Name: fluorescence in situ hybridization on dna halo preparations to reveal whole chromosomes, telomeres and gene loci
Uploaded: 2021-03-04T13:30:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить профессора Майкла Биттнера за любезный подарок в виде зондов для рисования хромосом. LG была поддержана финансируемым ЕС проектом EURO-Laminopathies и Исследовательским фондом Брунеля Прогерии.

<ol>
	<li>Berezney, R., Coffey, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+nuclear+protein+matrix.">Identification of a nuclear protein matrix.</a> Biochemical Biophysical Research Communications. 60 (4), 1410-1417 (1974).</li><li>Haaf, T., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+ordering+of+YAC+contigs+using+extended+chromatin+and+chromosomes.">High resolution ordering of YAC contigs using extended chromatin and chromosomes.</a> Human Molecular Genetics. 3 (4), 629-633 (1994).</li><li>Parra, I., Windle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+visual+mapping+of+stretched+DNA+by+fluorescent+hybridization.">High resolution visual mapping of stretched DNA by fluorescent hybridization.</a> Nature Genetics. 5 (1), 17-21 (1993).</li><li>Senger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Released+chromatin:+linearized+DNA+for+high+resolution+fluorescence+in+situ+hybridization.">Released chromatin: linearized DNA for high resolution fluorescence in situ hybridization.</a> Human Molecular Genetics. 3 (8), 1275-1280 (1994).</li><li>Florijn, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+DNA+Fiber-FISH+for+genomic+DNA+mapping+and+colour+bar-coding+of+large+genes.">High-resolution DNA Fiber-FISH for genomic DNA mapping and colour bar-coding of large genes.</a> Human Molecular Genetics. 4 (5), 831-836 (1995).</li><li>Elcock, L. S., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+on+DNA+halo+preparations+and+extended+chromatin+fibres.">Fluorescence in situ hybridization on DNA halo preparations and extended chromatin fibres.</a> Methods Molecular Biology. 659, 21-31 (2010).</li><li>Heiskanen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+mapping+by+fiber-FISH.">Visual mapping by fiber-FISH.</a> Genomics. 30 (1), 31-36 (1995).</li><li>Bensimon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+and+sensitive+detection+of+DNA+by+a+moving+interface.">Alignment and sensitive detection of DNA by a moving interface.</a> Science. 265 (5181), 2096-2098 (1994).</li><li>Michalet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+molecular+combing:+stretching+the+whole+human+genome+for+high-resolution+studies.">Dynamic molecular combing: stretching the whole human genome for high-resolution studies.</a> Science. 277 (5331), 1518-1523 (1997).</li><li>Wilson, R. H., Coverley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+DNA+replication+and+the+nuclear+matrix.">Relationship between DNA replication and the nuclear matrix.</a> Genes Cells. 18 (1), 17-31 (2013).</li><li>Wilson, R. H. C., Coverley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation-induced+changes+in+the+DNA-nuclear+matrix+interface,+revealed+by+high-throughput+analysis+of+DNA+halos.">Transformation-induced changes in the DNA-nuclear matrix interface, revealed by high-throughput analysis of DNA halos.</a> Science Reports. 7 (1), 6475 (2017).</li><li>Iarovaia, O. V., Akopov, S. B., Nikolaev, L. G., Sverdlov, E. D., Razin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+transcription+within+chromosomal+DNA+loops+flanked+by+MAR+elements+causes+an+association+of+loop+DNA+with+the+nuclear+matrix.">Induction of transcription within chromosomal DNA loops flanked by MAR elements causes an association of loop DNA with the nuclear matrix.</a> Nucleic Acids Research. 33 (13), 4157-4163 (2005).</li><li>Tandara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+DNA+integrity+testing:+big+halo+is+a+good+predictor+of+embryo+quality+and+pregnancy+after+conventional+IVF.">Sperm DNA integrity testing: big halo is a good predictor of embryo quality and pregnancy after conventional IVF.</a> Andrology. 2 (5), 678-686 (2014).</li><li>Repping, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+spermHALO-FISH+to+determine+DAZ+gene+copy+number.">The use of spermHALO-FISH to determine DAZ gene copy number.</a> Mol Human Reproduction. 9 (4), 183-188 (2003).</li><li>Bikkul, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farnesyltransferase+inhibitor+and+rapamycin+correct+aberrant+genome+organisation+and+decrease+DNA+damage+respectively,+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+fibroblasts.">Farnesyltransferase inhibitor and rapamycin correct aberrant genome organisation and decrease DNA damage respectively, in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts.</a> Biogerontology. 19 (6), 579-602 (2018).</li><li>Telenius, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degenerate+oligonucleotide-primed+PCR:+general+amplification+of+target+DNA+by+a+single+degenerate+primer.">Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer.</a> Genomics. 13 (3), 718-725 (1992).</li><li>Bridger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+pKi-67+with+satellite+DNA+of+the+human+genome+in+early+G1+cells.">Association of pKi-67 with satellite DNA of the human genome in early G1 cells.</a> Chromosome Research. 6, 13-24 (1998).</li><li>Sales Gil, R., Vagnarelli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67:+More+Hidden+behind+a+'Classic+Proliferation+Marker'.">Ki-67: More Hidden behind a 'Classic Proliferation Marker'.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 747-748 (2018).</li><li>Bikkul, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+elongation+through+hTERT+immortalization+leads+to+chromosome+repositioning+in+control+cells+and+genomic+instability+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+fibroblasts,+expressing+a+novel+SUN1+isoform.">Telomere elongation through hTERT immortalization leads to chromosome repositioning in control cells and genomic instability in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts, expressing a novel SUN1 isoform.</a> Genes Chromosomes Cancer. 58 (6), 341-356 (2019).</li><li>Jackson, D. A., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+a+filamentous+nucleoskeleton+with+a+23+nm+axial+repeat.">Visualization of a filamentous nucleoskeleton with a 23 nm axial repeat.</a> EMBO Journal. 7, 3667-3677 (1988).</li><li>Albrethsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+the+nuclear+matrix+proteome.">Unravelling the nuclear matrix proteome.</a> Journal of Proteomics. 72, 71-81 (2009).</li><li>Mika, S., Rost, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMPdb:+Database+of+nuclear+matrix+proteins.">NMPdb: Database of nuclear matrix proteins.</a> Nucleic Acids Research. 33, 160-163 (2005).</li><li>Gavrilov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=of+the+nuclear+matrix-bound+chromatin+hubs+by+a+new+M3C+experimental+procedure.">of the nuclear matrix-bound chromatin hubs by a new M3C experimental procedure.</a> Nucleic Acids Research. 38, 8051-8060 (2010).</li><li>Sjakste, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+nuclear+matrix+proteins+in+malignant+transformation+and+cancer+diagnosis.">Role of the nuclear matrix proteins in malignant transformation and cancer diagnosis.</a> Experimental Oncology. 26 (3), 170-178 (2004).</li><li>Leman, E. S., Getzenberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+structure+as+a+source+of+cancer+specific+biomarkers.">Nuclear structure as a source of cancer specific biomarkers.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 104 (6), 1988-1993 (2008).</li><li>Volpi, E. V., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH+glossary:+an+overview+of+the+fluorescence+in+situ+hybridization+technique.">FISH glossary: an overview of the fluorescence in situ hybridization technique.</a> Biotechniques. 45 (4), 385-386 (2008).</li><li>Bridger, J. M., Foster, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+and+the+Genome.">Senescence and the Genome.</a> Human Interphase Chromosomes. , (2021).</li><li>Foster, H. A., Griffin, D. K., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interphase+chromosome+positioning+in+in+vitro+porcine+cells+and+ex+vivo+porcine+tissues.">Interphase chromosome positioning in in vitro porcine cells and ex vivo porcine tissues.</a> BMC Cell Biology. 13 (1), 30 (2012).</li></ol>

Авторам раскрывать нечего.

Метод ореола ДНК является отличным методом выбора при анализе взаимодействия между нуклеоскелетом и геномом, однако есть некоторые важные шаги, которые также необходимо соблюдать. Одним из важнейших параметров является оптимизация плотности засева клеток. Если клетки станут более сливающимися, то ореолы ДНК будут перекрываться с соседними клетками, что сделает невозможным выполнение анализа. ЦСК и экстракционные буферы всегда должны быть свежими в день использования, при этом спермин, спермидин и дигитонин добавляются в экстракционный буфер в конце процесса приготовления для поддержания их биологической активности. При выполнении Halo-FISH чрезвычайно важно использовать правильную температуру денатурации ореолов ДНК, чтобы зонд или краска впоследствии гибридизировались.
Электронная микроскопия была использована для визуализации ядерной матрицы, при этом нитевидные структуры были идентифицированы20. Однако электронная микроскопия ограничена, так как матричные ассоциации с хроматином не могут быть легко выведены. Действительно, метод DNA Halo более универсален по сравнению с электронной микроскопией, поскольку можно исследовать определенные гены, хромосомы и состояния клеток. Кроме того, изучается протеомный анализ белков ядерного матрикса21,22. Этот метод хорош для сравнения компонентов ядерного матрикса, особенно при сравнении больных клеток, однако он не обеспечивает пространственного распределения и прикреплений, выделенных стандартным методом ДНК Halo.
Анализы ДНК Halo имеют ограничения. Во-первых, поскольку матрица извлекается, это может быть выполнено только на фиксированных клетках, поэтому визуализация в реальном времени невозможна. Несмотря на то, что метод DNA Halo относительно быстр и прост в исполнении, общий процесс может занять много времени, если принять во внимание культуру клеток, генерацию зондов, Halo-FISH и анализ.
Захват изображений ДНК Halos и HALO-FISH с использованием микроскопии сверхвысокого разрешения значительно улучшит разрешение ДНК-специфических зондов и антител. Кроме того, поскольку флуорохромы могут быть более легко спектрально разрешены, можно использовать несколько зондов ДНК в одном эксперименте, предоставляя еще больше информации. Усовершенствования в методах молекулярной биологии, такие как захват конформации хромосом (3C), были использованы для определения взаимодействий локусов генов и анализа пространственной организации хроматина в клетке. Анализы ДНК Halo и 3C могут быть объединены, термин, известный как M3C23, что еще раз демонстрирует адаптивность метода DNA Halo.
Исходные данные, представленные здесь, предназначены для демонстрации возможностей опроса поведения генома и того, как представить эти данные. С помощью этих данных мы продемонстрировали, что можно определить значительные различия в прикреплении генома с помощью (1) зондов для рисования хромосом, в этом исследовании выяснилось, что хромосома 18 является наименее прикрепленной хромосомой из проанализированных (рис. 3); (2) Генные локусы со значительными различиями между двумя генными локусами и (рис. 4) (3) теломеры, которые менее сильно прикреплены к покоящимся клеткам по сравнению с пролиферирующими и стареющими клетками (рис. 5). Мы можем различать пролиферирующие и непролиферирующие клетки по присутствию маркера пролиферации антигена Ki67, который является нерастворимым белком, поэтому остается с остаточными ядрами, или используя включение нуклеотидов для выделения клеток, которые прошли через S-фазу в течение определенного периода времени (рис. 2). Этот метод также позволил нам проанализировать поведение генома в клетках, которые скомпрометированы в своих нуклеоскелетах, то есть клетках ламинопатии, и здесь и в Bikkul et al., 2018 мы показываем, что геном может быть менее плотно прикреплен по сравнению с контрольными клетками и может быть восстановлен при лечении конкретными препаратами, которые улучшают эффект мутации ламина А в классических клетках HGPS15. Тем не менее, мы показываем здесь новые данные для атипичных клеток HGPS AGO8466, лишенных мутации ламина А, но содержащих необычную форму белка комплекса LINC SUN1 19, в котором хромосома13 менее плотно прикреплена (рис. 6).
HALO-FISH является уникальным методом, позволяющим изучать геномные взаимодействия с нуклеоскелетом в сочетании с непрямой иммунофлюоресценцией для разрешения белков, не удаленных из процедуры экстракции. Было продемонстрировано, что нуклеоскелет модифицируется при различных заболеваниях, таких как некоторые типы рака19, и важность некоторых белков, связанных с нуклеоскелетом, в качестве диагностических биомаркеров24,25. Таким образом, этот метод играет важную роль в изучении влияния нуклеоскелета на организацию/дезорганизацию хроматина при заболевании 15,24,25,27 и не ограничивается клетками человека, с зондами хромосомного рисования от других животных может быть использован тот же протокол ДНК-гало 28.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated from:
Lauren S. Godwin1 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire
to:
Lauren S. Godwin1 
Emily Roberts2 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

«Ядерная матрица» была впервые описана Березни и Коффи в 1974 году1. После выполнения экстракции с высоким содержанием соли и обработки нуклеазами ядер печени крыс они идентифицировали белковый структурный каркас. Процедура гало ДНК была впоследствии адаптирована из этого метода и включает удаление растворимых белков таким образом, чтобы сохранялись только ядерный матрикс (NM) и NM-ассоциированные белки и хромосомы. Области прикрепления ДНК расположены у основания петель ДНК и называются областями, присоединенными к матрице (MAR) или областями прикрепления каркаса (SAR), которые устойчивы к экстракции с высокими концентрациями соли и ионным детергентом литий-3,5-дийодосалицилатом (LIS) соответственно. В ореолах ДНК ДНК, связанная с MAR / SAR, связана в остаточном ядре, тогда как петли ДНК простираются от этих участков и образуют ореол ДНК. Теперь мы знаем, что геном привязан через пластинчатые ассоциированные домены (LAD) к ядерной пластинке и через ядрышкоассоциированные области (NAD) и, возможно, через другие ядерные структуры, такие как специфические ядерные тела.
Метод гало ДНК можно использовать для физического картирования ДНК, генов и хромосомных областей, поскольку расширенная ДНК и хроматин обеспечивают большее разрешение, поскольку хроматин лишен гистонов, а ДНК растягивается 2,3,4,5,6. Однако существуют некоторые ограничения при использовании ореолов ДНК для этого приложения. Например, ДНК, тесно связанная с остаточными ядрами ореолов ДНК, может быть недоступна для зондов, что исключает ее из анализа и физического картирования6. Другие методы, такие как fiber-FISH 2,4,5,7 и молекулярное расчесывание 8, также позволяют проводить физическое картирование и имеют то преимущество, что они относительно быстры и просты в выполнении. Оба предпочтительно используются для картирования ДНК генов, а не ореолов ДНК. Эти методы извлекают волокна хроматина с помощью растворителя или солевой экстракции из ядра, однако молекулярное расчесывание, как правило, имеет лучшую воспроизводимость 8,9.
Появляется все больше доказательств того, что нуклеоскелет играет роль в поддержке ключевых ядерных процессов, таких как сайты прикрепления ДНК, ремоделирование хроматина, транскрипция ДНК, репарация ДНК и репликация ДНК11,12. Таким образом, метод гало ДНК был разработан для исследования взаимодействия между нуклеоскелетом и геномом во время этих клеточных активностей и регулярно использовался и освещался в исследованиях. Этот метод также использовался для исследования взаимодействия между геномом и нуклеоскелетом в связи с прогрессированием заболевания с идентификацией связанных со злокачественными новообразованиями изменений в структуре ядра11.
Метод гало ДНК также использовался для исследования взаимосвязи между геномом и нуклеоскелетом во время развития и дифференцировки12. В ряде исследований использовался вариант метода ореола ДНК, известный как галосперм13 или SpermHalo-FISH, в сочетании с FISH14. Хроматин сперматозоидов тесно связан с белками, известными как протамины, и этот метод был разработан для улучшения доступа к ДНК сперматозоидов. Галосперм использовался для исследования целостности ДНК сперматозоидов и определения наличия повреждений ДНК. Сперматозоиды с меньшим повреждением ДНК коррелируют с большим размером ореола ДНК, тогда как сперматозоиды с повышенным уровнем фрагментированной и поврежденной ДНК имели либо небольшие ореолы, либо вообще не имели их. Таким образом, галосперм может быть использован в качестве потенциального прогностического маркера качества эмбриона и успешной беременности при ЭКО13. Этот пример подчеркивает потенциальное клиническое применение этого метода. В нашей работе мы использовали HALO-FISH для оценки изменений в поведении генома и влияния специфических лекарственных препаратов на болезнь преждевременного старения Синдром прогерии Хатчинсона-Гилфорда (HGPS)15.
Вместе эти и другие исследования подчеркивают широту процессов / приложений, для изучения которых может быть использован метод гало ДНК, и полезность этого метода.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10388739</td>
			<td>Used to create DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-2&#8242;-deoxy-uridine&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5002-100MG</td>
			<td>Labelled nucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503-100MG</td>
			<td>Labelled nucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Technical</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15562141</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A939-50G</td>
			<td>Check product size of DOP-PCR and nick translation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atypical type 2 HGPS fibroblasts (AG08466)</td>
			<td>Coriell Institute</td>
			<td>AG08466</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16269751</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-16-dUTP</td>
			<td>Roche Diagnostics&#160;</td>
			<td>11093711103</td>
			<td>Labelled nucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378-25G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Classical Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) fibroblasts (AG06297)&#160;</td>
			<td>Coriell Institute</td>
			<td>AG0297</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12608596</td>
			<td>Holds 5 slides or 8 slides back to back</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cot-1 DNA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15279011</td>
			<td>Block nonspecific hybridization in HALO FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>693520-1L</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4030</td>
			<td>Hybridisation mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D141</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-dUTP&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11093088910</td>
			<td>Labelled nucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Cy3</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>443611</td>
			<td>Probe precipitation and HALO FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Cell culture serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10523525</td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18421</td>
			<td>Spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herring sperm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7290</td>
			<td>Probe precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HXP&#8482; Lamp (metal halide microscope lamp)</td>
			<td>OSRAM</td>
			<td>HXP-R120W45C VIS</td>
			<td>Image capture of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10313680</td>
			<td>Cleaning microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516-25ML</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi PCR Kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK2103</td>
			<td>PCR Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM4000 fluorescent microscope with DFC365 FX camera and LAS AF (Version: 4.5.0) image acquisition software.</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Image capture of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani agar&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13274843</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Component of CSK buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10284580</td>
			<td>Cleaning and sterilizing microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-BrdU antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>B2531-100UL</td>
			<td>BrdU visualisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn calf serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16010159</td>
			<td>Cell culture serum and blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nick translation kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR grade water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>693520-1L</td>
			<td>PCR and DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1851</td>
			<td>Component of CSK and extraction buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190-100G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadriPERM&#174; 4 X 12</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>94.6077.307</td>
			<td>Square cell culture dish, polysterene with four compartments.&#160; This has hydrophobic surface, is sterile, non-pyrogenic/endotoxin-fee and non-cytotoxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Ki67 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ZRB1007-25UL</td>
			<td>Proliferation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6513</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber cement</td>
			<td>Halford&#39;s</td>
			<td>101836</td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-50</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6022-25G</td>
			<td>Spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Probe precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>Component of CSK, extraction and SSC buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8532</td>
			<td>Component of SSC buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate&#160;</td>
			<td></td>
			<td>L3771-100G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4264</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Cy3&#160;</td>
			<td>Amersham Life Sciences Ltd, Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>pa43001</td>
			<td>Probe antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>Component of CSK buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>CSK buffer+A66:D68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost&#8482; microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12372098</td>
			<td>Microscope slides: 1 mm thickness, 76 mm length, 26 mm width. Uncoated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swine anti-rabbit TRITC&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TELO-PNA FISH KIT</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>K532511-8</td>
			<td>Delineation of telomeres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253-100G</td>
			<td>Column buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>Component of CSK buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10158962</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416- 100ML</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mountant containing DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole human chromosome probes</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td></td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10108202</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence in situ hybridization on dna halo preparations to reveal whole chromosomes, telomeres and gene loci

Геном связан с несколькими структурами внутри клеточных ядер, чтобы регулировать его активность и закреплять его в определенных местах. Эти структуры в совокупности известны как нуклеоскелет и включают ядерную пластинку, ядрышки и ядерные тела. Хотя существует множество вариантов флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) для изучения генома и его организации, они часто ограничены разрешением и предоставляют недостаточную информацию о связи генома с ядерными структурами. Метод гало ДНК использует высокие концентрации соли и неионогенные детергенты для создания петель ДНК, которые остаются привязанными к структурам внутри ядер через области прикрепления в геноме. Здесь извлекаются растворимые ядерные белки, такие как гистоны, липиды и ДНК, не тесно связанные с ядерным матриксом. Это приводит к образованию ореола неприсоединенной ДНК, окружающей остаточное ядро, которое само содержит ДНК, тесно связанную с внутренними ядерными структурами и устойчивыми к экстракции белками. Эти расширенные нити ДНК обеспечивают повышенное разрешение и могут облегчить физическое картирование. В сочетании с FISH этот метод имеет дополнительное преимущество, заключающееся в изучении геномных взаимодействий со всеми структурами, которыми привязан геном. Этот метод, называемый HALO-FISH, очень универсален, благодаря чему ореолы ДНК могут быть объединены с зондами нуклеиновых кислот для выявления локусов генов, целых хромосом, альфа-сателлитов, теломер и даже РНК. Этот метод дает представление о ядерной организации и функционировании в нормальных клетках и при прогрессировании заболевания, например, при раке.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci at JoVE.com

Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

Сочетание препаратов ДНК-гало с флуоресцентной гибридизацией in situ позволяет проводить анализ геномных взаимодействий с нуклеоскелетом с высоким разрешением. Присоединенный геном приводит к гибридизованным флуоресцентным сигналам, расположенным внутри остаточных экстрагированных ядер, тогда как неприсоединенный геном находится в ореоле ДНК, окружающем остаточные ядра.

Флуоресцентная гибридизация in situ на препаратах гало ДНК для выявления целых хромосом, теломер и локусов генов

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These ...

Этот протокол можно использовать для оценки прикрепления к нуклеоскелету, а не с помощью секвенирования DamID, и это анализ одной клетки. Основное преимущество использования этого метода заключается в том, что он экономичен и легко доступен. Это может выявить функциональные различия между генами и хромосомами, которые обычно не встречаются при других методах визуализации.С помощью этого протокола можно оценить пространственные и функциональные организации в геноме обработанных раковых клеток и клеток прогерии, а также геномные поведенческие различия в стареющих клетках. Этот метод может быть применен к любому типу клеток или тканей на протяжении всей жизни и при любом заболевании. Он также может быть использован в модельных организмах, где доступны зонды.Для начала подготовьте 500 миллилитров 10%-ной соляной кислоты и вылейте ее в большой стакан. Капните микроскоп по отдельности в кислоту и инкубируйте их в течение одного часа при комнатной температуре на шейкере, установленном на два г. Сцедите кислоту из стакана и промойте предметные стекла 10 раз в водопроводной воде. Затем еще 10 раз в деионизированной воде.Промойте предметные стекла в метаноле дважды и держите их в метаноле до стерилизации. Положите слайды на бумажное полотенце, чтобы они высохли, и заверните их в фольгу для стерилизации в автоклаве или горячей духовке. Выращивайте клетки в соответствующей среде с сывороткой в течение не менее 48 часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа до тех пор, пока не будет достигнуто слияние от 60 до 70%.Соберите каждый тип клеток и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Высевают один раз по 10 до пяти ячеек по 10 миллилитров среды на одно горное стекло. Извлеките из инкубатора культуральную чашку, содержащую предметные стекла и прикрепленные клетки.Откажитесь от носителя и пометьте слайды карандашом. Затем поместите их в банку из-под коплина, содержащую 50 миллилитров ледяного буфера цитоскелета. Выдерживайте банку 15 минут на льду или при четырех градусах Цельсия.Откажитесь от буфера цитоскелета и быстро промойте предметные стекла в 50 миллилитрах одноразового гало-буфера ДНК три раза, окунув их в банку Коплина с буфером. Переложите предметные стекла в банку Коплина, содержащую 50 миллилитров экстракционного буфера, и инкубируйте в течение четырех минут при комнатной температуре. Затем последовательно инкубируют предметные стекла в 50 миллилитрах 10 раз, пять раз, два раза и один раз ДНК гало буфера в течение одной минуты каждый.Когда закончите, окуните слайды в последовательную серию этанола из 10, 30, 70 и 95% этанола. Проведите слайды через последовательную серию этанола объемом 50 миллилитров из 70, 90 и 100% этанола в течение пяти минут каждый. Сушите их на воздухе на согревающей тарелке.Затем выпекайте в духовке при температуре 70 градусов Цельсия в течение пяти минут. Денатурируйте предметные стекла, поместив их в 70% формамид два раза в раствор SSC на две минуты при 70 градусах Цельсия. Поместите денатурированные предметные стекла в 50 миллилитров ледяного 70% этанола на пять минут.Затем переместите их через серию этанола 90, 95 и 100% при комнатной температуре в течение пяти минут каждый. Когда закончите, высушите слайды на воздухе на согревающей плите. Денатурируйте ДНК-зонды при 75 градусах Цельсия в течение 10 минут в горячем блоке или на водяной бане.Затем инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут, прежде чем пипетировать 10 микролитров на соответствующее предметное стекло. Накройте зонд покровным стеклом размером 21 на 21 миллиметр и запечатайте его резиновым цементом. Инкубируйте предметные стекла не менее 18 часов при температуре 37 градусов Цельсия в увлажненной гибридизационной камере.После инкубации аккуратно удалите резиновый цемент щипцами. Затем инкубируют предметные стекла в 50 миллилитрах 50%-ного раствора формамида два раза SSC при рН семь, предварительно нагретом до 45 градусов Цельсия в течение трех пятиминутных инкубаций. Затем поместите предметные стекла в 50 миллилитров 0,1-кратного раствора SSC, предварительно нагретого до 60 градусов Цельсия, но помещенного на водяную баню с температурой 45 градусов Цельсия.Инкубируйте в течение пяти минут и дважды замените буфер для пятиминутной инкубации. Поместите предметные стекла в банку для коплина, содержащую 50 миллилитров четырехкратного раствора SSC при комнатной температуре, и инкубируйте в течение 15 минут с тремя сменами буфера. Чтобы предотвратить неспецифическое связывание антител, нанесите 100 микролитров 4%-ного раствора BSA четыре раза SSC на каждое предметное стекло и наложите на него кусок парафиновой пленки.Инкубировать при комнатной температуре 10 минут. Затем инкубируют предметные стекла со 100 микролитрами стрептавидина Cy3, разбавленного один на 200, в течение одного часа при комнатной температуре, чтобы обнаружить меченый зонд. Поместите предметные стекла в банку для коплина, содержащую 50 миллилитров четырехкратного раствора SSC при комнатной температуре, и инкубируйте в течение 15 минут с тремя сменами буфера.Установите слайды в 20 микролитров монтажного раствора, содержащего DAPI, и наложите покровное стекло размером 22 на 50 миллиметров. Визуализируйте ореолы ДНК и хромосомные территории с помощью эпифлуоресцентного микроскопа со 100-кратным масляным объективом. Подготовка ореола ДНК позволяет увидеть край остаточного ядра, ДНК, оставшуюся внутри остаточного ядра, и неприкрепленную ДНК, которая наматывалась в окружающую область.Ореолы ДНК пролиферирующих дермальных фибробластов человека были созданы из клеток с инкорпорированным BRDU и впоследствии окрашены антителами против BRDU. Пролиферирующие клетки были положительными на BRDU и анти-pKi-67. Этот протокол использовался для визуализации хромосомных территорий в ореолах ДНК.Отдельные хромосомы были помечены специфическими зондами для окрашивания хромосом всего плеча для хромосом 1, 13, 17 и 18. Anti-pKi-67 был использован для маркировки пролиферирующих клеток и его отсутствия в одной культуре. Здесь показаны препараты ДНК-ореола с теломерами зеленого цвета.Можно наблюдать пропорцию теломер в ореоле ДНК, особенно на втором изображении эксперимента. Средний процент теломер составлял примерно 17% в покоящихся клетках. Различия в прикреплении хромосом были обнаружены в фибробластах первичного контроля и в больных клетках с типичным и атипичным синдромом прогерии Хатчинсона-Гилфорда, экспрессирующими различную изоформу Sun1 и не имеющими мутации ламина А.Хромосомы номер один и 13 демонстрируют статистически значимые различия в их прикреплении в остаточных ядрах по сравнению с контролируемыми ореолами ДНК. Положение всей территории хромосомы коррелировало с остаточным ядром и ореолом ДНК. При использовании этого протокола убедитесь, что клетки засеяны с правильной плотностью и извлечены в нужное время.После этой процедуры может быть выполнена непрямая иммунофлюоресценция и РНК-FISH.

Research

JoVE Journal

Biology

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Дважды Всего горе на месте гибридизация раннего куриных эмбрионов

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Данио рерио Всего горе высокого разрешения двумя люминесцентными В Ситу Гибридизация

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

Флуоресценция На месте Гибридизации (FISH) протокола в человеческой сперме

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Использование Всего горе На месте Гибридизация в ссылку молекулярной биологии и организменном

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Всего горы<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация E8.5 в E11.5 эмбрионов мыши

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Радиоактивный На месте Гибридизации для обнаружения разнообразных шаблонов экспрессии генов в ткани

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Обнаружение вирусной РНК с помощью флуоресцентного<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Высокая пропускная способность физического картирования хромосом использованием автоматизированных<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Анализ одноклеточных транскрипции гена РНК-флуоресцентный<em&gt; В Situ</em&gt; Гибридизация (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...