-후광 프로토콜을 사용할 수 있다 28.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated from:
Lauren S. Godwin1 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire
to:
Lauren S. Godwin1 
Emily Roberts2 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

"핵 매트릭스"는 19741에서 Berezney와 Coffey에 의해 처음 기술되었습니다. 쥐의 간 핵에 대해 높은 염분 몰 농도와 뉴클레아제 처리로 추출을 수행한 후, 그들은 단백질성 구조 프레임워크를 확인했습니다. DNA 후광 절차는 이후에 이 방법에서 채택되었으며 가용성 단백질을 제거하여 핵 매트릭스(NM) 및 NM 관련 단백질 및 염색체만 지속되도록 합니다. DNA 부착 영역은 DNA 루프의 기저부에 위치하며 매트릭스 부착 영역(MAR) 또는 스캐폴드 부착 영역(SAR)이라고 하며, 각각 고염 농도 및 이온 세제 리튬-3,5-디요오도살리실레이트(LIS)를 사용한 추출에 내성이 있습니다. DNA 후광에서 MAR/SAR과 관련된 DNA는 잔류 핵 내에 결합되어 있는 반면 DNA 루프는 이러한 부위에서 멀리 확장되어 DNA 후광을 형성합니다. 우리는 이제 게놈이 라미나 관련 도메인(LAD)을 통해 핵층과 핵층 관련 영역(NAD)을 통해 그리고 아마도 특정 핵체와 같은 다른 핵 구조를 통해 고정된다는 것을 알고 있습니다.
DNA 후광 방법은 염색질에서 히스톤이 제거되고 DNA가 2,3,4,5,6으로 늘어나기 때문에 확장된 DNA와 염색질이 더 큰 분해능을 제공하기 때문에 DNA, 유전자 및 염색체 영역의 물리적 매핑에 사용할 수 있습니다. 그러나 이 응용 프로그램에 DNA 후광을 사용할 때 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, DNA 후광의 잔류 핵과 밀접하게 관련된 DNA는 프로브에 접근할 수 없어 분석 및 물리적 매핑에서 제외될 수 있다6. fiber-FISH 2,4,5,7 및 분자 빗질(molecular combining)8과 같은 다른 기술들 또한 물리적 맵핑을 가능하게 하고, 비교적 빠르고 쉽게 수행할 수 있다는 장점을 갖는다. 둘 다 DNA 후광에 대한 유전자의 DNA 매핑에 우선적으로 사용됩니다. 이러한 방법은 핵에서 용매 또는 염 추출을 사용하여 염색질 섬유를 추출하지만 분자 빗질은 더 나은 재현성을 갖는 경향이 있습니다 8,9.
뉴클레오스켈레톤이 DNA의 부착 부위, 염색질 리모델링, DNA 전사, DNA 복구 및 DNA 복제와 같은 주요 핵 과정을 지원하는 역할을 한다는 증거가 증가하고 있습니다11,12. 따라서 DNA 후광 기술은 이러한 세포 활동 동안 뉴클레오스켈레톤과 게놈 사이의 상호 작용을 조사하기 위해 개발되었으며 연구에서 일상적으로 사용 및 보고되었습니다. 이 기술은 또한 질병 진행과 관련하여 게놈과 뉴클레오스켈레톤 사이의 상호 작용을 조사하는 데 사용되었으며 핵 구조의 악성 종양 관련 변화가 확인되었습니다11.
DNA 후광 기술은 또한 발달과 분화 과정에서 게놈과 뉴클레오스켈레톤 사이의 관계를 조사하는 데 사용되었다12. 많은 연구에서 FISH14와 결합된 경우 halosperm13 또는 SpermHalo-FISH로 알려진 DNA 후광 기술의 변형을 사용했습니다. 정자 염색질은 프로타민으로 알려진 단백질에 밀접하게 결합되어 있으며 이 기술은 정자 DNA에 대한 접근성을 향상시키기 위해 개발되었습니다. 연씨식물은 정자 DNA의 무결성을 조사하고 DNA 손상이 있는지 확인하는 데 사용되었습니다. DNA 손상이 적은 정자는 더 큰 DNA 후광 크기와 관련이 있는 반면, 파편화되고 손상된 DNA 수준이 증가한 정자는 후광이 작거나 전혀 없었습니다. 따라서 염씨식물은 IVF를 통한 배아의 질과 성공적인 임신의 잠재적인 예후 마커로 사용될 수 있습니다13. 이 예는 이 기술의 잠재적인 임상 적용을 강조합니다. 우리의 연구에서 우리는 HALO-FISH를 사용하여 게놈 행동의 변화와 조기 노화 질환 인 허친슨-길 포드 (Hutchinson-Gilford) Progeria 증후군 (HGPS)에서 특정 약물 치료의 효과를 평가했습니다 15.
이러한 연구와 다른 연구를 함께 사용하면 DNA 후광 기술을 연구하는 데 사용할 수 있는 프로세스/응용 프로그램의 폭과 기술의 유용성을 강조합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10388739</td>
			<td>Used to create DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-2&#8242;-deoxy-uridine&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5002-100MG</td>
			<td>Labelled nucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503-100MG</td>
			<td>Labelled nucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Technical</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15562141</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A939-50G</td>
			<td>Check product size of DOP-PCR and nick translation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atypical type 2 HGPS fibroblasts (AG08466)</td>
			<td>Coriell Institute</td>
			<td>AG08466</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16269751</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-16-dUTP</td>
			<td>Roche Diagnostics&#160;</td>
			<td>11093711103</td>
			<td>Labelled nucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378-25G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Classical Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) fibroblasts (AG06297)&#160;</td>
			<td>Coriell Institute</td>
			<td>AG0297</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12608596</td>
			<td>Holds 5 slides or 8 slides back to back</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cot-1 DNA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15279011</td>
			<td>Block nonspecific hybridization in HALO FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>693520-1L</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4030</td>
			<td>Hybridisation mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D141</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-dUTP&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11093088910</td>
			<td>Labelled nucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Cy3</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>443611</td>
			<td>Probe precipitation and HALO FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Cell culture serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10523525</td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18421</td>
			<td>Spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herring sperm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7290</td>
			<td>Probe precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HXP&#8482; Lamp (metal halide microscope lamp)</td>
			<td>OSRAM</td>
			<td>HXP-R120W45C VIS</td>
			<td>Image capture of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10313680</td>
			<td>Cleaning microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516-25ML</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi PCR Kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK2103</td>
			<td>PCR Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM4000 fluorescent microscope with DFC365 FX camera and LAS AF (Version: 4.5.0) image acquisition software.</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Image capture of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani agar&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13274843</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Component of CSK buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10284580</td>
			<td>Cleaning and sterilizing microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-BrdU antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>B2531-100UL</td>
			<td>BrdU visualisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn calf serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16010159</td>
			<td>Cell culture serum and blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nick translation kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR grade water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>693520-1L</td>
			<td>PCR and DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1851</td>
			<td>Component of CSK and extraction buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190-100G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadriPERM&#174; 4 X 12</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>94.6077.307</td>
			<td>Square cell culture dish, polysterene with four compartments.&#160; This has hydrophobic surface, is sterile, non-pyrogenic/endotoxin-fee and non-cytotoxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Ki67 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ZRB1007-25UL</td>
			<td>Proliferation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6513</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber cement</td>
			<td>Halford&#39;s</td>
			<td>101836</td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-50</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6022-25G</td>
			<td>Spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Probe precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>Component of CSK, extraction and SSC buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8532</td>
			<td>Component of SSC buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate&#160;</td>
			<td></td>
			<td>L3771-100G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4264</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Cy3&#160;</td>
			<td>Amersham Life Sciences Ltd, Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>pa43001</td>
			<td>Probe antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>Component of CSK buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>CSK buffer+A66:D68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost&#8482; microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12372098</td>
			<td>Microscope slides: 1 mm thickness, 76 mm length, 26 mm width. Uncoated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swine anti-rabbit TRITC&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TELO-PNA FISH KIT</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>K532511-8</td>
			<td>Delineation of telomeres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253-100G</td>
			<td>Column buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>Component of CSK buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10158962</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416- 100ML</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mountant containing DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole human chromosome probes</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td></td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10108202</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence in situ hybridization on dna halo preparations to reveal whole chromosomes, telomeres and gene loci

게놈은 활동을 조절하고 특정 위치에 고정하기 위해 세포핵 내부의 여러 구조와 관련이 있습니다. 이러한 구조는 총칭하여 핵골격으로 알려져 있으며 핵층, 핵소체 및 핵체를 포함합니다. 게놈과 그 조직을 연구하기 위해 형광 FISH(Fluorescence in situ hybridization)의 많은 변이체가 존재하지만, 이들은 종종 분해능에 의해 제한되고 게놈과 핵 구조의 연관성에 대한 정보가 충분하지 않습니다. DNA 헤일로 방법은 높은 염분 농도와 비이온성 세제를 사용하여 게놈 내의 부착 영역을 통해 핵 내 구조에 고정된 상태로 유지되는 DNA 루프를 생성합니다. 여기에서 히스톤, 지질 및 핵 매트릭스에 단단히 결합되지 않은 DNA와 같은 가용성 핵 단백질이 추출됩니다. 이것은 내부 핵 구조 및 추출 저항성 단백질과 밀접하게 관련된 DNA를 포함하는 잔류 핵을 둘러싼 부착되지 않은 DNA의 후광을 형성합니다. 이러한 확장된 DNA 가닥은 분해능을 높이고 물리적 매핑을 용이하게 할 수 있습니다. FISH와 함께 이 방법은 게놈이 고정되어 있는 모든 구조와의 게놈 상호 작용을 연구하는 추가 이점이 있습니다. HALO-FISH라고 하는 이 기술은 DNA 후광을 핵산 프로브와 결합하여 유전자좌, 전체 염색체, 알파 위성, 텔로미어 및 RNA까지 밝혀낼 수 있는 매우 다재다능합니다. 이 기술은 정상 세포와 암과 같은 질병 진행에서 핵 조직과 기능에 대한 통찰력을 제공합니다.

이 DNA 후광 준비 방법은 젊은 세포와 노인 세포 내에서 게놈 행동의 차이를 확인하려는 노력뿐만 아니라 비정상적인 핵골격계 단백질을 가진 조기 노화 질환에서 파생된 세포에서도 차이를 결정하는 데 도움이 되었습니다15. 그림 1은 잔류 핵의 가장자리, 잔류 핵 내에 남아 있는 DNA, 주변 영역으로 스풀링되어 DNA 후광을 생성하는 부착되지 않은 DNA를 볼 수 있는 DNA 후광의 예를 보여줍니다. 또한 잔류 핵을 얻는 방법과 NE 및 CTE 측정을 보여주는 분석을 보여줍니다. 세포가 S-단계에 있을 때 BrdU와 같은 표지된 뉴클레오티드를 통합하거나 G1 세포에서 핵소체 및 헤테로크로마틴 영역을 나타내는 진단 증식 마커 anti-pKi67을 사용하여 증식 세포와 비증식 세포를 구별할 수 있습니다17,18. 증식 마커에 대해 음성인 confluency를 달성하지 않고 높은 혈청에서 성장한 일차 세포는 노화된 것으로 간주됩니다. 저혈청에서 성장하거나 합류하게 된 일차 세포, 즉 증식 마커에 대해 음성인 접촉 억제는 정지 상태로 간주되며 올바른 영양소와 상황이 주어지면 증식 세포 주기에 다시 들어갈 수 있습니다. Ki67 양성 세포와 음성 세포를 구별할 수 있게 됨으로써 증식, 정지 및 노화 인간 진피 섬유아세포의 차이를 결정할 수 있었습니다. 그림 2는 비증식 세포에서는 발생하지 않는 메커니즘인 DNA 복제 중에 BrdU가 혼입된 세포에서 생성된 증식하는 인간 진피 섬유아세포의 DNA 후광을 표시한 후 항-BrdU 항체로 염색됩니다. 증식 마커인 항-pKi67 항체를 사용한 염색도 도 2에서 볼 수 있습니다. 이것은 강력한 항원이며 FISH 프로토콜에서 살아남으므로 FISH 후 및 사전 장착을 위해 염색할 수 있습니다. 따라서, 증식 세포는 BrdU에 대해 양성(적색)이고 pKi67(적색)은 좌측 열에 항-pKi67(적색)이며, 비증식 세포는 도 2의 우측 열에 실제로 노화 세포가 표시된다. 녹색 신호는 텔로미어 PNA FISH/FITC 키트로 밝혀진 개별 텔로미어입니다. 면역형광과 DNA 후광을 결합하면 증식 세포, 정지 세포 및 노화 세포를 조사할 때 그림 2와 같이 다양한 세포 상태에서 분석할 수 있습니다. 선택한 항체에 따라 분화, 방사선 조사를 통한 DNA 손상 등과 같은 다른 조건을 검사할 수 있습니다.
염색체 영역은 FISH를 사용하여 DNA 후광 내에서 시각화할 수도 있습니다. DNA가 핵 밖으로 스풀링될 수 있도록 하기 때문에 잔류 핵 내부의 게놈 고정 및 그 구조에 따라 DNA 후광에서 발견되는 염색체의 양이 적거나 많기 때문에 염색체 영역 모양이 방해받을 수 있습니다. 그림 3 은 염색체 1, 13, 17 및 18에 대한 특정 전체 팔 염색체 페인팅 프로브(빨간색)와 함께 개별 염색체가 드러난 DNA 후광 패널을 보여줍니다. 항-pKi67(녹색)은 노화 세포를 나타내는 동일한 슬라이드에서 동일한 배양 내에서 증식하는 세포와 그 부재를 표시하는 데 사용되었습니다. CTE/NE로 제시된 이미지와 데이터에서 작은 유전자 결핍 염색체 18은 부착물이 거의 없고 잔류 핵에서 멀리 떨어진 DNA 후광으로 더 멀리 스풀링되고 다른 염색체보다 잔류 핵의 중심에서 훨씬 더 멀리 떨어져 있는 염색체임이 매우 분명합니다. 그러나 이것은 1번 염색체에도 해당됩니다. 증식 마커인 anti-pKi67을 사용하여 동일한 배양 및 동일한 슬라이드에서 노화 세포와 증식하는 것을 비교할 수 있었으며, 이 분석은 이 두 가지 매우 다른 세포 상태 내의 염색체가 잔류 핵 구조와의 부착과 관련하여 서로 크게 다르지 않다는 것을 보여주었습니다.
흥미롭게도, 유전자는 또한 잔류 핵 내에 남아 있거나 DNA 헤일로에 위치하는 것과 관련하여 증식 세포와 노화 세포 사이에 통계적으로 유의미한 차이를 보여주고 있습니다. 그림 4는 빨간색의 표지된 BAC 프로브와 녹색의 항-Ki67로 묘사된 유전자좌로 이를 보여줍니다. DNA Halo 준비 후 증식 세포와 노화 세포의 유전자 위치 사이에는 유의미한 차이가 없습니다. 그러나 DNA 후광 내에는 사이클린 D1 CNDD1 유전자좌보다 훨씬 더 많은 카테닌 알파 1 CTNNA1 유전자좌가 있습니다. 그림 5는 텔로미어가 녹색으로 표시된 DNA 후광 준비를 보여줍니다. 배경은 DNA 후광 내에서 텔로미어 신호를 시각화할 수 있도록 의도적으로 높게 둡니다. 이 데이터 세트에는 정지 세포, 즉 7일 동안 혈청이 굶주린 세포가 포함되었으며 흥미롭게도 증식 및 노화 세포보다 정지 세포의 DNA 후광 내에 부착되지 않고 위치하는 텔로미어가 훨씬 더 많습니다. 도 5a에서 DNA 후광에서 텔로미어의 비율이 관찰될 수 있는데, 특히 이미지 '실험 2'에 대해 관찰할 수 있다. 이는 DNA 후광에서 텔로미어의 평균 백분율이 정지 세포에서 약 17%인 그림 5b와 일치합니다. 노화 세포의 모든 텔로미어가 그 중 일부가 매우 짧기 때문에 볼 수 있는 것은 아니라는 증거가 있습니다.
이 DNA 후광 방법은 병든 세포의 핵 내에서 게놈 상호 작용 변화를 조사하는 데 성공적이었습니다15. 그림 6 은 1 차 대조 섬유 아세포와 전형적인 (라민 A 돌연변이) 및 비정형 허친슨-길 포드 프로 게 리아 증후군이있는 병든 세포에서 염색체 부착의 차이를 보여 주며, 다른 SUN1 이소형과 라민 A 돌연변이가 없습니다19. 염색체 1과 13은 대조군 DNA 후광과 비교할 때 잔류 핵 내에서 부착에 통계적으로 유의미한 차이를 보여줍니다. 그림 6b 는 전체 염색체 영역의 위치를 잔류 핵 및 DNA 헤일로와 연관시킵니다. 1 이하의 값은 염색체가 잔류 핵 내에 위치함을 나타내고 1 이상의 값은 DNA 헤일로 내의 염색체 또는 염색체의 일부를 나타냅니다.
전반적으로, 이것은 세포주기 (증식, 정지 및 노화) 또는 질병 세포 (예 : 프로 게 리아 및 암 세포주)에 영향을 미치는 다양한 조건 하에서 전체 염색체, 특정 유전자 및 텔로미어의 게놈 상호 작용을 조사하는 데 HALO-FISH의 유용성을 강조합니다. 실제로, 이러한 상태 간의 상호 작용의 차이는 핵골격이 핵 내의 주요 과정을 조절하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 의미합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig01.jpg"> 그림 1: 잔류 핵과 DNA 후광을 표시하는 HDF 추출 핵 및 분석 방법 개요. (a) DNA 후광 분석을 통해 준비되고 DAPI로 대조염색된 HDF 핵. 밝게 염색된 잔류 핵은 핵골격에 고정된 DNA를 보여주며, 이것은 DNA의 후광을 형성하는 부착되지 않은 DNA로 둘러싸여 있습니다. 배율 = x 100; 스케일 바 10 μm. (b) 파란색 채널은 DAPI로 염색된 핵과 주변 DNA를 포착합니다. 잔류 핵은 ImageJ를 사용하여 선택 및 제거됩니다. 화살표는 핵 중심에서 잔류 핵 가장자리(NE)까지의 거리를 나타냅니다. (c) 빨간색 채널은 프로브 신호를 나타냅니다. (d) '결과'로 표시된 이미지는 파란색 채널 이미지에 빨간색 채널을 겹쳐 놓은 결과입니다. 이것은 핵 중심에서 가장 먼 염색체 영역 가장자리 (CTE)까지의 거리를 허용합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig02.jpg"> 그림 2: 증식 및 노화 HDF에 대한 텔로미어 PNA FISH를 사용한 DNA 후광 준비. DNA 후광 분석을 거친 HDF의 텔로미어 PNA FISH. 텔로미어 신호는 녹색(FITC)으로 시각화하고, 잔류 및 후광 DNA는 DAPI(파란색)를 사용하여 대조염색하고, 증식 핵은 적색의 간접 면역형광(TRITC)을 통해 항-BrdU 또는 항-pKi67 항체를 사용하여 검출했습니다. 배율 = x 100; 스케일 바 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig03.jpg"> 그림 3: DNA 후광 분석을 사용한 핵골격-염색체 상호 작용 및 분석. (a) 염색체 1, 13, 15, 17 및 18에 특이적인 프로브를 사용하여 DNA 후광 준비를 거친 HDF에서 2D-FISH를 수행했습니다. 전체 염색체를 빨간색(Cy3)으로 칠하고 핵을 pKi67로 조사하여 증식 또는 노화 여부를 확인했습니다. 증식 세포(pKi67+)는 녹색(FITC)으로 묘사된 반면, 노화 세포는 염색되지 않은 상태(pKi67-), 즉 녹색 신호가 감지되지 않았습니다. 배율 = x 100; 스케일 바 10 μm. (b) HALO-FISH를 겪은 증식 및 노화 HDF에서 뉴클레오스켈레톤에 의한 염색체 고정. 측정은 증식(pKi67+) 및 노화(pKi67-) 세포에서 염색체 1, 13, 15, 17 및 18에 대한 각 핵 가장자리(NE)에 대한 가장 먼 염색체 영역 가장자리(CTE)의 비율을 보여줍니다. 오차 막대는 SEM± 나타냅니다. (c) pKi67+ 및 pKi67- 핵에서 특정 염색체의 각 핵 가장자리(NE)에 대한 염색체 영역 가장자리(CTE)의 수정된 상자 그림 표현. Q1 = 하위 사분위수; 최소 = 기록된 최저값; Med = 중앙값; Max = 기록된 최대값; Q3 = 상위 사분위수. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig04.jpg"> 그림 4: HALO-FISH를 사용한 HDF의 유전자 특이적 상호 작용. (a) DNA 후광 추출 핵을 유전자 특이적 프로브(CCND1 및 CTNNA1)로 조사하여 증식 및 노화 세포에 대한 NM에 대한 고정을 조사했습니다. 유전자 신호는 빨간색(Cy3)으로 표시되고 항-pKi67은 증식하는 세포를 나타내고 신호는 녹색(FITC)으로 시각화됩니다. 증식하는 CCND1 이미지의 경우 잔류 핵이 흰색 원 안에 둘러싸여 있고 흰색과 녹색 원 사이의 공간은 DNA 헤일로를 나타냅니다. 배율 = x 100; 스케일 바 10 μm. (b) CCND1 및 CTNNA1에 대한 유전자 특이적 신호는 잔류 핵과 DNA 후광 사이, 그리고 증식 세포와 노화 세포 사이에서 비교됩니다. 오차 막대± <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig04large.jpg" target="_blank">SEM을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig05.jpg"> 그림 5: 텔로미어 PNA-FISH로 프로브된 정지 HDF의 DNA 후광 분석. (a) HDFs의 정지는 7일 동안 저혈청 배지에서 배양함으로써 유도되었다. DNA 후광 분석을 수행하고, FITC 신호(녹색)에 의한 텔로미어의 PNA-FISH를 시각화하고, 잔류 핵 및 주변 DNA 후광을 DAPI(파란색)로 대조염색하였다. 세포는 또한 핵이 증식하지 않도록 항-pKi67 항체로 염색되었습니다. 이것은 두 차례에 걸쳐 반복되었습니다. 배율 = x 100; 스케일 바 10 μm. (b) 증식, 노화 및 정지 HDF 세포에서 DNA 후광 내에 국한된 텔로미어의 평균 백분율 비교. 오차 막대± <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig05large.jpg" target="_blank">SEM을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig06.jpg"> 그림 6 : HALO-FISH26을 사용하여 HGPS 세포에서 뉴클레오스 골격에 대한 전체 염색체 앵커리지 검사. (a) 대조군 HDF (2DD), 고전적 HGPS (AG06297) 및 비정형 유형 2 HGPS (AG08466) 핵은 DNA 후광 준비를 거친 다음 염색체 1, 13, 15 및 17에 대한 전체 염색체 페인트를 사용하여 2D-FISH를 거쳤습니다. 전체 염색체는 녹색(FITC)으로 표시되고 DNA는 DAPI(파란색)로 대조염색되었습니다. 배율 = x 100; 스케일 바 10μm. (b) 추출된 핵 내에서 염색체의 위치는 핵 가장자리(NE)에 대한 평균 염색체 영역 가장자리(CTE)의 비율을 측정하여 결정되었습니다. 1보다 큰 비율은 가장 먼 CTE가 DNA 후광 내의 해당 NE 외부에 있음을 나타내고, 1보다 작은 비율은 가장 먼 CTE가 잔류 핵 내의 NE 내에 있음을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>성분</td>
			<td>부피(μL)</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>5XDOP-PCR 버퍼</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>dNTPmix(제외dTTP)(2mM)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>디티피(2mM)</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>비오틴-16-dUTPor디곡시제닌-11-dUTP</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>DOP프라이머(20μM)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>TaqDNAPolymerase (1U/μL)</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>PCR그레이드워터</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td>템플렛</td>
			<td>5</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 1x 반응에 대한 DOP-PCR 성분 및 부피를 나타내는 표
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>걸음</td>
			<td>사이클</td>
			<td>온도 (섭씨도)</td>
			<td>시간</td>
		</tr><tr><td>초기 변성</td>
			<td>1</td>
			<td>95</td>
			<td>3 분</td>
		</tr><tr><td>변성</td>
			<td rowspan="3">34</td>
			<td>98</td>
			<td>20초</td>
		</tr><tr><td>프라이머 어닐링</td>
			<td>62</td>
			<td>1 분</td>
		</tr><tr><td>확장</td>
			<td>72</td>
			<td>30초</td>
		</tr><tr><td>최종 연장</td>
			<td>1</td>
			<td>72</td>
			<td>5 분</td>
		</tr><tr><td>냉각</td>
			<td></td>
			<td>4</td>
			<td>들다</td>
		</tr></tbody></table>표 2: DOP-PCR 주기, 온도 및 시간 프로파일을 나타내는 표.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>성분</td>
			<td>부피(μL)</td>
		</tr><tr><td>10x NT 완충액(0.5M Tris-HCl pH 8,50 mM MgCl2, 0.5 mg/ml BSA)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>0.1 M 베타-메르캅토에탄올</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>10X 뉴클레오티드 스톡(0.5 mM dATP, 0.5 mM dCTP, 0.5 mM dGTP, 0.5 mM dTTP, 0.5 mg/ml 비오틴-16-dUTP)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>드나제 I(1ng/ml)</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>DNA중합효소 I</td>
			<td>DNA μg당 5U</td>
		</tr><tr><td>DNAtemplate (1 μg)</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>DEPC 처리수</td>
			<td>최대 50 μL</td>
		</tr></tbody></table>표 3: 하나의 프로브에 대한 닉 변환 성분 및 부피를 보여주는 표.

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Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

DNA 후광 제제와 형광 in situ 하이브리드화를 결합하면 뉴클레오스켈레톤과의 게놈 상호작용에 대한 고분해능 분석이 가능합니다. 부착된 게놈은 추출된 잔류 핵 내에 위치한 혼성화된 형광 신호를 유도하는 반면, 부착되지 않은 게놈은 잔류 핵을 둘러싸고 있는 DNA의 후광에 있습니다.

전체 염색체, 텔로미어 및 유전자좌를 밝히기 위한 DNA Halo Preparations의 형광 In Situ 혼성화

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These ...

이 프로토콜은 DamID 시퀀싱을 사용하는 대신 뉴클레오스켈레톤에 대한 부착을 평가하는 데 사용할 수 있으며 단일 세포 분석입니다. 이 방법을 사용하는 주요 이점은 비용 효율적이고 쉽게 액세스할 수 있다는 것입니다. 다른 시각화 기술에서는 일반적으로 발생하지 않을 수 있는 유전자와 염색체 간의 기능적 차이를 강조할 수 있습니다.치료된 암 및 조로증 세포의 게놈 내 공간 및 기능적 조직과 노화 세포의 게놈 행동 차이는 이 프로토콜을 사용하여 평가할 수 있습니다. 이 방법은 수명 및 모든 질병에 걸쳐 모든 세포 또는 조직 유형에 적용할 수 있습니다. 프로브를 사용할 수 있는 모델 유기체에서도 사용할 수 있습니다.시작하려면 500 밀리리터의 10 % 염산을 준비하고 큰 비커에 붓습니다. 현미경 슬라이드를 산에 개별적으로 떨어뜨리고 비커에서 산을 2G.Decant로 설정한 셰이커에서 실온에서 1시간 동안 배양하고 슬라이드를 수돗물로 10회 세척합니다. 그런 다음 탈이온수에서 10회 더 가한다.슬라이드를 메탄올로 두 번 헹구고 멸균 될 때까지 메탄올에 보관하십시오. 슬라이드를 종이 타월에 올려 건조시키고 호일로 싸서 오토클레이브나 뜨거운 오븐에서 살균합니다. 섭씨 37도에서 최소 48시간 동안 혈청과 5% 이산화탄소로 60-70% 밀도에 도달할 때까지 적절한 배지에서 세포를 성장시킵니다.각 세포 유형을 수확하고 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 슬라이드 당 10 밀리리터의 배지에서 5 개의 세포를 1 회 10 회 시드합니다. 슬라이드 및 부착된 세포가 들어 있는 배양 접시를 인큐베이터로부터 제거한다.매체를 버리고 연필을 사용하여 슬라이드에 레이블을 지정합니다. 그런 다음 50 밀리리터의 얼음처럼 차가운 세포 골격 완충액이 들어있는 코플린 병에 넣으십시오. 항아리를 얼음 위에서 또는 섭씨 4도에서 15 분 동안 배양하십시오.세포골격 완충액을 버리고 슬라이드를 완충액이 있는 코플린 병에 담궈 50밀리리터의 일회용 DNA 후광 완충액으로 빠르게 3회 헹굽니다. 슬라이드를 50 밀리리터의 추출 완충액이 들어 있는 코플린 용기로 옮기고 실온에서 4분 동안 인큐베이션한다. 그 후 슬라이드를 50 밀리리터에서 각각 1분 동안 10회, 5회, 2회, 및 1회 DNA 후광 완충액으로 연속적으로 배양한다.완료되면 슬라이드를 10, 30, 70 및 95% 에탄올의 순차적인 에탄올 시리즈에 담급니다. 슬라이드를 70, 90 및 100 % 에탄올의 순차적 인 50 밀리리터 에탄올 시리즈를 각각 5 분 동안 통과시킵니다. 보온 접시에 공기 건조하십시오.그런 다음 섭씨 70도 오븐에서 5 분 동안 굽습니다. 슬라이드를 섭씨 70도에서 2분 동안 70% 포름아미드 2배 SSC 용액에 넣어 변성시킵니다. 변성 슬라이드를 50 밀리리터의 얼음처럼 차가운 70 % 에탄올에 5 분 동안 놓습니다.그런 다음 실온에서 각각 5분 동안 90, 95 및 100%의 에탄올 시리즈를 통해 이동합니다. 완료되면 보온 플레이트에서 슬라이드를 자연 건조시킵니다. DNA 프로브를 섭씨 75도에서 뜨거운 블록 또는 수조에서 10분 동안 변성시킵니다.그런 다음 섭씨 37도에서 30분 동안 배양한 후 10마이크로리터를 적절한 슬라이드에 피펫팅합니다. 프로브를 21 x 21mm 커버슬립으로 덮고 고무 시멘트로 밀봉합니다. 가습된 하이브리드화 챔버에서 섭씨 37도에서 최소 18시간 동안 슬라이드를 배양합니다.배양 후 집게로 고무 시멘트를 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음 섭씨 45도로 예열된 pH 7에서 50% 포름아미드 2배 SSC 용액 50밀리리터에서 슬라이드를 3회 5분 배양합니다. 다음으로, 섭씨 60도까지 예열되었지만 섭씨 45도의 수조에 넣은 SSC 용액의 0.1배 50밀리리터에 슬라이드를 놓습니다.5분 동안 배양하고 5분 배양을 위해 완충액을 두 번 교체합니다. 슬라이드를 실온에서 4배 SSC 용액 50밀리리터가 들어 있는 코플린 병에 넣고 완충액을 3번 교체하면서 15분 동안 배양합니다. 비특이적 항체 결합을 방지하기 위해 100 마이크로 리터의 4 % BSA 4 배 SSC 용액을 각 슬라이드에 적용하고 파라핀 필름으로 오버레이합니다.실온에서 10 분 동안 배양하십시오. 그 후 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 200에 희석된 100 마이크로리터의 스트렙타비딘 Cy3와 함께 배양하여 표지된 프로브를 검출하였다. 슬라이드를 실온에서 4배 SSC 용액 50밀리리터가 들어 있는 코플린 병에 넣고 완충액을 3번 교체하면서 15분 동안 배양합니다.DAPI가 포함된 20마이크로리터의 마운팅 솔루션에 슬라이드를 장착하고 22 x 50mm 커버슬립으로 오버레이합니다. 100X 오일 대물렌즈가 있는 에피형광 현미경을 사용하여 DNA 후광과 염색체 영역을 시각화합니다. DNA 후광 준비를 통해 잔류 핵의 가장자리, 잔류 핵 내에 남아 있는 DNA, 주변 영역으로 스풀링된 부착되지 않은 DNA를 볼 수 있습니다.증식하는 인간 진피 섬유아세포의 DNA 후광은 BRDU가 통합된 세포에서 생성되었으며 이후 항-BRDU 항체로 염색되었습니다. 증식 세포는 BRDU 및 항-pKi-67에 대해 양성이었다. 이 프로토콜은 DNA 후광 내에서 염색체 영역을 시각화하는 데 사용되었습니다.개별 염색체는 염색체 1, 13, 17 및 18에 대한 특정 전체 팔 염색체 페인팅 프로브로 표지되었습니다. 항-pKi-67은 동일한 배양 내에서 증식하는 세포와 그 부재를 표시하는 데 사용되었습니다. 녹색의 텔로미어를 가진 DNA 후광 준비가 여기에 표시됩니다.DNA 후광에서 텔로미어의 비율, 특히 실험 2 이미지에서 관찰 할 수 있습니다. 텔로미어의 평균 비율은 정지 세포에서 약 17%였습니다. 염색체 부착의 차이는 1 차 대조 섬유 아세포와 전형적이고 비정형적인 허친슨-길 포드 (Hutchinson-Gilford) 프로 게 리아 증후군을 가진 병든 세포에서 발견되었으며, 다른 Sun1 이소 형을 발현하고 라민 A 돌연변이는 없다.1번 염색체와 13번 염색체는 제어된 DNA 후광과 비교할 때 잔류 핵 내에서 부착에 통계적으로 유의미한 차이를 보입니다. 전체 염색체 영역의 위치는 잔류 핵 및 DNA 후광과 상관 관계가 있습니다. 이 프로토콜을 시도할 때 세포가 올바른 밀도로 시드되고 적시에 추출되는지 확인하십시오.이 절차에 따라 간접 면역형광 및 RNA FISH를 수행할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

연구

생물학

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

형광 현장에서</em인간의 정자에서> 하이브리드화 (물고기) 프로토콜

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

전체 마운트를 사용하여 현장에서</em분자 생물학과 Organismal를 링크> 하이브 리다이 제이션

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

전체 산<em&gt; 현장에서</emE11.5 마우스 태아에 E8.5의&gt; 하이브리드

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

방사성 현장에서</em조직에서 다양한 유전자 발현 패턴을 검출> 하이브리드화

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

자동을 사용하여 염색체의 높은 처리량 물리적 매핑<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

RNA 형광하여 단일 세포 유전자 전사의 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 (물고기)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...