Name: fluorescence in situ hybridization on dna halo preparations to reveal whole chromosomes, telomeres and gene loci
Uploaded: 2021-03-04T13:30:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci at JoVE.com

Vi vil gjerne takke professor Michael Bittner for den vennlige gaven av kromosomarmmalingssonder. LG ble støttet av EU-finansierte EURO-Laminopathies prosjektet og Brunel Progeria Research Fund.

<ol>
	<li>Berezney, R., Coffey, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+nuclear+protein+matrix.">Identification of a nuclear protein matrix.</a> Biochemical Biophysical Research Communications. 60 (4), 1410-1417 (1974).</li><li>Haaf, T., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+ordering+of+YAC+contigs+using+extended+chromatin+and+chromosomes.">High resolution ordering of YAC contigs using extended chromatin and chromosomes.</a> Human Molecular Genetics. 3 (4), 629-633 (1994).</li><li>Parra, I., Windle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+visual+mapping+of+stretched+DNA+by+fluorescent+hybridization.">High resolution visual mapping of stretched DNA by fluorescent hybridization.</a> Nature Genetics. 5 (1), 17-21 (1993).</li><li>Senger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Released+chromatin:+linearized+DNA+for+high+resolution+fluorescence+in+situ+hybridization.">Released chromatin: linearized DNA for high resolution fluorescence in situ hybridization.</a> Human Molecular Genetics. 3 (8), 1275-1280 (1994).</li><li>Florijn, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+DNA+Fiber-FISH+for+genomic+DNA+mapping+and+colour+bar-coding+of+large+genes.">High-resolution DNA Fiber-FISH for genomic DNA mapping and colour bar-coding of large genes.</a> Human Molecular Genetics. 4 (5), 831-836 (1995).</li><li>Elcock, L. S., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+on+DNA+halo+preparations+and+extended+chromatin+fibres.">Fluorescence in situ hybridization on DNA halo preparations and extended chromatin fibres.</a> Methods Molecular Biology. 659, 21-31 (2010).</li><li>Heiskanen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+mapping+by+fiber-FISH.">Visual mapping by fiber-FISH.</a> Genomics. 30 (1), 31-36 (1995).</li><li>Bensimon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+and+sensitive+detection+of+DNA+by+a+moving+interface.">Alignment and sensitive detection of DNA by a moving interface.</a> Science. 265 (5181), 2096-2098 (1994).</li><li>Michalet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+molecular+combing:+stretching+the+whole+human+genome+for+high-resolution+studies.">Dynamic molecular combing: stretching the whole human genome for high-resolution studies.</a> Science. 277 (5331), 1518-1523 (1997).</li><li>Wilson, R. H., Coverley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+DNA+replication+and+the+nuclear+matrix.">Relationship between DNA replication and the nuclear matrix.</a> Genes Cells. 18 (1), 17-31 (2013).</li><li>Wilson, R. H. C., Coverley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation-induced+changes+in+the+DNA-nuclear+matrix+interface,+revealed+by+high-throughput+analysis+of+DNA+halos.">Transformation-induced changes in the DNA-nuclear matrix interface, revealed by high-throughput analysis of DNA halos.</a> Science Reports. 7 (1), 6475 (2017).</li><li>Iarovaia, O. V., Akopov, S. B., Nikolaev, L. G., Sverdlov, E. D., Razin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+transcription+within+chromosomal+DNA+loops+flanked+by+MAR+elements+causes+an+association+of+loop+DNA+with+the+nuclear+matrix.">Induction of transcription within chromosomal DNA loops flanked by MAR elements causes an association of loop DNA with the nuclear matrix.</a> Nucleic Acids Research. 33 (13), 4157-4163 (2005).</li><li>Tandara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+DNA+integrity+testing:+big+halo+is+a+good+predictor+of+embryo+quality+and+pregnancy+after+conventional+IVF.">Sperm DNA integrity testing: big halo is a good predictor of embryo quality and pregnancy after conventional IVF.</a> Andrology. 2 (5), 678-686 (2014).</li><li>Repping, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+spermHALO-FISH+to+determine+DAZ+gene+copy+number.">The use of spermHALO-FISH to determine DAZ gene copy number.</a> Mol Human Reproduction. 9 (4), 183-188 (2003).</li><li>Bikkul, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farnesyltransferase+inhibitor+and+rapamycin+correct+aberrant+genome+organisation+and+decrease+DNA+damage+respectively,+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+fibroblasts.">Farnesyltransferase inhibitor and rapamycin correct aberrant genome organisation and decrease DNA damage respectively, in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts.</a> Biogerontology. 19 (6), 579-602 (2018).</li><li>Telenius, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degenerate+oligonucleotide-primed+PCR:+general+amplification+of+target+DNA+by+a+single+degenerate+primer.">Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer.</a> Genomics. 13 (3), 718-725 (1992).</li><li>Bridger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+pKi-67+with+satellite+DNA+of+the+human+genome+in+early+G1+cells.">Association of pKi-67 with satellite DNA of the human genome in early G1 cells.</a> Chromosome Research. 6, 13-24 (1998).</li><li>Sales Gil, R., Vagnarelli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67:+More+Hidden+behind+a+'Classic+Proliferation+Marker'.">Ki-67: More Hidden behind a 'Classic Proliferation Marker'.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 747-748 (2018).</li><li>Bikkul, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+elongation+through+hTERT+immortalization+leads+to+chromosome+repositioning+in+control+cells+and+genomic+instability+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+fibroblasts,+expressing+a+novel+SUN1+isoform.">Telomere elongation through hTERT immortalization leads to chromosome repositioning in control cells and genomic instability in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts, expressing a novel SUN1 isoform.</a> Genes Chromosomes Cancer. 58 (6), 341-356 (2019).</li><li>Jackson, D. A., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+a+filamentous+nucleoskeleton+with+a+23+nm+axial+repeat.">Visualization of a filamentous nucleoskeleton with a 23 nm axial repeat.</a> EMBO Journal. 7, 3667-3677 (1988).</li><li>Albrethsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+the+nuclear+matrix+proteome.">Unravelling the nuclear matrix proteome.</a> Journal of Proteomics. 72, 71-81 (2009).</li><li>Mika, S., Rost, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMPdb:+Database+of+nuclear+matrix+proteins.">NMPdb: Database of nuclear matrix proteins.</a> Nucleic Acids Research. 33, 160-163 (2005).</li><li>Gavrilov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=of+the+nuclear+matrix-bound+chromatin+hubs+by+a+new+M3C+experimental+procedure.">of the nuclear matrix-bound chromatin hubs by a new M3C experimental procedure.</a> Nucleic Acids Research. 38, 8051-8060 (2010).</li><li>Sjakste, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+nuclear+matrix+proteins+in+malignant+transformation+and+cancer+diagnosis.">Role of the nuclear matrix proteins in malignant transformation and cancer diagnosis.</a> Experimental Oncology. 26 (3), 170-178 (2004).</li><li>Leman, E. S., Getzenberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+structure+as+a+source+of+cancer+specific+biomarkers.">Nuclear structure as a source of cancer specific biomarkers.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 104 (6), 1988-1993 (2008).</li><li>Volpi, E. V., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH+glossary:+an+overview+of+the+fluorescence+in+situ+hybridization+technique.">FISH glossary: an overview of the fluorescence in situ hybridization technique.</a> Biotechniques. 45 (4), 385-386 (2008).</li><li>Bridger, J. M., Foster, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+and+the+Genome.">Senescence and the Genome.</a> Human Interphase Chromosomes. , (2021).</li><li>Foster, H. A., Griffin, D. K., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interphase+chromosome+positioning+in+in+vitro+porcine+cells+and+ex+vivo+porcine+tissues.">Interphase chromosome positioning in in vitro porcine cells and ex vivo porcine tissues.</a> BMC Cell Biology. 13 (1), 30 (2012).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

DNA-halo-metoden er en utmerket metode for valg når man analyserer interaksjoner mellom nukleoskeleton og genom, men det er noen kritiske trinn som også må overholdes. En av de viktigste parametrene er optimalisering av cellesåingstettheten. Hvis celler blir overflytende, vil DNA-haloene overlappe med naboceller, noe som gjør det umulig å utføre analysen. CSK og ekstraksjonsbufferne må alltid gjøres ferske på bruksdagen med spermin, spermidin og digitonin tilsatt ekstraksjonsbufferen ved slutten av preparatprosessen for å opprettholde sin biologiske aktivitet. Hvis du utfører Halo-FISH, er det ekstremt viktig å bruke riktig denatureringstemperatur på DNA-haloene slik at sonden eller malingen deretter kan hybridisere.
Elektronmikroskopi har blitt brukt til å visualisere den nukleære matrisen, med trådformede strukturer som blir identifisert20. Imidlertid er elektronmikroskopi begrenset da matriseforeninger med kromatin ikke lett kan utledes. Faktisk er DNA Halo-metoden mer allsidig sammenlignet med elektronmikroskopi, da spesifikke gener, kromosomer og celletilstander alle kan undersøkes. Videre studeres proteomisk analyse av nukleære matriksproteiner21,22. Denne metoden er god for å sammenligne kjernefysiske matrisekomponenter, spesielt når man sammenligner syke celler, men den gir ikke den romlige fordelingen og vedleggene som er fremhevet av standard DNA Halo-teknikken.
DNA Halo-analyser har begrensninger. For det første, ettersom matrisen ekstraheres, kan dette bare utføres på faste celler, slik at levende avbildning ikke er mulig. Selv om DNA Halo-metoden er relativt rask og enkel å utføre, kan den totale prosessen være tidkrevende når cellekultur, sondegenerering, Halo-FISH og analyse tas i betraktning.
Bildeopptak av DNA, haloer og HALO-FISH ved hjelp av superoppløsningsmikroskopi vil forbedre oppløsningen av DNA-spesifikke prober og antistoffer. I tillegg, da fluorokromer lettere kan løses spektralt, kan det være mulig å bruke en rekke DNA-prober i et enkelt eksperiment, noe som gir enda mer informasjon. Forbedringer i molekylærbiologiske teknikker som kromosomkonformasjonsfangst (3C) har blitt brukt til å bestemme interaksjoner av genloci og analysere den romlige organisasjonen på kromatin i cellen. DNA Halo-analyser og 3C kan kombineres, et begrep kjent som M3C23, som igjen demonstrerer tilpasningsevnen til DNA Halo-teknikken.
De opprinnelige dataene som presenteres her er for å demonstrere mulighetene for genomadferd, forhør og hvordan man presenterer disse dataene. Med disse dataene har vi vist at det er mulig å bestemme signifikante forskjeller i genomtilknytning ved hjelp av (1) kromosommalingsprober, i denne studien som viser at kromosom 18 er det minst festede kromosomet av de analyserte (figur 3); (2) Genloci med signifikante forskjeller mellom to genloci og (figur 4) (3) telomerer, som er mindre sterkt festet i hvileceller sammenlignet med prolifererende og senescent celler (figur 5). Vi er i stand til å skille mellom prolifererende og ikke-prolifererende celler via tilstedeværelsen av proliferasjonsmarkøren Ki67-antigenet, som er et uoppløselig protein, så forblir med de resterende kjernene eller ved å bruke inkorporering av nukleotider for å markere celler som har vært gjennom S-fase innenfor en bestemt tidsperiode (figur 2). Denne teknikken har også gjort det mulig for oss å analysere genomoppførsel i celler som er kompromittert i deres nukleoskeletoner, dvs. laminopaticeller, og her og i Bikkul et al., 2018 avslører vi at genomet kan være mindre tett festet sammenlignet med kontrollceller og kan gjenopprettes ved behandling med spesifikke legemidler som forbedrer effekten av lamin A-mutasjonen i klassiske HGPS-celler15. Vi viser imidlertid nye data her for de atypiske HGPS AGO8466-cellene, som mangler en lamin A-mutasjon, men som inneholder en uvanlig form av LINC-kompleksproteinet SUN1 19 som kromosom13 er mindre tett festet i (figur 6).
HALO-FISH er en unik metode som gjør det mulig å studere genomiske interaksjoner med nukleoskjelettet i kombinasjon med indirekte immunfluorescens for å løse proteiner som ikke er fjernet fra ekstraksjonsprosedyren. Det er vist at nukleoskjelettet er modifisert ved ulike sykdommer som visse krefttyper19 og betydningen av noen nukleoskeletonassosierte proteiner som diagnostiske biomarkører24,25. Dermed har denne teknikken en viktig rolle i å undersøke effekten av nukleoskeleton på kromatinorganisering / disorganisering i sykdom 15,24,25,27 og er ikke begrenset til humane celler, med kromosomale malingsprober fra andre dyr, kan den samme DNA-halo-protokollen brukes 28.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated from:
Lauren S. Godwin1 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire
to:
Lauren S. Godwin1 
Emily Roberts2 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

Den "kjernefysiske matrisen" ble først beskrevet av Berezney og Coffey i 19741. Etter å ha utført ekstraksjoner med høye saltmolariteter og nukleasebehandling på rotteleverkjerner, identifiserte de et proteinholdig strukturelt rammeverk. DNA-halo-prosedyren ble senere tilpasset fra denne metoden og innebærer fjerning av løselige proteiner slik at bare kjernematrisen (NM) og NM-assosierte proteiner og kromosomer vedvarer. DNA-vedleggsregioner ligger ved basen av DNA-sløyfer og kalles matriksfestede regioner (MAR) eller stillasfesteregioner (SAR), som er resistente mot ekstraksjon med henholdsvis høye saltkonsentrasjoner og ionisk vaskemiddel litium-3,5-diiodosalisylat (LIS). I DNA-haloer er DNA assosiert med MARs / SARs bundet i den gjenværende kjernen, mens DNA-sløyfene strekker seg bort fra disse stedene og danner DNA-haloen. Vi vet nå at genomet er forankret via lamina assosierte domener (LADs) til kjernelamina og gjennom nukleolære assosierte regioner (NADs) og muligens gjennom andre kjernefysiske strukturer som spesifikke kjernelegemer.
DNA-halo-metoden kan brukes til fysisk kartlegging av DNA, gener og kromosomale regioner, da det utvidede DNA og kromatin gir en større oppløsning fordi kromatinet er strippet for histoner og DNA er strukket ut 2,3,4,5,6. Det er imidlertid noen begrensninger når du bruker DNA-haloer for denne applikasjonen. For eksempel kan DNA tett forbundet med gjenværende kjerner av DNA-haloer være utilgjengelig for prober, og dermed utelukke det fra analyse og fysisk kartlegging6. Andre teknikker som fiber-FISH 2,4,5,7 og molekylær kaming 8 muliggjør også fysisk kartlegging og har fordelen av å være relativt rask og enkel å utføre. Begge brukes fortrinnsvis til DNA-kartlegging av gener over DNA-haloer. Disse metodene ekstraherer kromatinfibre ved bruk av løsningsmiddel eller saltekstraksjoner fra kjernen, men molekylær kaming har en tendens til å ha bedre reproduserbarhet 8,9.
Det er et økende bevis på at nukleoskjelettet har en rolle i å støtte viktige kjernefysiske prosesser, for eksempel festesteder for DNA, kromatinremodellering, DNA-transkripsjon, DNA-reparasjon og DNA-replikasjon11,12. Som sådan ble DNA-haloteknikken utviklet for å undersøke samspillet mellom nukleoskjelettet og genomet under disse cellulære aktivitetene, og har blitt rutinemessig brukt og rapportert i forskning. Denne teknikken har også blitt brukt til å undersøke interaksjoner mellom genomet og nukleoskjelettet i forhold til sykdomsprogresjon med malignitetsassosierte endringer i nukleær struktur som blir identifisert11.
DNA-glorieteknikken har også blitt brukt til å undersøke forholdet mellom genomet og nukleoskeleton under utvikling og differensiering12. En rekke studier har brukt en variant av DNA-haloteknikken kjent som halosperm13 eller SpermHalo-FISH hvis kombinert med FISH14. Spermatozoakromatin er tett bundet til proteiner kjent som protaminer, og denne teknikken ble utviklet for å forbedre tilgangen til sædens DNA. Halosperm har blitt brukt til å undersøke integriteten til spermatozoa DNA og avgjøre om DNA-skade er tilstede. Spermatozoa med mindre DNA-skade korrelerer med en større DNA-halostørrelse, mens spermatozoa med økte nivåer av fragmentert og skadet DNA hadde enten små haloer eller ingen i det hele tatt. Dermed kan halosperm brukes som en potensiell prognostisk markør for embryokvalitet og vellykket graviditet med IVF13. Dette eksemplet understreker de potensielle kliniske anvendelsene av denne teknikken. I vårt arbeid har vi brukt HALO-FISH til å vurdere endringer i genomatferd og effekten av spesifikke medikamentelle behandlinger ved den premature aldringssykdommen Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome (HGPS)15.
Sammen belyser disse, og andre studier, bredden av prosesser/applikasjoner som DNA-glorieteknikken kan brukes til å studere og bruken av teknikken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10388739</td>
			<td>Used to create DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-2&#8242;-deoxy-uridine&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5002-100MG</td>
			<td>Labelled nucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503-100MG</td>
			<td>Labelled nucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Technical</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15562141</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A939-50G</td>
			<td>Check product size of DOP-PCR and nick translation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atypical type 2 HGPS fibroblasts (AG08466)</td>
			<td>Coriell Institute</td>
			<td>AG08466</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16269751</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-16-dUTP</td>
			<td>Roche Diagnostics&#160;</td>
			<td>11093711103</td>
			<td>Labelled nucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378-25G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Classical Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) fibroblasts (AG06297)&#160;</td>
			<td>Coriell Institute</td>
			<td>AG0297</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12608596</td>
			<td>Holds 5 slides or 8 slides back to back</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cot-1 DNA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15279011</td>
			<td>Block nonspecific hybridization in HALO FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>693520-1L</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4030</td>
			<td>Hybridisation mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D141</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-dUTP&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11093088910</td>
			<td>Labelled nucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Cy3</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>443611</td>
			<td>Probe precipitation and HALO FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Cell culture serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10523525</td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18421</td>
			<td>Spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herring sperm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7290</td>
			<td>Probe precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HXP&#8482; Lamp (metal halide microscope lamp)</td>
			<td>OSRAM</td>
			<td>HXP-R120W45C VIS</td>
			<td>Image capture of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10313680</td>
			<td>Cleaning microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516-25ML</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi PCR Kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK2103</td>
			<td>PCR Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM4000 fluorescent microscope with DFC365 FX camera and LAS AF (Version: 4.5.0) image acquisition software.</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Image capture of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani agar&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13274843</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Component of CSK buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10284580</td>
			<td>Cleaning and sterilizing microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-BrdU antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>B2531-100UL</td>
			<td>BrdU visualisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn calf serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16010159</td>
			<td>Cell culture serum and blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nick translation kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR grade water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>693520-1L</td>
			<td>PCR and DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1851</td>
			<td>Component of CSK and extraction buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190-100G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadriPERM&#174; 4 X 12</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>94.6077.307</td>
			<td>Square cell culture dish, polysterene with four compartments.&#160; This has hydrophobic surface, is sterile, non-pyrogenic/endotoxin-fee and non-cytotoxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Ki67 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ZRB1007-25UL</td>
			<td>Proliferation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6513</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber cement</td>
			<td>Halford&#39;s</td>
			<td>101836</td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-50</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6022-25G</td>
			<td>Spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Probe precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>Component of CSK, extraction and SSC buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8532</td>
			<td>Component of SSC buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate&#160;</td>
			<td></td>
			<td>L3771-100G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4264</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Cy3&#160;</td>
			<td>Amersham Life Sciences Ltd, Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>pa43001</td>
			<td>Probe antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>Component of CSK buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>CSK buffer+A66:D68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost&#8482; microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12372098</td>
			<td>Microscope slides: 1 mm thickness, 76 mm length, 26 mm width. Uncoated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swine anti-rabbit TRITC&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TELO-PNA FISH KIT</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>K532511-8</td>
			<td>Delineation of telomeres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253-100G</td>
			<td>Column buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>Component of CSK buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10158962</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416- 100ML</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mountant containing DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole human chromosome probes</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td></td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10108202</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence in situ hybridization on dna halo preparations to reveal whole chromosomes, telomeres and gene loci

Genomet er forbundet med flere strukturer inne i cellekjerner, for å regulere aktiviteten og forankre den på bestemte steder. Disse strukturene er kollektivt kjent som nukleoskeleton og inkluderer kjernefysiske lamina, nukleolene og kjernelegemene. Selv om mange varianter av fluorescens in situ hybridisering (FISH) eksisterer for å studere genomet og dets organisasjon, er disse ofte begrenset av oppløsning og gir utilstrekkelig informasjon om genomets tilknytning til kjernefysiske strukturer. DNA-halo-metoden bruker høye saltkonsentrasjoner og ikke-ioniske vaskemidler for å generere DNA-sløyfer som forblir forankret til strukturer i kjerner gjennom festeområder i genomet. Her ekstraheres løselige nukleære proteiner, som histoner, lipider og DNA som ikke er tett bundet til den nukleære matrisen. Dette fører til dannelsen av en halo av ufestet DNA som omgir en gjenværende kjerne som i seg selv inneholder DNA nært forbundet med interne kjernefysiske strukturer og ekstraksjonsresistente proteiner. Disse utvidede DNA-strengene muliggjør økt oppløsning og kan lette fysisk kartlegging. I kombinasjon med FISH har denne metoden den ekstra fordelen av å studere genomiske interaksjoner med alle strukturer som genomet er forankret av. Denne teknikken, kalt HALO-FISH, er svært allsidig der DNA-haloer kan kombineres med nukleinsyreprober for å avsløre genloci, hele kromosomer, alfa-satellitt, telomerer og til og med RNA. Denne teknikken gir et innblikk i nukleær organisasjon og funksjon i normale celler og i sykdomsprogresjon som med kreft.

Denne metoden for DNA-halopreparasjon har hjulpet oss i våre bestrebelser på å bestemme forskjeller i genomoppførsel i unge og gamle celler, men også i celler avledet fra for tidlig aldringssykdommer med avvikende nukleoskeletale proteiner15. Figur 1 viser eksempler på DNA-haloer der det er mulig å se kanten av en gjenværende kjerne, DNA som er igjen i den gjenværende kjernen og det ikke-tilknyttede DNA som har spolt ut i det omkringliggende området og skaper en DNA-halo. Den viser også analysen som viser hvordan restkjernen er oppnådd og NØ- og CTE-målingene. Det er mulig å skille mellom prolifererende og ikke-prolifererende celler ved enten å inkorporere et merket nukleotid som BrdU når celler er i S-fase eller ved å bruke den diagnostiske proliferasjonsmarkøren anti-pKi67, som avslører nukleoler og regioner av heterokromatin i G1-celler17,18. Primærceller dyrket i høyt serum uten å oppnå konfluens, som er negative for proliferasjonsmarkørene, antas å være senescent. Primære celler dyrket i lavt serum eller har blitt konfluente, dvs. kontakthemmet som er negative for proliferasjonsmarkørene, anses som hvilende og vil kunne gå inn i den proliferative cellesyklusen gitt de riktige næringsstoffene og situasjonen. Å kunne skille mellom Ki67 positive og negative celler har gjort det mulig for oss å bestemme forskjeller mellom prolifererende, hvilende og senescent humane dermale fibroblaster. Figur 2 viser DNA-haloer av prolifererende humane dermale fibroblaster opprettet fra celler der BrdU ble inkorporert i dem under DNA-replikasjon, en mekanisme som ikke forekommer i ikke-prolifererende celler, og deretter farget med anti-BrdU-antistoff. Farging med den proliferative markøren anti-pKi67 antistoff er også synlig i figur 2. Dette er et robust antigen og overlever FISH-protokollen og kan derfor farges for post-FISH og pre-montering. Dermed er prolifererende celler positive (røde) for BrdU og anti-pKi67 (røde) i venstre kolonne og ikke-prolifererende celler, faktisk senescentceller i figur 2 vises i høyre kolonne. De grønne signalene er individuelle telomerer avslørt med et telomere PNA FISH / FITC-sett. Kombinering av immunfluorescens med DNA-haloer muliggjør analyse under forskjellige celletilstander, som vist i figur 2 ved undersøkelse av prolifererende, hvilende og senescentceller. Avhengig av hvilket antistoff som velges, kan andre forhold undersøkes, for eksempel differensiering, DNA-skade via bestråling etc.
Kromosomterritorier kan også visualiseres i DNA-haloer ved hjelp av FISH. På grunn av preparatet som tillater spoling av DNA ut av kjernene, kan kromosomets territoriumform forstyrres, med mindre eller større mengder av kromosomet funnet i DNA-haloen, avhengig av forankring av genomet inne i restkjernen og dens strukturer. Figur 3 viser et panel av DNA-haloer hvor individuelle kromosomer har blitt avslørt med spesifikke helarmskromosommalingsprober (rød) for kromosomene 1, 13, 17 og 18. Anti-pKi67 (grønn) har blitt brukt til å markere prolifererende celler og dets fravær i samme kultur, på samme lysbilde, som angir senescentceller. Det er veldig tydelig fra bildene og dataene som presenteres som CTE/NE at det lille genfattige kromosom 18 er et kromosom som har få fester og spoler lenger ut i DNA-haloen vekk fra restkjernene og er betydelig lenger fra sentrum av restkjernene enn de andre kromosomene. Dette gjelder imidlertid også for kromosom 1 også. Ved å bruke den proliferative markøren anti-pKi67 har det også vært mulig å sammenligne prolifererende med senescentceller, innenfor samme kultur og på samme lysbilde, og denne analysen har vist at kromosomer i disse to svært forskjellige cellestatusene ikke er signifikant forskjellige fra hverandre, med hensyn til vedlegg med de gjenværende kjernefysiske strukturene.
Interessant nok viser gener også statistisk signifikante forskjeller mellom prolifererende og senescent celler med hensyn til å forbli i en gjenværende kjerne eller være lokalisert i DNA Halo. Figur 4 viser dette med genloci avgrenset av merkede BAC-sonder i rødt og anti-Ki67 i grønt. Det er ingen signifikante forskjeller mellom genplasseringer i prolifererende versus senescentcellene, etter et DNA Halo-preparat. Imidlertid er det betydelig flere catenin alfa 1 CTNNA1 loci i DNA-haloen enn cyklin D1 CNDD1 loci, hvor det er svært få. Figur 5 viser DNA-halopreparater med telomerer i grønt. Bakgrunnen er bevisst høy for å gjøre det mulig å visualisere telomersignaler i DNA-haloen. I dette settet med datahvileceller, dvs. celler som har vært serumsultet i 7 dager, er inkludert, og interessant nok er det betydelig flere telomerer uten tilknytning og lokalisert i DNA-haloene i hvileceller enn for prolifererende og senescentceller. I figur 5a kan andelen telomerer i DNA-haloen observeres, spesielt for bildet 'Eksperiment 2'. Dette samsvarer med figur 5b hvor gjennomsnittlig prosentandel telomerer i DNA-halo er ca. 17 % i hvileceller. Det er noen bevis på at ikke alle telomerer i senescent celler kan sees som noen av dem kanskje veldig korte.
Denne metoden for DNA-halo har vært vellykket for oss å undersøke genominteraksjonsendringer i kjerner i syke celler15. Figur 6 viser forskjeller i kromosomfeste i primære kontrollfibroblaster og i syke celler med typisk (lamin A-mutasjon) og atypisk Hutchinson-Gilford Progeria syndrom, som uttrykker en annen SUN1-isoform og ingen lamin A-mutasjon19. Kromosomene 1 og 13 viser statistisk signifikante forskjeller i deres vedlegg innenfor de resterende kjernene sammenlignet med kontroll-DNA-haloer. Figur 6b korrelerer posisjonen til hele kromosomterritoriet til restkjernen og DNA Halo. Verdier på 1 eller mindre indikerer at kromosomet ligger i restkjernen og verdier over 1 viser kromosomer eller deler av kromosomer i DNA Halo.
Samlet sett fremhever dette nytten av HALO-FISH i å undersøke genomiske interaksjoner av hele kromosomer, spesifikke gener og telomerer under en rekke forhold som påvirker cellesyklusen (proliferasjon, ro og aldring) eller i sykdomsceller, for eksempel progeria og kreftcellelinjer. Faktisk innebærer forskjellene i interaksjoner mellom disse tilstandene at nukleoskeleton har en viktig rolle i å regulere nøkkelprosesser i kjernen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig01.jpg"> Figur 1: HDF ekstrahert kjerne som viser restkjernen og DNA-haloen og oversikt over analysemetode. (a) En HDF-kjerne fremstilt via DNA-haloanalyse og motfarget med DAPI. Den fargerike restkjernen viser DNA forankret til nukleoskjelettet, og dette er omgitt av det ikke-festede DNA som danner en halo av DNA. Forstørrelse = x 100; skala bar 10 μm. (b) Den blå kanalen fanger den DAPI-fargede kjernen og omkringliggende DNA. Restkjernen velges og fjernes ved hjelp av ImageJ. Pilen viser avstanden fra atomsenteret til den gjenværende kjernefysiske kanten (NE). (c) Den røde kanalen viser sondesignalet. (d) Bildet som er angitt "Resultat" er resultatet av å legge den røde kanalen over det blå kanalbildet; Dette tillater avstanden fra atomsenteret til den lengste kromosomterritoriekanten (CTE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig02.jpg"> Figur 2: DNA-halopreparat med telomer-PNA-FISK på prolifererende og senescerende HDF. Telomere PNA FISH på HDF utsatt for DNA-haloanalyse. Telomersignaler visualiseres i grønt (FITC), rest- og halo-DNA ble motfarget ved hjelp av DAPI (blå) og prolifererende kjerner ble detektert ved bruk av enten anti-BrdU eller anti-pKi67 antistoffer via indirekte immunfluorescens i rødt (TRITC). Forstørrelse = x 100; skala bar 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig03.jpg"> Figur 3: Nukleoskeleton-kromosominteraksjoner og analyse ved hjelp av DNA-haloanalyse. (a) 2D-FISH med sonder spesifikke for kromosomene 1, 13, 15, 17 og 18 ble utført på HDFer utsatt for DNA-halopreparering. Hele kromosomer ble malt i rødt (Cy3) og kjerner ble undersøkt med pKi67 for å avgjøre om de spredte seg eller senescent. Prolifererende celler (pKi67+) ble avgrenset i grønt (FITC), mens senescentceller forble ufarget (pKi67-), det vil si at det ikke ble oppdaget noe grønt signal. Forstørrelse = x 100; skalastang 10 μm. (b) Kromosomforankring ved nukleoskelet i prolifererende og senescent HDFer som hadde gjennomgått HALO-FISH. Målinger viser forholdet mellom lengst kromosomterritoriumkant (CTE) og respektive nukleær kant (NE) for kromosomer 1, 13, 15, 17 og 18 i prolifererende (pKi67+) og senescent (pKi67-) celler. Feilfelt representerer ± SEM. (c) Modifisert boksplottrepresentasjon av kromosomterritoriekant (CTE) til respektive nukleær kant (NE) av spesifikke kromosomer i pKi67+ og pKi67- kjerner. Q1 = lavere kvartil; Min = laveste verdi registrert; Med = median; Maks = maksimal verdi registrert; Q3 = øvre kvartil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig04.jpg"> Figur 4: Genspesifikke interaksjoner i HDF ved bruk av HALO-FISH. (a) DNA halo ekstraherte kjerner ble undersøkt med genspesifikke prober (CCND1 og CTNNA1) for å undersøke deres forankring til NM på prolifererende og senescent celler. Gensignalene er vist i rødt (Cy3) og anti-pKi67 viser prolifererende celler og signalet visualiseres i grønt (FITC). For det prolifererende CCND1-bildet er den gjenværende kjernen innelukket i den hvite sirkelen, og mellomrommet mellom den hvite og grønne sirkelen viser DNA Halo. Forstørrelse = x 100; skala bar 10 μm. (b) Genspesifikke signaler for CCND1 og CTNNA1 sammenlignes mellom gjenværende kjerne og DNA-halo, og også mellom prolifererende og senescentceller. Feilfelt representerer ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig05.jpg"> Figur 5: DNA-haloanalyse på hvilende HDFer undersøkt med telomer PNA-FISH. (a) Stillhet av HDF ble indusert av dyrkning i lavt serummedium i 7 dager. DNA-haloanalysen ble utført, og PNA-FISH muliggjorde visualisering av telomerer ved FITC-signal (grønn) og gjenværende kjerne og omkringliggende DNA-halo ble motfarget med DAPI (blå). Celler ble også farget med anti-pKi67 antistoff for å sikre at kjerner ikke spredte. Dette ble gjentatt ved to separate anledninger. Forstørrelse = x 100; skala bar 10 μm. (b) Sammenligning av gjennomsnittlig prosentandel telomerer lokalisert i DNA-haloen i prolifererende, senescent og hvilende HDF-celler. Feilfelt representerer ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig06.jpg"> Figur 6: Undersøkelse av helkromosomforankring til nukleoskjelettet i HGPS-celler med HALO-FISH26. (a) Kontroll HDF (2DD), klassisk HGPS (AG06297) og atypiske type 2 HGPS (AG08466) kjerner gjennomgikk DNA halo forberedelse og deretter 2D-FISH ved hjelp av hele kromosommaling for kromosom 1, 13, 15 og 17. Hele kromosomer er avbildet i grønt (FITC) og DNA ble motfarget med DAPI (blå). Forstørrelse = x 100; skala bar 10 μm. (b) Plassering av kromosomer i ekstraherte kjerner ble bestemt ved å måle forholdet mellom gjennomsnittlig kromosomterritoriumkant (CTE) og kjernekanten (NE). Et forhold over 1 viser at den lengste CTE ligger utenfor den tilsvarende NE i DNA-haloen, mens et forhold under 1 betyr at den lengste CTE ligger innenfor NE i restkjernen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Bestanddeler</td>
			<td>Volum(μL)</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>5XDOP-PCRbuffer</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>dNTPmix(withoutdTTP)(2mM)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>dTTP(2mM)</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Biotin-16-dUTPorDigoxigenin-11-dUTP</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>DOPprimer (20μM)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>TaqDNAPolymerase(1U/μL)</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>PCRgradewater</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td>Mal</td>
			<td>5</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Tabell som viser DOP-PCR-komponentene og volumene for en 1x-reaksjon
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Skritt</td>
			<td>Sykluser</td>
			<td>Temp (grad Celsius)</td>
			<td>Tid</td>
		</tr><tr><td>Innledende denaturering</td>
			<td>1</td>
			<td>95</td>
			<td>3 min</td>
		</tr><tr><td>Denaturering</td>
			<td rowspan="3">34</td>
			<td>98</td>
			<td>20 s</td>
		</tr><tr><td>Primer glødning</td>
			<td>62</td>
			<td>1 min</td>
		</tr><tr><td>Forlengelse</td>
			<td>72</td>
			<td>30 s</td>
		</tr><tr><td>Endelig forlengelse</td>
			<td>1</td>
			<td>72</td>
			<td>5 min</td>
		</tr><tr><td>Kjøling</td>
			<td></td>
			<td>4</td>
			<td>Holde</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 2: Tabell som viser DOP-PCR-syklusen, temperatur og tidsprofil.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Konstituerende</td>
			<td>Volum(μL)</td>
		</tr><tr><td>10x NT-buffer (0,5M Tris-HCl pH 8,50 mM MgCl2, 0,5 mg/ml BSA)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>0,1 M beta-merkaptoetanol</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>10X nukleotidlager (0,5 mM dATP, 0,5 mM dCTP, 0,5 mM dGTP, 0,5 mM dTTP, 0,5 mg/ml biotin-16-dUTP)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Dnase I (1 ng/ml)</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>DNApolymerase I</td>
			<td>5U per μg DNA</td>
		</tr><tr><td>DNAmal (1 μg)</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>DEPC-behandlet vann</td>
			<td>Til 50 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 3: Tabell som viser nick-oversettelseskomponentene og -volumene for en sonde.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci at JoVE.com

Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

Kombinering av DNA-halopreparater med fluorescens in situ-hybridisering muliggjør høyoppløselig analyse av genomiske interaksjoner med nukleoskeletonet. Vedlagt genom fører til hybridiserte fluorescerende signaler lokalisert i de gjenværende ekstraherte kjernene, mens ikke-festet genom er i haloen av DNA som omgir de resterende kjernene.

Fluorescens in situ hybridisering på DNA Halo-preparater for å avsløre hele kromosomer, telomerer og genloci

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These ...

Denne protokollen kan brukes til å vurdere vedlegg til nukleoskjelettet i stedet for å bruke DamID-sekvensering, og det er en enkeltcelleanalyse. Den største fordelen med å bruke denne metoden er at den er kostnadseffektiv og lett tilgjengelig. Det kan fremheve funksjonelle forskjeller mellom gener og kromosomer som normalt ikke forekommer med andre visualiseringsteknikker.Romlige og funksjonelle organisasjoner innenfor genomet i behandlede kreft- og progericeller og genomiske atferdsforskjeller i senescentceller kan vurderes ved hjelp av denne protokollen. Denne metoden kan brukes på hvilken som helst celle- eller vevstype over hele levetiden og av enhver sykdom. Den kan også brukes i modellorganismer der sonder er tilgjengelige.For å begynne, lag 500 ml 10% saltsyre og hell den i et stort beger. Slippmikroskop glir individuelt inn i syren og inkuberer dem i en time ved romtemperatur på en shaker satt til to G.Dekanter syren fra begeret og vask lysbildene 10 ganger i vann fra springen. Deretter ytterligere 10 ganger i avionisert vann.Skyll lysbildene i metanol to ganger og hold dem i metanol til sterilisering. Tips lysbildene på et papirhåndkle for å tørke og pakk dem inn i folie for sterilisering i en autoklav eller varm ovn. Dyrk celler i egnet medium med serum i minst 48 timer ved 37 grader Celsius og 5 % karbondioksid til 60 til 70 % konfluens er nådd.Høst hver celletype og telle cellene ved hjelp av et hemocytometer. Frø en ganger 10 til de fem cellene i 10 milliliter medium per lysbilde. Fjern kulturskålen som inneholder lysbildene og vedlagte celler fra inkubatoren.Kast mediet og merk lysbildene med blyant. Legg dem deretter i en kobberkrukke som inneholder 50 ml iskald cytoskelettbuffer. Inkuber krukken i 15 minutter på is eller ved fire grader Celsius.Kast cytoskelettbufferen og skyll lysbildene raskt i 50 ml engangs DNA-halobuffer tre ganger ved å dyppe dem i en kobberkrukke med bufferen. Overfør lysbilder til en kobberkrukke som inneholder 50 ml ekstraksjonsbuffer og inkuber i fire minutter ved romtemperatur. Deretter inkuberer du lysbildene fortløpende i 50 milliliter 10 ganger, fem ganger, to ganger og en gang DNA-halobuffer i ett minutt hver.Når du er ferdig, dypp lysbildene gjennom en sekvensiell etanolserie på 10, 30, 70 og 95% etanol. Ta lysbildene gjennom en sekvensiell 50 milliliter etanolserie med 70, 90 og 100 % etanol i fem minutter hver. Lufttørk dem på en varmeplate.Stek deretter i en 70 graders Celsius-ovn i fem minutter. Denaturer lysbildene ved å plassere dem i 70% formamid to ganger SSC-løsning i to minutter ved 70 grader Celsius. Plasser de denaturerte lysbildene i 50 ml iskald 70% etanol i fem minutter.Flytt dem deretter gjennom en etanolserie på 90, 95 og 100% ved romtemperatur i fem minutter hver. Når du er ferdig, lufttørker du lysbildene på en varmeplate. Denaturer DNA-sondene ved 75 grader Celsius i 10 minutter i en varm blokk eller vannbad.Inkuber dem deretter ved 37 grader Celsius i 30 minutter før du pipetterer 10 mikroliter på riktig lysbilde. Legg sonden over med et deksel på 21 x 21 millimeter og forsegl den med gummisement. Inkuber lysbildene i minst 18 timer ved 37 grader Celsius i et fuktet hybridiseringskammer.Etter inkubasjonen, fjern forsiktig gummisementet med tang. Deretter inkuberer du lysbildene i 50 milliliter 50% formamid, to ganger SSC-løsning ved pH syv som har blitt forvarmet til 45 grader Celsius i tre fem-minutters inkubasjoner. Deretter plasserer du lysbildene i 50 milliliter 0,1 ganger SSC-løsning som er forvarmet til 60 grader Celsius, men plassert i et 45 grader Celsius vannbad.Inkuber i fem minutter og erstatt bufferen to ganger for fem minutters inkubasjoner. Plasser lysbildene i en kobberkrukke som inneholder 50 ml fire ganger SSC-løsning ved romtemperatur og inkuber i 15 minutter med tre bufferendringer. For å forhindre uspesifikk antistoffbinding, bruk 100 mikroliter 4% BSA fire ganger SSC-løsning på hvert lysbilde og legg det over med et stykke parafinfilm.Inkuber ved romtemperatur i 10 minutter. Deretter inkuberes lysbildene med 100 mikroliter streptavidin Cy3 fortynnet en i 200 i en time ved romtemperatur for å oppdage den merkede sonden. Plasser lysbildene i en kobberkrukke som inneholder 50 ml fire ganger SSC-løsning ved romtemperatur og inkuber i 15 minutter med tre bufferendringer.Monter lysbildene i 20 mikroliter av en monteringsløsning som inneholder DAPI og overlegg med et deksel på 22 x 50 millimeter. Visualiser DNA-haloer og kromosomterritorier ved hjelp av et epifluorescensmikroskop med et 100X oljemål. DNA-halo-preparasjon gjør det mulig å se kanten av en gjenværende kjerne, DNA som er igjen i restkjernen, og det ikke-festede DNA som har spolt ut i det omkringliggende området.DNA-haloer av prolifererende humane dermal fibroblaster ble opprettet fra celler med innlemmet BRDU og deretter farget med anti-BRDU antistoff. Prolifererende celler var positive for BRDU og anti-pKi-67. Denne protokollen ble brukt til å visualisere kromosomterritorier i DNA-haloer.Individuelle kromosomer ble merket med spesifikke helarmskromosommalingsprober for kromosomene 1, 13, 17 og 18. Anti-pKi-67 ble brukt til å markere prolifererende celler og dets fravær i samme kultur. DNA-gloriepreparater med telomerer i grønt er vist her.Det er mulig å observere andelen telomerer i DNA-haloen, spesielt i eksperiment to-bildet. Gjennomsnittlig prosentandel telomerer var ca. 17 % i hvileceller. Forskjeller i kromosomtilknytning ble påvist i primære kontrollfibroblaster og i syke celler med typisk og atypisk Hutchinson-Gilford progeria syndrom, som uttrykker en annen Sun1 isoform og ingen Lamin A-mutasjon.Kromosomene en og 13 viser statistisk signifikante forskjeller i deres vedlegg innenfor de resterende kjernene sammenlignet med kontrollerte DNA-haloer. Posisjonen til hele kromosomområdet var korrelert med gjenværende kjerne og DNA-halo. Når du prøver denne protokollen, må du sørge for at cellene blir sådd i riktig tetthet og ekstrahert til rett tid.Etter denne prosedyren kan indirekte immunfluorescens og RNA FISH utføres.

Research

JoVE Journal

Biology

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioaktivt In situ Hybridisering for å oppdage Diverse Gene Expression Mønstre i Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Påvisning av virale RNA ved fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Fysisk Kartlegging av kromosomer som bruker Automated<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Analyse av encellede gentranskripsjon av RNA Fluorescent<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...