Name: fluorescence in situ hybridization on dna halo preparations to reveal whole chromosomes, telomeres and gene loci
Uploaded: 2021-03-04T13:30:00
Duration: 9 min 7 s
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Gostaríamos de agradecer ao Prof. Michael Bittner pelo gentil presente das sondas de pintura de braço cromossômico. A LG foi apoiada pelo projeto EURO-Laminopathies financiado pela UE e pelo Brunel Progeria Research Fund.

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	<li>Berezney, R., Coffey, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+nuclear+protein+matrix.">Identification of a nuclear protein matrix.</a> Biochemical Biophysical Research Communications. 60 (4), 1410-1417 (1974).</li><li>Haaf, T., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+ordering+of+YAC+contigs+using+extended+chromatin+and+chromosomes.">High resolution ordering of YAC contigs using extended chromatin and chromosomes.</a> Human Molecular Genetics. 3 (4), 629-633 (1994).</li><li>Parra, I., Windle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+visual+mapping+of+stretched+DNA+by+fluorescent+hybridization.">High resolution visual mapping of stretched DNA by fluorescent hybridization.</a> Nature Genetics. 5 (1), 17-21 (1993).</li><li>Senger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Released+chromatin:+linearized+DNA+for+high+resolution+fluorescence+in+situ+hybridization.">Released chromatin: linearized DNA for high resolution fluorescence in situ hybridization.</a> Human Molecular Genetics. 3 (8), 1275-1280 (1994).</li><li>Florijn, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+DNA+Fiber-FISH+for+genomic+DNA+mapping+and+colour+bar-coding+of+large+genes.">High-resolution DNA Fiber-FISH for genomic DNA mapping and colour bar-coding of large genes.</a> Human Molecular Genetics. 4 (5), 831-836 (1995).</li><li>Elcock, L. S., Bridger, J. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=of+the+nuclear+matrix-bound+chromatin+hubs+by+a+new+M3C+experimental+procedure.">of the nuclear matrix-bound chromatin hubs by a new M3C experimental procedure.</a> Nucleic Acids Research. 38, 8051-8060 (2010).</li><li>Sjakste, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+nuclear+matrix+proteins+in+malignant+transformation+and+cancer+diagnosis.">Role of the nuclear matrix proteins in malignant transformation and cancer diagnosis.</a> Experimental Oncology. 26 (3), 170-178 (2004).</li><li>Leman, E. S., Getzenberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+structure+as+a+source+of+cancer+specific+biomarkers.">Nuclear structure as a source of cancer specific biomarkers.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 104 (6), 1988-1993 (2008).</li><li>Volpi, E. V., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH+glossary:+an+overview+of+the+fluorescence+in+situ+hybridization+technique.">FISH glossary: an overview of the fluorescence in situ hybridization technique.</a> Biotechniques. 45 (4), 385-386 (2008).</li><li>Bridger, J. M., Foster, H. 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Os autores não têm nada a revelar.

O método do halo de DNA é um excelente método de escolha para analisar interações entre o nucleoesqueleto e o genoma, no entanto, existem algumas etapas críticas que também devem ser seguidas. Um dos parâmetros mais importantes é a otimização da densidade de semeadura celular. Se as células se tornarem mais confluentes, os halos de DNA se sobreporão às células vizinhas, impossibilitando a realização da análise. Os tampões CSK e de extracção devem ser sempre renovados no dia da utilização, com espermina, espermidina e digitonina a serem adicionadas ao tampão de extracção no final do processo de preparação para manter a sua actividade biológica. Ao realizar Halo-FISH, é extremamente importante usar a temperatura de desnaturação correta dos halos de DNA para permitir que a sonda ou tinta hibridize posteriormente.
A microscopia eletrônica tem sido utilizada para visualizar a matriz nuclear, sendo identificadas estruturasfilamentosas20. No entanto, a microscopia eletrônica é limitada, pois associações de matriz com cromatina não podem ser facilmente deduzidas. De fato, o método de DNA Halo é mais versátil em comparação com a microscopia eletrônica, pois genes, cromossomos e estados celulares específicos podem ser examinados. Além disso, a análise proteômica de proteínas da matriz nuclear está sendo estudada21,22. Este método é bom para comparar componentes da matriz nuclear, particularmente quando se compara células doentes, no entanto, não fornece a distribuição espacial e os anexos destacados pela técnica padrão de DNA Halo.
Os ensaios de DNA Halo têm limitações. Em primeiro lugar, como a matriz é extraída, isso só pode ser realizado em células fixas, de modo que imagens vivas não são possíveis. Embora o método de Halo de DNA seja relativamente rápido e fácil de executar, o processo geral pode ser demorado quando a cultura de células, a geração de sonda, o Halo-FISH e a análise são levados em consideração.
A captura de imagens de Halos de DNA e HALO-FISH usando microscopia de super-resolução melhoraria muito a resolução de sondas e anticorpos específicos de DNA. Além disso, como os fluorocromos podem ser mais facilmente resolvidos espectralmente, pode ser possível usar várias sondas de DNA em um único experimento, fornecendo ainda mais informações. Melhorias em técnicas de biologia molecular, como a captura de conformação cromossômica (3C), têm sido usadas para determinar interações de loci gênicos e analisar a organização espacial da cromatina na célula. Ensaios de DNA Halo e 3C podem ser combinados, um termo conhecido como M3C23, demonstrando novamente a adaptabilidade da técnica de DNA Halo.
Os dados originais aqui apresentados são para demonstrar as possibilidades de interrogação do comportamento genômico e como apresentar esses dados. Com esses dados demonstramos que é possível determinar diferenças significativas na ligação genômica utilizando (1) sondas de pintura cromossômica, neste estudo revelando que o cromossomo 18 é o menos aderido dentre os analisados (Figura 3); (2) Loci gênicos com diferenças significativas entre dois loci gênicos e (Figura 4) (3) Telômeros, que estão menos fortemente aderidos em células quiescentes em comparação com células em proliferação e senescentes (Figura 5). Podemos diferenciar células em proliferação e não proliferantes através da presença do marcador de proliferação Ki67 antígeno que é uma proteína insolúvel assim permanece com os núcleos residuais ou usando a incorporação de nucleotídeos para destacar células que passaram pela fase S dentro de um período de tempo específico (Figura 2). Essa técnica também nos permitiu analisar o comportamento do genoma em células que estão comprometidas em seus nucleoesqueletos, ou seja, células de laminopatia e aqui e em Bikkul et al., 2018 revelamos que o genoma pode ser menos firmemente ligado quando comparado às células controle e pode ser restaurado quando tratado com drogas específicas que amenizam o efeito da mutação da lamina A em células HGPS clássicas15. No entanto, mostramos novos dados aqui para as células atípicas HGPS AGO8466, sem mutação na lamina A, mas contendo uma forma incomum da proteína do complexo LINC SUN1 19 na qual o cromossomo13 está menos firmemente ligado (Figura 6).
HALO-FISH é um método único por permitir o estudo de interações genômicas com o nucleoesqueleto em combinação com imunofluorescência indireta para resolver proteínas não removidas do procedimento de extração. Tem sido demonstrado que o nucleoesqueleto é modificado em várias doenças, como certos tipos de câncer19 e a importância de algumas proteínas associadas ao nucleoesqueleto como biomarcadoresdiagnósticos 24,25. Assim, essa técnica tem um papel importante no exame do efeito do nucleoesqueleto na organização/desorganização da cromatina na doença 15,24,25,27 e não se restringe às células humanas, com sondas de pintura cromossômica de outros animais, o mesmo protocolo DNA-halo poderia ser empregado 28.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated from:
Lauren S. Godwin1 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire
to:
Lauren S. Godwin1 
Emily Roberts2 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

A "matriz nuclear" foi descrita pela primeira vez por Berezney e Coffey em 19741. Após realizarem extrações com altas molaridades salinas e tratamento com nucleases em núcleos hepáticos de ratos, eles identificaram um arcabouço estrutural proteico. O procedimento do halo de DNA foi posteriormente adaptado deste método e envolve a remoção de proteínas solúveis para que apenas a matriz nuclear (NM) e as proteínas e cromossomos associados à MN persistam. As regiões de ligação ao DNA estão localizadas na base das alças de DNA e são chamadas de regiões ligadas à matriz (MARs) ou regiões de ligação do andaime (SARs), que são resistentes à extração com altas concentrações de sal e detergente iônico lítio-3,5-diiodossalicilato (LIS), respectivamente. Nos halos de DNA, o DNA associado a MARs/SARs está ligado dentro do núcleo residual, enquanto as alças de DNA se estendem para longe desses locais e formam o halo de DNA. Sabemos agora que o genoma está ancorado via domínios associados à lâmina (LADs) à lâmina nuclear e através de regiões nucleolares associadas (NADs) e possivelmente através de outras estruturas nucleares, como corpos nucleares específicos.
O método do halo de DNA pode ser utilizado para mapeamento físico de DNA, genes e regiões cromossômicas, pois o DNA estendido e a cromatina proporcionam maior resolução, pois a cromatina é despida de histonas e o DNA é estirado 2,3,4,5,6. No entanto, existem algumas limitações ao usar halos de DNA para esta aplicação. Por exemplo, o DNA fortemente associado a núcleos residuais de halos de DNA pode ser inacessível às sondas, impedindo-o de análise e mapeamento físico6. Outras técnicas como a fibra-FISH 2,4,5,7 e o pente molecular 8 também possibilitam o mapeamento físico e têm a vantagem de serem relativamente rápidas e fáceis de serem realizadas. Ambos são preferencialmente usados para mapeamento de DNA de genes sobre halos de DNA. Esses métodos extraem fibras de cromatina através do uso de extrações com solvente ou sal do núcleo, entretanto, o penteamento molecular tende a ter melhor reprodutibilidade8,9.
Há evidências crescentes de que o nucleoesqueleto tem um papel no suporte de processos nucleares chave, tais como sítios de ligação para o DNA, remodelamento da cromatina, transcrição do DNA, reparo do DNA e replicação do DNA11,12. Como tal, a técnica do halo de DNA foi desenvolvida para investigar as interações entre o nucleoesqueleto e o genoma durante essas atividades celulares e tem sido rotineiramente usada e relatada em pesquisas. Essa técnica também tem sido utilizada para investigar interações entre o genoma e o nucleoesqueleto em relação à progressão da doença, sendo identificadas alterações na estrutura nuclear associadas àmalignidade11.
A técnica do halo de DNA também tem sido utilizada para investigar a relação entre o genoma e o nucleoesqueleto durante o desenvolvimento ediferenciação12. Vários estudos têm utilizado uma variação da técnica do halo de DNA conhecida como halosperma13 ou SpermHalo-FISH se acoplada à FISH14. A cromatina dos espermatozoides está firmemente ligada a proteínas conhecidas como protaminas e esta técnica foi desenvolvida para melhorar o acesso ao ADN dos espermatozoides. Halosperma tem sido usada para investigar a integridade do DNA dos espermatozoides e determinar se danos ao DNA estão presentes. Os espermatozoides com menos danos ao DNA correlacionam-se a um maior tamanho do halo de DNA, enquanto os espermatozoides com níveis aumentados de DNA fragmentado e danificado tinham halos pequenos ou nenhum. Assim, a halosperma pode ser utilizada como um potencial marcador prognóstico da qualidade embrionária e do sucesso da gestação com FIV13. Este exemplo enfatiza as potenciais aplicações clínicas dessa técnica. Em nosso trabalho utilizamos HALO-FISH para avaliar mudanças no comportamento do genoma e o efeito de tratamentos medicamentosos específicos na doença do envelhecimento precoce Síndrome de Hutchinson-Gilford Progeria (HGPS)15.
Juntos, esses e outros estudos destacam a amplitude de processos/aplicações que a técnica do halo de DNA pode ser utilizada para estudar e a utilidade da técnica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10388739</td>
			<td>Used to create DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-2&#8242;-deoxy-uridine&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5002-100MG</td>
			<td>Labelled nucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503-100MG</td>
			<td>Labelled nucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Technical</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15562141</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A939-50G</td>
			<td>Check product size of DOP-PCR and nick translation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atypical type 2 HGPS fibroblasts (AG08466)</td>
			<td>Coriell Institute</td>
			<td>AG08466</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16269751</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-16-dUTP</td>
			<td>Roche Diagnostics&#160;</td>
			<td>11093711103</td>
			<td>Labelled nucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378-25G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Classical Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) fibroblasts (AG06297)&#160;</td>
			<td>Coriell Institute</td>
			<td>AG0297</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12608596</td>
			<td>Holds 5 slides or 8 slides back to back</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cot-1 DNA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15279011</td>
			<td>Block nonspecific hybridization in HALO FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>693520-1L</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4030</td>
			<td>Hybridisation mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D141</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-dUTP&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11093088910</td>
			<td>Labelled nucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Cy3</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>443611</td>
			<td>Probe precipitation and HALO FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Cell culture serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10523525</td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18421</td>
			<td>Spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herring sperm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7290</td>
			<td>Probe precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HXP&#8482; Lamp (metal halide microscope lamp)</td>
			<td>OSRAM</td>
			<td>HXP-R120W45C VIS</td>
			<td>Image capture of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10313680</td>
			<td>Cleaning microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516-25ML</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi PCR Kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK2103</td>
			<td>PCR Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM4000 fluorescent microscope with DFC365 FX camera and LAS AF (Version: 4.5.0) image acquisition software.</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Image capture of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani agar&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13274843</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Component of CSK buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10284580</td>
			<td>Cleaning and sterilizing microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-BrdU antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>B2531-100UL</td>
			<td>BrdU visualisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn calf serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16010159</td>
			<td>Cell culture serum and blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nick translation kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR grade water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>693520-1L</td>
			<td>PCR and DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1851</td>
			<td>Component of CSK and extraction buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190-100G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadriPERM&#174; 4 X 12</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>94.6077.307</td>
			<td>Square cell culture dish, polysterene with four compartments.&#160; This has hydrophobic surface, is sterile, non-pyrogenic/endotoxin-fee and non-cytotoxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Ki67 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ZRB1007-25UL</td>
			<td>Proliferation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6513</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber cement</td>
			<td>Halford&#39;s</td>
			<td>101836</td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-50</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6022-25G</td>
			<td>Spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Probe precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>Component of CSK, extraction and SSC buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8532</td>
			<td>Component of SSC buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate&#160;</td>
			<td></td>
			<td>L3771-100G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4264</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Cy3&#160;</td>
			<td>Amersham Life Sciences Ltd, Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>pa43001</td>
			<td>Probe antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>Component of CSK buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>CSK buffer+A66:D68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost&#8482; microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12372098</td>
			<td>Microscope slides: 1 mm thickness, 76 mm length, 26 mm width. Uncoated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swine anti-rabbit TRITC&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TELO-PNA FISH KIT</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>K532511-8</td>
			<td>Delineation of telomeres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253-100G</td>
			<td>Column buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>Component of CSK buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10158962</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416- 100ML</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mountant containing DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole human chromosome probes</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td></td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10108202</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence in situ hybridization on dna halo preparations to reveal whole chromosomes, telomeres and gene loci

O genoma está associado a várias estruturas dentro dos núcleos celulares, a fim de regular sua atividade e ancorá-lo em locais específicos. Essas estruturas são coletivamente conhecidas como nucleoesqueleto e incluem a lâmina nuclear, os nucléolos e os corpos nucleares. Embora muitas variantes de hibridação in situ fluorescente (FISH) existam para estudar o genoma e sua organização, estas são frequentemente limitadas pela resolução e fornecem informações insuficientes sobre a associação do genoma com estruturas nucleares. O método do halo de DNA usa altas concentrações de sal e detergentes não iônicos para gerar alças de DNA que permanecem ancoradas a estruturas dentro dos núcleos através de regiões de ligação dentro do genoma. Aqui, proteínas nucleares solúveis, como histonas, lipídios e DNA não fortemente ligados à matriz nuclear, são extraídas. Isso leva à formação de um halo de DNA não anexado ao redor de um núcleo residual que contém DNA intimamente associado a estruturas nucleares internas e proteínas resistentes à extração. Essas cadeias de DNA estendidas permitem maior resolução e podem facilitar o mapeamento físico. Em combinação com FISH, este método tem a vantagem adicional de estudar interações genômicas com todas as estruturas pelas quais o genoma está ancorado. Esta técnica, denominada HALO-FISH, é altamente versátil, pela qual halos de DNA podem ser acoplados a sondas de ácido nucleico para revelar loci gênicos, cromossomos inteiros, satélite alfa, telômeros e até RNA. Esta técnica fornece uma visão sobre a organização nuclear e função em células normais e na progressão de doenças, como no câncer.

Esse método de preparação do halo de DNA tem nos ajudado em nossos esforços para determinar diferenças no comportamento do genoma dentro de células jovens e velhas, mas também em células derivadas de doenças do envelhecimento precoce com proteínas nucleosqueléticas aberrantes15. A Figura 1 mostra exemplos de halos de DNA onde é possível ver a borda de um núcleo residual, o DNA remanescente dentro do núcleo residual e o DNA não anexado que se deslocou para a área circundante criando um halo de DNA. Apresenta também a análise mostrando como o núcleo residual é obtido e as medidas de NE e CTE. É possível diferenciar células em proliferação e não proliferantes incorporando um nucleotídeo marcado, como BrdU, quando as células estão em fase S, ou empregando o marcador diagnóstico de proliferação anti-pKi67, que revela nucléolos, e regiões de heterocromatina nas célulasG117,18. Presume-se que as células primárias crescidas em soro alto sem atingir confluência, que são negativas para os marcadores de proliferação, sejam senescentes. Células primárias crescidas em soro baixo ou que se tornaram confluentes, ou seja, inibidas de contato negativas para os marcadores de proliferação, são consideradas quiescentes e seriam capazes de reentrar no ciclo celular proliferativo dados os nutrientes e a situação correta. A diferenciação entre células Ki67 positivas e negativas nos permitiu determinar diferenças entre fibroblastos dérmicos humanos em proliferação, quiescentes e senescentes. A Figura 2 mostra halos de DNA de fibroblastos dérmicos humanos em proliferação criados a partir de células onde BrdU foi incorporado a eles durante a replicação do DNA, um mecanismo que não ocorre em células não proliferantes, e posteriormente corados com anticorpo anti-BrdU. A coloração com o marcador proliferativo anticorpo anti-pKi67 também é visível na Figura 2. Este é um antígeno robusto e sobrevive ao protocolo de FISH e, portanto, pode ser corado para pós-FISH e pré-montagem. Assim, as células em proliferação são positivas (vermelho) para BrdU e anti-pKi67 (vermelho) na coluna da esquerda e as células não proliferantes, de fato, as células senescentes na Figura 2 são exibidas na coluna da direita. Os sinais verdes são telômeros individuais revelados com um kit telômero PNA FISH/FITC. A combinação de imunofluorescência com halos de DNA permite a análise durante diferentes estados celulares, como mostrado na Figura 2 ao investigar células em proliferação, quiescentes e senescentes. Dependendo do anticorpo escolhido, outras condições podem ser examinadas, como diferenciação, danos ao DNA via irradiação, etc.
Territórios cromossômicos também podem ser visualizados dentro de halos de DNA usando FISH. Devido à preparação que permite o spooling do DNA para fora dos núcleos, a forma do território cromossômico pode ser perturbada, com quantidades menores ou maiores do cromossomo encontradas no halo do DNA, dependendo da ancoragem do genoma dentro do núcleo residual e suas estruturas. A Figura 3 revela um painel de halos de DNA pelo qual cromossomos individuais foram revelados com sondas específicas de pintura cromossômica de braço inteiro (vermelho) para os cromossomos 1, 13, 17 e 18. O anti-pKi67 (verde) tem sido utilizado para marcar células em proliferação e sua ausência dentro de uma mesma cultura, sobre a mesma lâmina, denotando células senescentes. É muito óbvio, pelas imagens e pelos dados apresentados como CTE/NE, que o pequeno cromossomo 18 é um cromossomo que tem poucos anexos e carretéis mais para fora no halo de DNA longe dos núcleos residuais e está significativamente mais longe do centro dos núcleos residuais do que os outros cromossomos. No entanto, isso também é verdade para o cromossomo 1 também. Utilizando o marcador proliferativo anti-pKi67 também foi possível comparar células proliferantes com células senescentes, dentro de uma mesma cultura, e na mesma lâmina, e esta análise revelou que os cromossomos dentro desses dois status celulares muito diferentes não são significativamente diferentes um do outro, no que diz respeito à ligação com as estruturas nucleares residuais.
Curiosamente, os genes também estão mostrando diferenças estatisticamente significativas entre células em proliferação e senescentes com relação a permanecerem dentro de um núcleo residual ou estarem localizadas no DNA Halo. A Figura 4 demonstra isso com loci gênicos delineados por sondas BAC marcadas em vermelho e anti-Ki67 em verde. Não há diferenças significativas entre a localização dos genes nas células em proliferação versus as senescentes, após uma preparação de DNA Halo. No entanto, há significativamente mais loci CTNNA1 de catenina alfa 1 dentro do halo de DNA do que loci CNDD1 de ciclina D1, onde há muito poucos. A Figura 5 mostra as preparações de halo de DNA com telômeros em verde. O fundo é deixado deliberadamente alto para permitir que os sinais teloméricos sejam visualizados dentro do halo de DNA. Neste conjunto de dados, foram incluídas células quiescentes, ou seja, células que passaram fome de soro por 7 dias e, curiosamente, há significativamente mais telômeros desconectados e localizados dentro dos halos de DNA em células quiescentes do que para células em proliferação e senescentes. Na Figura 5a observa-se a proporção de telômeros no halo de DNA, principalmente para a imagem 'Experimento 2'. Isso corresponde à Figura 5b , onde a porcentagem média de telômeros no halo de DNA é de aproximadamente 17% nas células quiescentes. Há algumas evidências de que nem todos os telômeros em células senescentes podem ser vistos como alguns deles talvez muito curtos.
Este método de halo de DNA tem sido bem sucedido para investigarmos alterações na interação genômica dentro de núcleos em célulasdoentes15. A Figura 6 demonstra diferenças na ligação cromossômica em fibroblastos de controle primário e em células doentes com síndrome típica (mutação da lamina A) e síndrome de Hutchinson-Gilford Progeria atípica, expressando uma isoforma SUN1 diferente e nenhuma mutação na lamina A19. Os cromossomos 1 e 13 apresentam diferenças estatisticamente significativas em sua fixação dentro dos núcleos residuais quando comparados aos halos de DNA controle. A Figura 6b correlaciona a posição de todo o território cromossômico com o núcleo residual e o DNA Halo. Valores de 1 ou menos indicam que o cromossomo está localizado dentro do núcleo residual e valores acima de 1 demonstram cromossomos ou porções de cromossomos dentro do DNA Halo.
Em geral, isso destaca a utilidade do HALO-FISH na investigação de interações genômicas de cromossomos inteiros, genes específicos e telômeros sob uma variedade de condições que afetam o ciclo celular (proliferação, quiescência e senescência) ou dentro de células da doença, por exemplo, progéria e linhagens de células cancerosas. De fato, as diferenças nas interações entre esses estados implicam que o nucleoesqueleto tem um papel importante na regulação de processos-chave dentro do núcleo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig01.jpg"> Figura 1: Núcleo extraído do HDF exibindo o núcleo residual e o halo de DNA e visão geral do método de análise. a) Um núcleo HDF preparado através de ensaio de halo de ADN e contracorado com DAPI. O núcleo residual brilhantemente corado mostra DNA ancorado ao nucleoesqueleto e este é cercado pelo DNA não aderido que forma um halo de DNA. Ampliação = x 100; barra de escala 10 μm. (b) O canal azul captura o núcleo corado com DAPI e o DNA circundante. O núcleo residual é selecionado e removido usando ImageJ. A seta representa a distância do centro nuclear à borda nuclear residual (NE). (c) O canal vermelho mostra o sinal da sonda. (d) A imagem indicada 'Resultado' é o resultado da sobreposição do canal vermelho à imagem do canal azul; isso permite a distância do centro nuclear até a borda mais distante do território cromossômico (CTE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig02.jpg"> Figura 2: Preparação do halo de DNA com telômero PNA FISH em HDFs em proliferação e senescentes. Telômero PNA FISH em HDFs submetidos ao ensaio de DNA halo. Os sinais teloméricos são visualizados em verde (FITC), o DNA residual e halo foi contracorado usando DAPI (azul) e núcleos em proliferação foram detectados usando anticorpos anti-BrdU ou anti-pKi67 via imunofluorescência indireta em vermelho (TRITC). Ampliação = x 100; barra de escala 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig03.jpg"> Figura 3: Interações nucleoesqueleto-cromossomo e análise usando ensaio de halo de DNA. (a) FISH 2D com sondas específicas para os cromossomos 1, 13, 15, 17 e 18 foi realizada em HDFs submetidos à preparação de halo de DNA. Cromossomos inteiros foram pintados em vermelho (Cy3) e os núcleos foram sondados com pKi67 para determinar se estavam proliferando ou senescentes. As células em proliferação (pKi67+) foram delineadas em verde (FITC), enquanto as células senescentes permaneceram não coradas (pKi67-), ou seja, nenhum sinal verde foi detectado. Ampliação = x 100; barra de escala 10 μm. (b) Ancoragem cromossômica pelo nucleoesqueleto em HDFs em proliferação e senescentes que sofreram HALO-FISH. As medidas mostram a razão entre a borda do território cromossômico mais distante (CTE) e a respectiva borda nuclear (NE) para os cromossomos 1, 13, 15, 17 e 18 em células em proliferação (pKi67+) e senescentes (pKi67-). ±(c) Representação modificada do box plot da borda do território cromossômico (CTE) para a respectiva borda nuclear (NE) de cromossomos específicos nos núcleos pKi67+ e pKi67-. Q1 = quartil inferior; Min = menor valor registrado; Med = mediana; Max = valor máximo registrado; Q3 = quartil superior. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig04.jpg"> Figura 4: Interações gene-específicas em HDFs usando HALO-FISH. (a) Núcleos extraídos de halo de DNA foram sondados com sondas gênicas específicas (CCND1 e CTNNA1) para investigar sua ancoragem ao MN em células em proliferação e senescentes. Os sinais gênicos são mostrados em vermelho (Cy3) e o anti-pKi67 mostra células em proliferação e o sinal é visualizado em verde (FITC). Para a imagem CCND1 em proliferação, o núcleo residual é fechado dentro do círculo branco, e o espaço entre o círculo branco e verde representa o Halo de DNA. Ampliação = x 100; barra de escala 10 μm. (b) Sinais gene-específicos para CCND1 e CTNNA1 são comparados entre o núcleo residual e o halo de DNA, e também, entre células em proliferação e senescentes. As barras de erro representam ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig05.jpg"> Figura 5: Ensaio de halo de DNA em HDFs quiescentes sondados com telômero PNA-FISH. (a) A quiescência das ICDs foi induzida por cultura em meio de soro baixo por 7 dias. O ensaio do halo de DNA foi realizado, e o PNA-FISH permitiu a visualização dos telômeros pelo sinal FITC (verde) e o núcleo residual e o halo de DNA circundante foram contracorados com DAPI (azul). As células também foram coradas com o anticorpo anti-pKi67 para garantir que os núcleos não proliferassem. Isso se repetiu em duas ocasiões distintas. Ampliação = x 100; barra de escala 10 μm. (b) Comparação da porcentagem média de telômeros localizados dentro do halo de DNA em células HDF proliferantes, senescentes e quiescentes. As barras de erro representam ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig06.jpg"> Figura 6: Examinando a ancoragem cromossômica total ao nucleoesqueleto em células HGPS usando HALO-FISH26. (a) Os núcleos controle HDF (2DD), HGPS clássico (AG06297) e HGPS tipo 2 atípico (AG08466) foram submetidos à preparação do halo de DNA e, em seguida, ao 2D-FISH usando tintas cromossômicas inteiras para os cromossomos 1, 13, 15 e 17. Cromossomos inteiros são representados em verde (FITC) e o DNA foi contracorado com DAPI (azul). Ampliação = x 100; barra de escala 10 μm. (b) O posicionamento dos cromossomos dentro dos núcleos extraídos foi determinado medindo-se a razão entre a borda média do território cromossômico (CTE) e a borda nuclear (NE). Uma razão acima de 1 demonstra que a CTE mais distante está fora do NE correspondente dentro do halo de DNA, enquanto uma razão abaixo de 1 significa que a CTE mais distante está dentro do NE dentro do núcleo residual. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Constituintes</td>
			<td>Volume (μL)</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>5XDOP-PCRbuffer</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>dNTPmix (semdTTP)(2mM)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>dTTP (2mM)</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Biotina-16-dUTPorDigoxigenina-11-dUTP</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>DOPprimer (20μM)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>TaqDNAPolymerase (1U/μL)</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>PCRgradewater</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td>Modelo</td>
			<td>5</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Tabela mostrando os componentes e volumes do DOP-PCR para uma reação de 1x
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Passo</td>
			<td>Ciclos</td>
			<td>Temp (grau centígrado)</td>
			<td>Hora</td>
		</tr><tr><td>Desnaturação Inicial</td>
			<td>1</td>
			<td>95</td>
			<td>3 minutos</td>
		</tr><tr><td>Desnaturação</td>
			<td rowspan="3">34</td>
			<td>98</td>
			<td>Anos 20</td>
		</tr><tr><td>Recozimento de Primer</td>
			<td>62</td>
			<td>1 min</td>
		</tr><tr><td>Extensão</td>
			<td>72</td>
			<td>Anos 30</td>
		</tr><tr><td>Extensão Final</td>
			<td>1</td>
			<td>72</td>
			<td>5 minutos</td>
		</tr><tr><td>Arrefecimento</td>
			<td></td>
			<td>4</td>
			<td>Segurar</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Tabela mostrando o ciclo DOP-PCR, temperatura e perfil temporal.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Constituinte</td>
			<td>Volume (μL)</td>
		</tr><tr><td>Tampão 10x NT (0,5M Tris-HCl pH 8,50 mM MgCl2, 0,5 mg/ml BSA)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>0,1 M de beta-mercaptoetanol</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>10X estoque de nucleotídeos (0,5 mM dATP, 0,5 mM dCTP, 0,5 mM dGTP, 0,5 mM dTTP, 0,5 mg/ml biotina-16-dUTP)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Dnase I (1 ng/ml)</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>DNApolimerase I</td>
			<td>5U por μg de DNA</td>
		</tr><tr><td>DNAtemplate (1 μg)</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Água tratada com DEPC</td>
			<td>Até 50 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 3: Tabela mostrando os componentes e volumes de tradução de nick para uma sonda.

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Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

A combinação de preparações de halo de DNA com hibridização in situ fluorescente permite a análise de alta resolução das interações genômicas com o nucleoesqueleto. O genoma anexado leva a sinais fluorescentes hibridizados localizados dentro dos núcleos residuais extraídos, enquanto o genoma não ligado está no halo de DNA ao redor dos núcleos residuais.

Hibridização in situ fluorescente em preparações de halo de DNA para revelar cromossomos inteiros, telômeros e loci gênicos

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These ...

Este protocolo pode ser usado para avaliar ligações ao nucleoesqueleto em vez de usar o sequenciamento DamID, e é um ensaio de célula única. A principal vantagem de usar esse método é que ele é econômico e de fácil acesso. Isso pode destacar diferenças funcionais entre genes e cromossomos que normalmente não ocorrem com outras técnicas de visualização.Organizações espaciais e funcionais dentro do genoma em células de câncer e progéria tratadas e diferenças comportamentais genômicas em células senescentes podem ser avaliadas usando este protocolo. Este método pode ser aplicado a qualquer tipo de célula ou tecido ao longo da vida e de qualquer doença. Também pode ser usado em organismos modelo onde as sondas estão disponíveis.Para começar, prepare 500 mililitros de ácido clorídrico a 10% e despeje em um copo grande. Soltar lâminas do microscópio individualmente no ácido e incubá-las por uma hora à temperatura ambiente em um agitador ajustado para dois G.Decant o ácido do copo e lavar as lâminas 10 vezes em água da torneira. Em seguida, mais 10 vezes em água deionizada.Enxágue as lâminas em metanol duas vezes e mantenha-as em metanol até a esterilização. Incline as lâminas sobre um papel toalha para secar e envolva-as em papel alumínio para esterilização em autoclave ou forno quente. Cultivar células no meio apropriado com soro por pelo menos 48 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até atingir 60 a 70% de confluência.Colher cada tipo celular e contar as células usando um hemocitômetro. Semeando uma vez de 10 a cinco células em 10 mililitros de meio por lâmina. Remova a placa de cultura que contém as lâminas e as células anexadas da incubadora.Descarte o meio e rotule as lâminas usando um lápis. Em seguida, coloque-os em um frasco de coplin contendo 50 mililitros de tampão de citoesqueleto gelado. Incube o frasco por 15 minutos no gelo ou a quatro graus Celsius.Descarte o tampão do citoesqueleto e lave rapidamente as lâminas em 50 mililitros de tampão de halo de DNA único três vezes, mergulhando-as em um frasco de coplina com o tampão. Transfira as lâminas para um frasco de coplin contendo 50 mililitros de tampão de extração e incube por quatro minutos à temperatura ambiente. Em seguida, incube consecutivamente as lâminas em 50 mililitros de 10 vezes, cinco vezes, duas vezes e uma vez tampão halo de DNA por um minuto cada.Quando terminar, mergulhe as lâminas através de uma série sequencial de etanol de 10, 30, 70 e 95% de etanol. Leve as lâminas através de uma série sequencial de 50 mililitros de etanol de 70, 90 e 100% de etanol por cinco minutos cada. Seque-os ao ar em uma placa de aquecimento.Em seguida, leve ao forno a 70 graus Celsius por cinco minutos. Desnaturar as lâminas colocando-as em solução de 70% de formamida duas vezes SSC por dois minutos a 70 graus Celsius. Coloque as lâminas desnaturadas em 50 mililitros de etanol gelado a 70% por cinco minutos.Em seguida, mova-os através de uma série de etanol de 90, 95 e 100% à temperatura ambiente por cinco minutos cada. Quando terminar, seque ao ar as lâminas em uma placa de aquecimento. Desnature as sondas de DNA a 75 graus Celsius por 10 minutos em um bloco quente ou banho de água.Em seguida, incube-os a 37 graus Celsius por 30 minutos antes de pipetar 10 microlitros na lâmina apropriada. Sobreponha a sonda com uma lamínula de 21 por 21 milímetros e sela-a com cimento de borracha. Incubar as lâminas por um período mínimo de 18 horas a 37 graus Celsius em uma câmara de hibridização umedecida.Após a incubação, remova cuidadosamente o cimento de borracha com pinças. Em seguida, incubar as lâminas em 50 mililitros de formamida a 50% duas vezes solução de SSC em pH sete que foi pré-aquecida a 45 graus Celsius por três incubações de cinco minutos. Em seguida, coloque as lâminas em 50 mililitros de solução de SSC 0,1 vezes que foi pré-aquecida a 60 graus Celsius, mas colocada em banho-maria de 45 graus Celsius.Incubar por cinco minutos e substituir o tampão duas vezes por incubações de cinco minutos. Colocar as lâminas em um frasco de coplin contendo 50 mililitros de solução de SSC quatro vezes à temperatura ambiente e incubar por 15 minutos com três trocas de tampão. Para evitar a ligação de anticorpos inespecíficos, aplique 100 microlitros de solução de BSA 4% quatro vezes SSC em cada lâmina e sobreponha-a com um pedaço de filme de parafina.Incubar à temperatura ambiente durante 10 minutos. Em seguida, incubar as lâminas com 100 microlitros de estreptavidina, Cy3, diluídas uma em 200 por uma hora à temperatura ambiente para detectar a sonda marcada. Colocar as lâminas em um frasco de coplin contendo 50 mililitros de solução de SSC quatro vezes à temperatura ambiente e incubar por 15 minutos com três trocas de tampão.Monte as lâminas em 20 microlitros de uma solução de montagem contendo DAPI e sobreponha com uma lamínula de 22 por 50 milímetros. Visualize halos de DNA e territórios cromossômicos usando um microscópio de epifluorescência com uma objetiva de óleo de 100X. A preparação do halo de DNA torna possível ver a borda de um núcleo residual, o DNA remanescente dentro do núcleo residual e o DNA não anexado que se espalhou para a área circundante.Halos de DNA de fibroblastos dérmicos humanos em proliferação foram criados a partir de células com BRDU incorporado e posteriormente corados com anticorpo anti-BRDU. As células em proliferação foram positivas para BRDU e anti-pKi-67. Este protocolo foi usado para visualizar territórios cromossômicos dentro de halos de DNA.Cromossomos individuais foram marcados com sondas específicas de pintura cromossômica de braço inteiro para os cromossomos 1, 13, 17 e 18. Anti-pKi-67 foi usado para marcar células em proliferação e sua ausência dentro da mesma cultura. Preparações de halo de DNA com telômeros em verde são mostradas aqui.É possível observar a proporção de telômeros no halo de DNA, particularmente na imagem do experimento dois. A porcentagem média de telômeros foi de aproximadamente 17% nas células quiescentes. Diferenças na ligação cromossômica foram detectadas em fibroblastos de controle primário e em células doentes com síndrome de Hutchinson-Gilford progeria típica e atípica, expressando uma isoforma Sun1 diferente e nenhuma mutação Lamin A.Os cromossomos um e 13 apresentam diferenças estatisticamente significantes em sua fixação dentro dos núcleos residuais quando comparados aos halos controlados de DNA. A posição de todo o território cromossômico foi correlacionada com o núcleo residual e o halo de DNA. Ao tentar esse protocolo, certifique-se de que as células sejam semeadas na densidade correta e extraídas no momento certo.Após esse procedimento, pode-se realizar imunofluorescência indireta e RNA FISH.

Research

JoVE Journal

Biology

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The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biologia

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

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Zebrafish Whole Mount Alta Resolução Duplo Fluorescente In Situ Hibridização

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

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Fluorescência In situ Hybridization (FISH) Protocolo no esperma humano

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

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Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

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Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

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High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

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Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

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