Name: fluorescence in situ hybridization on dna halo preparations to reveal whole chromosomes, telomeres and gene loci
Uploaded: 2021-03-04T13:30:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci at JoVE.com

Vi vill tacka professor Michael Bittner för den vänliga gåvan av kromosomarmmålningssonder. LG stöddes av det EU-finansierade projektet EURO-Laminopathies och Brunel Progeria Research Fund.

<ol>
	<li>Berezney, R., Coffey, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+nuclear+protein+matrix.">Identification of a nuclear protein matrix.</a> Biochemical Biophysical Research Communications. 60 (4), 1410-1417 (1974).</li><li>Haaf, T., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+ordering+of+YAC+contigs+using+extended+chromatin+and+chromosomes.">High resolution ordering of YAC contigs using extended chromatin and chromosomes.</a> Human Molecular Genetics. 3 (4), 629-633 (1994).</li><li>Parra, I., Windle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+visual+mapping+of+stretched+DNA+by+fluorescent+hybridization.">High resolution visual mapping of stretched DNA by fluorescent hybridization.</a> Nature Genetics. 5 (1), 17-21 (1993).</li><li>Senger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Released+chromatin:+linearized+DNA+for+high+resolution+fluorescence+in+situ+hybridization.">Released chromatin: linearized DNA for high resolution fluorescence in situ hybridization.</a> Human Molecular Genetics. 3 (8), 1275-1280 (1994).</li><li>Florijn, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+DNA+Fiber-FISH+for+genomic+DNA+mapping+and+colour+bar-coding+of+large+genes.">High-resolution DNA Fiber-FISH for genomic DNA mapping and colour bar-coding of large genes.</a> Human Molecular Genetics. 4 (5), 831-836 (1995).</li><li>Elcock, L. S., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+on+DNA+halo+preparations+and+extended+chromatin+fibres.">Fluorescence in situ hybridization on DNA halo preparations and extended chromatin fibres.</a> Methods Molecular Biology. 659, 21-31 (2010).</li><li>Heiskanen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+mapping+by+fiber-FISH.">Visual mapping by fiber-FISH.</a> Genomics. 30 (1), 31-36 (1995).</li><li>Bensimon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+and+sensitive+detection+of+DNA+by+a+moving+interface.">Alignment and sensitive detection of DNA by a moving interface.</a> Science. 265 (5181), 2096-2098 (1994).</li><li>Michalet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+molecular+combing:+stretching+the+whole+human+genome+for+high-resolution+studies.">Dynamic molecular combing: stretching the whole human genome for high-resolution studies.</a> Science. 277 (5331), 1518-1523 (1997).</li><li>Wilson, R. H., Coverley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+DNA+replication+and+the+nuclear+matrix.">Relationship between DNA replication and the nuclear matrix.</a> Genes Cells. 18 (1), 17-31 (2013).</li><li>Wilson, R. H. C., Coverley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation-induced+changes+in+the+DNA-nuclear+matrix+interface,+revealed+by+high-throughput+analysis+of+DNA+halos.">Transformation-induced changes in the DNA-nuclear matrix interface, revealed by high-throughput analysis of DNA halos.</a> Science Reports. 7 (1), 6475 (2017).</li><li>Iarovaia, O. V., Akopov, S. B., Nikolaev, L. G., Sverdlov, E. D., Razin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+transcription+within+chromosomal+DNA+loops+flanked+by+MAR+elements+causes+an+association+of+loop+DNA+with+the+nuclear+matrix.">Induction of transcription within chromosomal DNA loops flanked by MAR elements causes an association of loop DNA with the nuclear matrix.</a> Nucleic Acids Research. 33 (13), 4157-4163 (2005).</li><li>Tandara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+DNA+integrity+testing:+big+halo+is+a+good+predictor+of+embryo+quality+and+pregnancy+after+conventional+IVF.">Sperm DNA integrity testing: big halo is a good predictor of embryo quality and pregnancy after conventional IVF.</a> Andrology. 2 (5), 678-686 (2014).</li><li>Repping, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+spermHALO-FISH+to+determine+DAZ+gene+copy+number.">The use of spermHALO-FISH to determine DAZ gene copy number.</a> Mol Human Reproduction. 9 (4), 183-188 (2003).</li><li>Bikkul, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farnesyltransferase+inhibitor+and+rapamycin+correct+aberrant+genome+organisation+and+decrease+DNA+damage+respectively,+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+fibroblasts.">Farnesyltransferase inhibitor and rapamycin correct aberrant genome organisation and decrease DNA damage respectively, in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts.</a> Biogerontology. 19 (6), 579-602 (2018).</li><li>Telenius, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degenerate+oligonucleotide-primed+PCR:+general+amplification+of+target+DNA+by+a+single+degenerate+primer.">Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer.</a> Genomics. 13 (3), 718-725 (1992).</li><li>Bridger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+pKi-67+with+satellite+DNA+of+the+human+genome+in+early+G1+cells.">Association of pKi-67 with satellite DNA of the human genome in early G1 cells.</a> Chromosome Research. 6, 13-24 (1998).</li><li>Sales Gil, R., Vagnarelli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67:+More+Hidden+behind+a+'Classic+Proliferation+Marker'.">Ki-67: More Hidden behind a 'Classic Proliferation Marker'.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 747-748 (2018).</li><li>Bikkul, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+elongation+through+hTERT+immortalization+leads+to+chromosome+repositioning+in+control+cells+and+genomic+instability+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+fibroblasts,+expressing+a+novel+SUN1+isoform.">Telomere elongation through hTERT immortalization leads to chromosome repositioning in control cells and genomic instability in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts, expressing a novel SUN1 isoform.</a> Genes Chromosomes Cancer. 58 (6), 341-356 (2019).</li><li>Jackson, D. A., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+a+filamentous+nucleoskeleton+with+a+23+nm+axial+repeat.">Visualization of a filamentous nucleoskeleton with a 23 nm axial repeat.</a> EMBO Journal. 7, 3667-3677 (1988).</li><li>Albrethsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+the+nuclear+matrix+proteome.">Unravelling the nuclear matrix proteome.</a> Journal of Proteomics. 72, 71-81 (2009).</li><li>Mika, S., Rost, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMPdb:+Database+of+nuclear+matrix+proteins.">NMPdb: Database of nuclear matrix proteins.</a> Nucleic Acids Research. 33, 160-163 (2005).</li><li>Gavrilov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=of+the+nuclear+matrix-bound+chromatin+hubs+by+a+new+M3C+experimental+procedure.">of the nuclear matrix-bound chromatin hubs by a new M3C experimental procedure.</a> Nucleic Acids Research. 38, 8051-8060 (2010).</li><li>Sjakste, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+nuclear+matrix+proteins+in+malignant+transformation+and+cancer+diagnosis.">Role of the nuclear matrix proteins in malignant transformation and cancer diagnosis.</a> Experimental Oncology. 26 (3), 170-178 (2004).</li><li>Leman, E. S., Getzenberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+structure+as+a+source+of+cancer+specific+biomarkers.">Nuclear structure as a source of cancer specific biomarkers.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 104 (6), 1988-1993 (2008).</li><li>Volpi, E. V., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH+glossary:+an+overview+of+the+fluorescence+in+situ+hybridization+technique.">FISH glossary: an overview of the fluorescence in situ hybridization technique.</a> Biotechniques. 45 (4), 385-386 (2008).</li><li>Bridger, J. M., Foster, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+and+the+Genome.">Senescence and the Genome.</a> Human Interphase Chromosomes. , (2021).</li><li>Foster, H. A., Griffin, D. K., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interphase+chromosome+positioning+in+in+vitro+porcine+cells+and+ex+vivo+porcine+tissues.">Interphase chromosome positioning in in vitro porcine cells and ex vivo porcine tissues.</a> BMC Cell Biology. 13 (1), 30 (2012).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

DNA-halometoden är en utmärkt metod att välja när man analyserar interaktioner mellan nukleoskelettet och genomet, men det finns några kritiska steg som också måste följas. En av de viktigaste parametrarna är optimeringen av cellsådddensiteten. Om celler blir översammanflytande, kommer DNA-halorna att överlappa med angränsande celler vilket gör det omöjligt att utföra analysen. CSK- och extraktionsbuffertarna måste alltid göras färska på användningsdagen och spermin, spermidin och digitonin tillsätts extraktionsbufferten i slutet av beredningsprocessen för att bibehålla sin biologiska aktivitet. Om du utför Halo-FISH är det extremt viktigt att använda rätt denatureringstemperatur för DNA-halorna för att sonden eller färgen därefter ska kunna hybridiseras.
Elektronmikroskopi har använts för att visualisera kärnmatrisen, med filamentösa strukturer som identifieras20. Elektronmikroskopi är emellertid begränsad eftersom matrisföreningar med kromatin inte lätt kan härledas. Faktum är att DNA Halo-metoden är mer mångsidig jämfört med elektronmikroskopi eftersom specifika gener, kromosomer och celltillstånd alla kan undersökas. Vidare studeras proteomisk analys av kärnmatrisproteiner21,22. Denna metod är bra för att jämföra kärnmatriskomponenter, särskilt när man jämför sjuka celler, men den ger inte den rumsliga fördelningen och bilagorna som markeras av standard DNA Halo-tekniken.
DNA Halo-analyser har begränsningar. För det första, eftersom matrisen extraheras, kan detta endast utföras på fasta celler så levande avbildning är inte möjlig. Även om DNA Halo-metoden är relativt snabb och enkel att utföra, kan den övergripande processen vara tidskrävande när cellodling, sondgenerering, Halo-FISH och analys beaktas.
Bildtagning av DNA-halos och halo-fish med hjälp av superupplösningsmikroskopi skulle avsevärt förbättra upplösningen av DNA-specifika sonder och antikroppar. Dessutom, eftersom fluorokromer lättare kan lösas spektralt, kan det vara möjligt att använda ett antal DNA-sonder i ett enda experiment, vilket ger ännu mer information. Förbättringar i molekylärbiologiska tekniker såsom kromosomkonformationsfångst (3C) har använts för att bestämma interaktioner mellan genlokus och analysera den rumsliga organisationen på kromatin i cellen. DNA Halo-analyser och 3C kan kombineras, en term som kallas M3C23, vilket återigen visar anpassningsförmågan hos DNA Halo-tekniken.
De ursprungliga data som presenteras här är att visa möjligheterna för genombeteendeförhör och hur man presenterar dessa data. Med dessa data har vi visat att det är möjligt att bestämma signifikanta skillnader i genombindning med hjälp av (1) kromosommålningssonder, i denna studie avslöjar kromosom 18 att vara den minst fästa kromosomen av de analyserade (Figur 3); (2) Genlokus med signifikanta skillnader mellan två genlokus och (figur 4) (3) Telomerer, som är mindre starkt bundna i vilande celler jämfört med prolifererande och senescenta celler (figur 5). Vi kan skilja mellan prolifererande och icke-prolifererande celler via närvaron av proliferationsmarkören Ki67-antigen, vilket är ett olösligt protein, så förblir med restkärnorna eller använder införlivandet av nukleotider för att markera celler som har gått igenom S-fas inom en viss tidsperiod (Figur 2). Denna teknik har också gjort det möjligt för oss att analysera genombeteende i celler som är komprometterade i sina nukleoskelett, dvs laminopaticeller, och här och i Bikkul et al., 2018, avslöjar vi att genomet kan vara mindre tätt fäst jämfört med kontrollceller och kan återställas vid behandling med specifika läkemedel som förbättrar effekten av lamin A-mutationen i klassiska HGPS-celler15. Vi visar dock nya data här för de atypiska HGPS AGO8466-cellerna, som saknar en lamin A-mutation men innehåller en ovanlig form av LINC-komplexproteinet SUN119 som kromosom 13 är mindre tätt fäst i (figur 6).
HALO-FISH är en unik metod som möjliggör studier av genomiska interaktioner med nukleoskelettet i kombination med indirekt immunofluorescens för att lösa proteiner som inte avlägsnats från extraktionsproceduren. Det har visats att nukleoskelettet är modifierat vid olika sjukdomar såsom vissa cancertyper19 och betydelsen av vissa nukleoskelettassocierade proteiner som diagnostiska biomarkörer24,25. Således har denna teknik en viktig roll för att undersöka effekten av nukleoskelettet på kromatinorganisation / disorganisation vid sjukdom 15,24,25,27 och är inte begränsad till mänskliga celler, med kromosomala målningssonder från andra djur kan samma DNA-haloprotokoll användas 28.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated from:
Lauren S. Godwin1 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire
to:
Lauren S. Godwin1 
Emily Roberts2 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

"Kärnmatrisen" beskrevs först av Berezney och Coffey 19741. Efter att ha utfört extraktioner med höga saltmolariteter och nukleasbehandling på råttleverkärnor identifierade de en proteinhaltig strukturell ram. DNA-haloproceduren anpassades därefter från denna metod och innebär avlägsnande av lösliga proteiner så att endast kärnmatrisen (NM) och NM-associerade proteiner och kromosomer kvarstår. DNA-fästregioner är belägna vid basen av DNA-slingor och kallas matrisfästa regioner (MAR) eller ställningsfästregioner (SAR), som är resistenta mot extraktion med höga saltkoncentrationer respektive jontvättmedel litium-3,5-dijodsalicylat (LIS). I DNA-halos är DNA associerat med MAR / SAR bundet inom restkärnan medan DNA-slingorna sträcker sig bort från dessa platser och bildar DNA-halo. Vi vet nu att genomet är förankrat via lamina associerade domäner (LAD) till nukleära lamina och genom nukleolära associerade regioner (NADs) och eventuellt genom andra kärnstrukturer såsom specifika kärnkroppar.
DNA-halometoden kan användas för fysisk kartläggning av DNA, gener och kromosomala regioner eftersom det utökade DNA och kromatin ger en större upplösning eftersom kromatinet avlägsnas från histoner och DNA sträcks ut 2,3,4,5,6. Det finns dock vissa begränsningar när du använder DNA-halor för denna applikation. Till exempel kan DNA som är tätt associerat med kvarvarande kärnor i DNA-halos vara otillgängligt för sonder, vilket utesluter det från analys och fysisk kartläggning6. Andra tekniker som fiber-FISH 2,4,5,7 och molekylär kamning 8 möjliggör också fysisk kartläggning och har fördelen att vara relativt snabb och enkel att utföra. Båda används företrädesvis för DNA-kartläggning av gener över DNA-halos. Dessa metoder extraherar kromatinfibrer via användning av lösningsmedel eller saltextraktioner från kärnan, men molekylär kamning tenderar att ha bättre reproducerbarhet 8,9.
Det finns ett ökande bevis för att nukleoskelettet har en roll i att stödja viktiga kärnprocesser, såsom fästplatser för DNA, kromatinremodellering, DNA-transkription, DNA-reparation och DNA-replikation11,12. Som sådan utvecklades DNA-halotekniken för att undersöka interaktionerna mellan nukleoskelettet och genomet under dessa cellulära aktiviteter och har rutinmässigt använts och rapporterats i forskning. Denna teknik har också använts för att undersöka interaktioner mellan genomet och nukleoskelettet i relation till sjukdomsprogression med malignitetsrelaterade förändringar i kärnstruktur som identifierats11.
DNA-halotekniken har också använts för att undersöka förhållandet mellan genomet och nukleoskelettet under utveckling och differentiering12. Ett antal studier har använt en variant av DNA-halotekniken som kallas halosperm13 eller SpermHalo-FISH om den kombineras med FISH14. Spermatozoakromatin är tätt bundet till proteiner som kallas protaminer och denna teknik utvecklades för att förbättra tillgången till spermiernas DNA. Halosperm har använts för att undersöka integriteten hos spermatozoa DNA och avgöra om DNA-skador är närvarande. Spermatozoa med mindre DNA-skador korrelerar med en större DNA-halostorlek, medan spermatozoer med ökade nivåer av fragmenterat och skadat DNA hade antingen små halor eller ingen alls. Således kan halosperm användas som en potentiell prognostisk markör för embryokvalitet och framgångsrik graviditet med IVF13. Detta exempel betonar de potentiella kliniska tillämpningarna av denna teknik. I vårt arbete har vi använt HALO-FISH för att bedöma förändringar i genombeteende och effekten av specifika läkemedelsbehandlingar vid sjukdomen för tidigt åldrande Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome (HGPS)15.
Tillsammans belyser dessa, och andra studier, bredden av processer/tillämpningar som DNA-halotekniken kan användas för att studera och användbarheten av tekniken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10388739</td>
			<td>Used to create DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-2&#8242;-deoxy-uridine&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5002-100MG</td>
			<td>Labelled nucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503-100MG</td>
			<td>Labelled nucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Technical</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15562141</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A939-50G</td>
			<td>Check product size of DOP-PCR and nick translation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atypical type 2 HGPS fibroblasts (AG08466)</td>
			<td>Coriell Institute</td>
			<td>AG08466</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16269751</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-16-dUTP</td>
			<td>Roche Diagnostics&#160;</td>
			<td>11093711103</td>
			<td>Labelled nucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378-25G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Classical Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) fibroblasts (AG06297)&#160;</td>
			<td>Coriell Institute</td>
			<td>AG0297</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12608596</td>
			<td>Holds 5 slides or 8 slides back to back</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cot-1 DNA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15279011</td>
			<td>Block nonspecific hybridization in HALO FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>693520-1L</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4030</td>
			<td>Hybridisation mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D141</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-dUTP&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11093088910</td>
			<td>Labelled nucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Cy3</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>443611</td>
			<td>Probe precipitation and HALO FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Cell culture serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10523525</td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18421</td>
			<td>Spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herring sperm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7290</td>
			<td>Probe precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HXP&#8482; Lamp (metal halide microscope lamp)</td>
			<td>OSRAM</td>
			<td>HXP-R120W45C VIS</td>
			<td>Image capture of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10313680</td>
			<td>Cleaning microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516-25ML</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi PCR Kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK2103</td>
			<td>PCR Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM4000 fluorescent microscope with DFC365 FX camera and LAS AF (Version: 4.5.0) image acquisition software.</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Image capture of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani agar&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13274843</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Component of CSK buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10284580</td>
			<td>Cleaning and sterilizing microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-BrdU antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>B2531-100UL</td>
			<td>BrdU visualisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn calf serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16010159</td>
			<td>Cell culture serum and blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nick translation kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR grade water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>693520-1L</td>
			<td>PCR and DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1851</td>
			<td>Component of CSK and extraction buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190-100G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadriPERM&#174; 4 X 12</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>94.6077.307</td>
			<td>Square cell culture dish, polysterene with four compartments.&#160; This has hydrophobic surface, is sterile, non-pyrogenic/endotoxin-fee and non-cytotoxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Ki67 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ZRB1007-25UL</td>
			<td>Proliferation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6513</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber cement</td>
			<td>Halford&#39;s</td>
			<td>101836</td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-50</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6022-25G</td>
			<td>Spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Probe precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>Component of CSK, extraction and SSC buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8532</td>
			<td>Component of SSC buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate&#160;</td>
			<td></td>
			<td>L3771-100G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4264</td>
			<td>Component of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Cy3&#160;</td>
			<td>Amersham Life Sciences Ltd, Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>pa43001</td>
			<td>Probe antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>Component of CSK buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>CSK buffer+A66:D68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost&#8482; microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12372098</td>
			<td>Microscope slides: 1 mm thickness, 76 mm length, 26 mm width. Uncoated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swine anti-rabbit TRITC&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TELO-PNA FISH KIT</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>K532511-8</td>
			<td>Delineation of telomeres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253-100G</td>
			<td>Column buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>Component of CSK buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10158962</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416- 100ML</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mountant containing DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole human chromosome probes</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td></td>
			<td>2D FISH of DNA halos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10108202</td>
			<td>DNA isolation of BAC clones</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence in situ hybridization on dna halo preparations to reveal whole chromosomes, telomeres and gene loci

Genomet är associerat med flera strukturer inuti cellkärnor för att reglera dess aktivitet och förankra den på specifika platser. Dessa strukturer är kollektivt kända som nukleoskelettet och inkluderar kärnlamina, nukleolerna och kärnkropparna. Även om många varianter av fluorescens in situ hybridisering (FISH) finns för att studera genomet och dess organisation, är dessa ofta begränsade av upplösning och ger otillräcklig information om genomets samband med kärnstrukturer. DNA-halometoden använder höga saltkoncentrationer och nonjoniska tvättmedel för att generera DNA-slingor som förblir förankrade i strukturer inom kärnor genom bindningsregioner i genomet. Här extraheras lösliga kärnproteiner, såsom histoner, lipider och DNA som inte är tätt bundna till kärnmatrisen. Detta leder till bildandet av en halo av obundet DNA som omger en kvarvarande kärna som i sig innehåller DNA nära associerat med inre kärnstrukturer och extraktionsresistenta proteiner. Dessa utökade DNA-strängar möjliggör ökad upplösning och kan underlätta fysisk kartläggning. I kombination med FISH har denna metod den extra fördelen att den studerar genomiska interaktioner med alla de strukturer som genomet är förankrat i. Denna teknik, som kallas halo-fisk, är mycket mångsidig varigenom DNA-halos kan kopplas med nukleinsyrasonder för att avslöja genlokus, hela kromosomer, alfasatellit, telomerer och till och med RNA. Denna teknik ger en inblick i kärnans organisation och funktion i normala celler och i sjukdomsprogression som med cancer.

Denna metod för DNA-haloberedning har hjälpt oss i våra ansträngningar att bestämma skillnader i genombeteende inom unga och gamla celler, men också i celler som härrör från för tidiga åldrande sjukdomar med avvikande nukleoskeletala proteiner15. Figur 1 visar exempel på DNA-halos där det är möjligt att se kanten av en kvarvarande kärna, DNA kvar i restkärnan och det obundna DNA som har spolat ut i det omgivande området och skapat en DNA-halo. Den visar också analysen som visar hur restkärnan erhålls och NE- och CTE-mätningarna. Det är möjligt att skilja mellan prolifererande och icke-prolifererande celler genom att antingen införliva en märkt nukleotid, såsom BrdU, när celler är i S-fas eller använda den diagnostiska proliferationsmarkören anti-pKi67, som avslöjar nukleoler, och regioner av heterokromatin i G1-celler17,18. Primära celler som odlas i högt serum utan att uppnå sammanflöde, som är negativa för proliferationsmarkörerna, antas vara senescenta. Primära celler som odlas i lågt serum eller har blivit konfluenta, dvs kontakthämmade som är negativa för proliferationsmarkörerna anses vara vilande och skulle kunna återinträda i den proliferativa cellcykeln med rätt näringsämnen och situation. Att kunna skilja mellan Ki67-positiva och negativa celler har gjort det möjligt för oss att bestämma skillnader mellan proliferera, vilande och senescenta humana dermala fibroblaster. Figur 2 visar DNA-halos av prolifererande humana dermala fibroblaster skapade från celler där BrdU införlivades i dem under DNA-replikation, en mekanism som inte förekommer i icke-prolifererande celler och därefter färgades med anti-BrdU-antikropp. Färgning med proliferativ markör anti-pKi67-antikropp syns också i figur 2. Detta är ett robust antigen och överlever FISH-protokollet och kan därför färgas för post-FISH och förmontering. Således är prolifererande celler positiva (röda) för BrdU och anti-pKi67 (röda) i den vänstra kolumnen och icke-prolifererande celler, faktiskt senescenta celler i figur 2 visas i den högra kolumnen. De gröna signalerna är individuella telomerer avslöjade med ett telomer-PNA FISH/FITC-kit. Kombination av immunofluorescens med DNA-halos möjliggör analys under olika celltillstånd, vilket visas i figur 2 vid undersökning av proliferera, vilande och senescenta celler. Beroende på vilken antikropp som väljs kan andra tillstånd undersökas, såsom differentiering, DNA-skador via bestrålning etc.
Kromosomrevir kan också visualiseras i DNA-halos med hjälp av FISH. På grund av preparatet som tillåter spolning av DNA ut ur kärnorna kan kromosomrevirformen störas, med mindre eller större mängder av kromosomen som finns i DNA-halon, beroende på förankringen av genomet inuti restkärnan och dess strukturer. Figur 3 avslöjar en panel av DNA-halos där enskilda kromosomer har avslöjats med specifika hela armkromosommålningssonder (röda) för kromosomerna 1, 13, 17 och 18. Anti-pKi67 (grön) har använts för att markera prolifererande celler och dess frånvaro inom samma kultur, på samma bild, vilket betecknar senescenta celler. Det framgår mycket tydligt av bilderna och de data som presenteras som CTE/NE att den lilla genfattiga kromosomen 18 är en kromosom som har få fästen och spolar längre ut i DNA-halon bort från restkärnorna och är betydligt längre från mitten av restkärnorna än de andra kromosomerna. Detta gäller dock även för kromosom 1. Med hjälp av den proliferativa markören anti-pKi67 har det också varit möjligt att jämföra proliferering med senescenta celler, inom samma kultur och på samma objektglas, och denna analys har visat att kromosomer inom dessa två mycket olika cellstatuser inte skiljer sig signifikant från varandra, med avseende på bindning med de kvarvarande kärnstrukturerna.
Intressant nog visar gener också statistiskt signifikanta skillnader mellan prolifererande och senescenta celler med avseende på att förbli inom en kvarvarande kärna eller vara belägen i DNA-halo. Figur 4 visar detta med genlokus avgränsade av märkta BAC-sonder i rött och anti-Ki67 i grönt. Det finns inga signifikanta skillnader mellan genplatser i prolifererande kontra senescenta celler, efter ett DNA Halo-preparat. Det finns dock betydligt fler catenin alpha 1 CTNNA1-loci inom DNA-halo än cyklin D1 CNDD1-loci , där det finns mycket få. Figur 5 visar DNA-halopreparat med telomerer i grönt. Bakgrunden lämnas medvetet hög för att telomersignaler ska kunna visualiseras i DNA-halo. I denna uppsättning data har vilande celler, dvs celler som har varit serumsvält i 7 dagar inkluderats och intressant nog finns det betydligt fler telomerer som inte är fästa och ligger i DNA-halorna i vilande celler än för prolifererande och senescenta celler. I figur 5a kan andelen telomerer i DNA-halo observeras, särskilt för bilden "experiment 2". Detta motsvarar figur 5b där den genomsnittliga andelen telomerer i DNA-halo är cirka 17% i vilande celler. Det finns vissa bevis för att inte alla telomerer i senescenta celler kan ses som några av dem kanske mycket korta.
Denna metod för DNA-halo har varit framgångsrik för oss att undersöka genominteraktionsförändringar inom kärnor i sjuka celler15. Figur 6 visar skillnader i kromosombindning i primärkontrollfibroblaster och i sjuka celler med typisk (lamin A-mutation) och atypisk Hutchinson-Gilford Progeria syndrom, vilket uttrycker en annan SUN1-isoform och ingen lamin A-mutation19. Kromosomerna 1 och 13 visar statistiskt signifikanta skillnader i deras bindning inom restkärnorna jämfört med kontroll-DNA-halos. Figur 6b korrelerar positionen för hela kromosomområdet till restkärnan och DNA-halo. Värden på 1 eller mindre indikerar att kromosomen ligger inom den återstående kärnan och värden över 1 visar kromosomer eller delar av kromosomer inom DNA-halo.
Sammantaget belyser detta nyttan av HALO-FISH för att undersöka genomiska interaktioner mellan hela kromosomer, specifika gener och telomerer under olika förhållanden som påverkar cellcykeln (proliferation, vilande och åldrande) eller inom sjukdomsceller, t.ex. progeria och cancercellinjer. Faktum är att skillnaderna i interaktioner mellan dessa tillstånd innebär att nukleoskeletten har en viktig roll för att reglera nyckelprocesser inom kärnan.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig01.jpg"> Figur 1: HDF-extraherad kärna som visar kvarvarande kärna och DNA-halo och översikt över analysmetod. a) En HDF-kärna som beretts via DNA-haloanalys och motfärgats med DAPI. Den ljust färgade kvarvarande kärnan visar DNA förankrat i nukleoskelettet och detta är omgivet av det icke-bundna DNA som bildar en halo av DNA. Förstoring = x 100; skalstreck 10 μm. b) Den blå kanalen fångar upp den DAPI-färgade kärnan och omgivande DNA. Den återstående kärnan väljs och avlägsnas med ImageJ. Pilen visar avståndet från kärncentret till den återstående kärnkanten (NE). c) Den röda kanalen visar sondsignalen. d) Den bild som betecknas "Resultat" är resultatet av att den röda kanalen läggs ovanpå den blå kanalbilden. detta möjliggör avståndet från kärncentret till den längsta kromosomområdeskanten (CTE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig02.jpg"> Figur 2: DNA-halopreparat med telomeren PNA FISH på prolifererande och senescenta HDF. Telomeren PNA FISH på HDF som utsatts för DNA-haloanalys. Telomersignaler visualiseras i grönt (FITC), rest- och halo-DNA motfärgades med DAPI (blått) och prolifererande kärnor detekterades med antingen anti-BrdU- eller anti-pKi67-antikroppar via indirekt immunofluorescens i rött (TRITC). Förstoring = x 100; Skalstreck 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig03.jpg"> Figur 3: Nukleoskelett-kromosominteraktioner och analys med DNA-haloanalys. a) 2D-FISH med prober specifika för kromosomerna 1, 13, 15, 17 och 18 utfördes på HDF som utsatts för DNA-halopreparat. Hela kromosomer målades i rött (Cy3) och kärnor undersöktes med pKi67 för att avgöra om de förökade sig eller senescent. Prolifererande celler (pKi67+) avgränsades i grönt (FITC), medan senescenta celler förblev ofärgade (pKi67-) dvs ingen grön signal detekterades. Förstoring = x 100; skalstång 10 μm. b) Kromosomförankring av nukleoskelettet i prolifererande och senescenta HDF som genomgått halofisk. Mätningar visar förhållandet mellan den längsta kromosomrevirkanten (CTE) och respektive kärnkant (NE) för kromosomerna 1, 13, 15, 17 och 18 i prolifererande (pKi67+) och senescenta (pKi67-) celler. Felstaplar representerar ± SEM. (c) Modifierad låddiagramrepresentation av kromosomrevirkanten (CTE) till respektive kärnkant (NE) av specifika kromosomer i pKi67+ och pKi67-kärnor. Q1 = nedre kvartil; Min = lägsta registrerade värde; Med = median; Max = högsta registrerade värde; Q3 = övre kvartil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig04.jpg"> Figur 4: Genspecifika interaktioner i HDF med halo-fisk. a) DNA-haloextraherade kärnor undersöktes med genspecifika sonder (CCND1 och CTNNA1) för att undersöka deras förankring till NM på prolifererande och senescenta celler. Gensignalerna visas i rött (Cy3) och anti-pKi67 visar prolifererande celler och signalen visualiseras i grönt (FITC). För den prolifererande CCND1-bilden är den återstående kärnan innesluten i den vita cirkeln, och utrymmet mellan den vita och gröna cirkeln visar DNA-halo. Förstoring = x 100; Skalstapel 10 μm. b) Genspecifika signaler för CCND1 och CTNNA1 jämförs mellan den kvarvarande kärnan och DNA-halo, och även mellan prolifererande och senescenta celler. Felstaplar representerar ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig05.jpg"> Figur 5: DNA-haloanalys på vilande HDF sonderade med telomeren PNA-FISH. a) Bibehållna fettfibrers stillhet inducerades genom odling i ett lågserummedium i 7 dagar. DNA-haloanalysen utfördes och PNA-FISH möjliggjorde visualisering av telomerer med FITC-signal (grön) och den kvarvarande kärnan och omgivande DNA-halo motfärgades med DAPI (blå). Celler färgades också med anti-pKi67-antikroppar för att säkerställa att kärnorna inte förökades. Detta upprepades vid två olika tillfällen. Förstoring = x 100; Skalstapel 10 μm. b) Jämförelse av den genomsnittliga procentandelen telomerer lokaliserade i DNA-halo i prolifererade, senescenta och vilande HDF-celler. Felstaplar representerar ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig06.jpg"> Figur 6: Undersökning av hela kromosomförankringen till nukleoskelettet i HGPS-celler med hjälp av HALO-FISH26. (a) Kontrollera HDF (2DD), klassisk HGPS (AG06297) och atypisk typ 2 HGPS (AG08466) kärnor genomgick DNA-haloberedning och sedan 2D-FISH med användning av hela kromosomfärger för kromosom 1, 13, 15 och 17. Hela kromosomer avbildas i grönt (FITC) och DNA motfärgades med DAPI (blått). Förstoring = x 100; Skalstång 10 μm. (b) Positionering av kromosomer inom extraherade kärnor bestämdes genom att mäta förhållandet mellan den genomsnittliga kromosomrevirkanten (CTE) och kärnkanten (NE). Ett förhållande över 1 visar att den längsta CTE ligger utanför motsvarande NE inom DNA-halo, medan ett förhållande under 1 betyder att den längsta CTE ligger inom NE inom restkärnan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Beståndsdelar</td>
			<td>Volym (μL)</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>5XDOP-PCRbuffert</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>dNTPmix(utanTTP)(2mM)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>dTTP(2mM)</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Biotin-16-dUTPorDigoxigenin-11-dUTP</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>DOPprimer (20μM)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>TaqDNAPolymeras(1U/μL)</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>PCRgradevatten</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td>Mall</td>
			<td>5</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Tabell som visar DOP-PCR-komponenter och volymer för en 1x-reaktion
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Steg</td>
			<td>Cykler</td>
			<td>Temp (examen Celsius)</td>
			<td>Tid</td>
		</tr><tr><td>Inledande denaturering</td>
			<td>1</td>
			<td>95</td>
			<td>3 minuter</td>
		</tr><tr><td>Denaturering</td>
			<td rowspan="3">34</td>
			<td>98</td>
			<td>20 sekunder</td>
		</tr><tr><td>Primer glödgning</td>
			<td>62</td>
			<td>1 minuter</td>
		</tr><tr><td>Förlängning</td>
			<td>72</td>
			<td>30 sekunder</td>
		</tr><tr><td>Slutlig förlängning</td>
			<td>1</td>
			<td>72</td>
			<td>5 minuter</td>
		</tr><tr><td>Kylning</td>
			<td></td>
			<td>4</td>
			<td>Hålla</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 2: Tabell som visar DOP-PCR-cykel, temperatur och tidsprofil.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Konstituerande</td>
			<td>Volym (μL)</td>
		</tr><tr><td>10x NT-buffert (0,5M Tris-HCl pH 8,50 mM MgCl2, 0,5 mg/ml BSA)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>0,1 M beta-merkaptoetanol</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>10X nukleotidlager (0,5 mM dATP, 0,5 mM dCTP, 0,5 mM dGTP, 0,5 mM dTTP, 0,5 mg/ml biotin-16-dUTP)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Dnas I (1 ng/ml)</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>DNApolymeras I</td>
			<td>5U per μg DNA</td>
		</tr><tr><td>DNAmall (1 μg)</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>DEPC-behandlat vatten</td>
			<td>Till 50 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 3: Tabell som visar nicköversättningskomponenter och volymer för en prob.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci at JoVE.com

Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

Genom att kombinera DNA-halopreparat med fluorescens in situ-hybridisering möjliggörs högupplöst analys av genomiska interaktioner med nukleoskelettet. Bifogat genom leder till hybridiserade fluorescerande signaler belägna inom de kvarvarande extraherade kärnorna, medan icke-bundet genom ligger i DNA-halo som omger restkärnorna.

Fluorescens in situ-hybridisering på DNA-halopreparat för att avslöja hela kromosomer, telomerer och genlokus

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These ...

Detta protokoll kan användas för att bedöma bilagor till nukleoskelettet snarare än att använda DamID-sekvensering, och det är en enda cellanalys. Den största fördelen med att använda denna metod är att den är kostnadseffektiv och lättillgänglig. Det kan belysa funktionella skillnader mellan gener och kromosomer som normalt inte kan uppstå med andra visualiseringstekniker.Rumsliga och funktionella organisationer inom genomet i behandlade cancer- och progeriaceller och genomiska beteendemässiga skillnader i senescenta celler kan bedömas med hjälp av detta protokoll. Denna metod kan tillämpas på vilken cell- eller vävnadstyp som helst under hela livslängden och av vilken sjukdom som helst. Det kan också användas i modellorganismer där sonder finns tillgängliga.Börja med att förbereda 500 ml 10% saltsyra och häll den i en stor bägare. Släpp mikroskopet individuellt i syran och inkubera dem i en timme vid rumstemperatur på en shaker inställd på två G.Dekantera syran från bägaren och tvätta glasen 10 gånger i kranvatten. Sedan ytterligare 10 gånger i avjoniserat vatten.Skölj glasen i metanol två gånger och förvara dem i metanol tills sterilisering. Tippa glasen på en pappershandduk för att torka och linda dem i folie för sterilisering i en autoklav eller varm ugn. Odla celler i lämpligt medium med serum i minst 48 timmar vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid tills 60 till 70% sammanflöde uppnås.Skörda varje celltyp och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer. Frö en gånger 10 till de fem cellerna i 10 ml medium per bild. Ta bort odlingsskålen som innehåller glasen och bifogade celler från inkubatorn.Kassera mediet och märk bilderna med en penna. Lägg dem sedan i en coplinburk som innehåller 50 ml iskall cytoskelettbuffert. Inkubera burken i 15 minuter på is eller vid fyra grader Celsius.Kassera cytoskelettbufferten och skölj snabbt glasen i 50 ml engångs-DNA-halobuffert tre gånger genom att doppa dem i en coplinburk med bufferten. Överför objektglas till en coplinburk som innehåller 50 ml extraktionsbuffert och inkubera i fyra minuter vid rumstemperatur. Inkubera sedan objektglasen i 50 ml 10 gånger, fem gånger, två gånger och en gång DNA-halobuffert i en minut vardera.När du är klar, doppa glasen genom en sekventiell etanolserie med 10, 30, 70 och 95% etanol. Ta bilderna genom en sekventiell 50 milliliter etanolserie med 70, 90 och 100% etanol i fem minuter vardera. Lufttorka dem på en värmeplatta.Baka sedan i en 70 grader Celsius ugn i fem minuter. Denaturera objektglasen genom att placera dem i 70% formamid två gånger SSC-lösning i två minuter vid 70 grader Celsius. Lägg de denaturerade glasen i 50 ml iskall 70% etanol i fem minuter.Flytta dem sedan genom en etanolserie på 90, 95 och 100% vid rumstemperatur i fem minuter vardera. När du är klar, lufttorka glasen på en värmeplatta. Denaturera DNA-sonderna vid 75 grader Celsius i 10 minuter i ett varmt block eller vattenbad.Inkubera dem sedan vid 37 grader Celsius i 30 minuter innan du pipetterar 10 mikroliter på lämplig bildglas. Överlägg sonden med en 21 x 21 millimeter täckglas och försegla den med gummicement. Inkubera objektglasen i minst 18 timmar vid 37 grader Celsius i en fuktad hybridiseringskammare.Efter inkubationen, ta försiktigt bort gummicementet med pincett. Inkubera sedan objektglasen i 50 ml 50 % formamid två gånger SSC-lösning vid pH sju som har förvärmts till 45 grader Celsius under tre fem minuters inkubationer. Placera sedan objektglasen i 50 ml 0,1 gånger SSC-lösning som har förvärmts till 60 grader Celsius, men placerats i ett 45 grader Celsius vattenbad.Inkubera i fem minuter och byt ut bufferten två gånger i fem minuters inkubationer. Placera objektglasen i en coplinburk innehållande 50 ml fyra gånger SSC-lösning vid rumstemperatur och inkubera i 15 minuter med tre buffertbyten. För att förhindra icke-specifik antikroppsbindning, applicera 100 mikroliter 4% BSA fyra gånger SSC-lösning på varje glas och lägg över den med en bit paraffinfilm.Inkubera vid rumstemperatur i 10 minuter. Inkubera sedan objektglasen med 100 mikroliter streptavidin Cy3 utspädd en på 200 i en timme vid rumstemperatur för att detektera den märkta sonden. Placera objektglasen i en coplinburk innehållande 50 ml fyra gånger SSC-lösning vid rumstemperatur och inkubera i 15 minuter med tre buffertbyten.Montera objektglasen i 20 mikroliter av en monteringslösning innehållande DAPI och överlägg med ett täckglas på 22 x 50 millimeter. Visualisera DNA-halos och kromosomområden med hjälp av ett epifluorescensmikroskop med ett 100X oljemål. DNA-halopreparat gör det möjligt att se kanten av en kvarvarande kärna, DNA kvar i restkärnan och det obundna DNA som har spolat ut i det omgivande området.DNA-halos av prolifererande humana dermala fibroblaster skapades från celler med införlivad BRDU och färgades därefter med anti-BRDU-antikropp. Prolifererande celler var positiva för BRDU och anti-pKi-67. Detta protokoll användes för att visualisera kromosomområden inom DNA-halos.Individuella kromosomer märktes med specifika hela armkromosommålningssonder för kromosomerna 1, 13, 17 och 18. Anti-pKi-67 användes för att markera prolifererande celler och dess frånvaro inom samma kultur. DNA-halopreparat med telomerer i grönt visas här.Det är möjligt att observera andelen telomerer i DNA-halo, särskilt i experimentet två bilder. Den genomsnittliga andelen telomerer var cirka 17% i vilande celler. Skillnader i kromosombindning upptäcktes i primärkontrollfibroblaster och i sjuka celler med typiskt och atypiskt Hutchinson-Gilford progeria syndrom, vilket uttryckte en annan Sun1-isoform och ingen Lamin A-mutation.Kromosom ett och 13 visar statistiskt signifikanta skillnader i deras bindning inom de kvarvarande kärnorna jämfört med kontrollerade DNA-halos. Positionen för hela kromosomområdet var korrelerad med den återstående kärnan och DNA-halo. När du försöker detta protokoll, se till att celler sås med rätt densitet och extraheras vid rätt tidpunkt.Efter denna procedur kan indirekt immunofluorescens och RNA FISH utföras.

Research

JoVE Journal

Biology

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Dubbel Hela Montera in situ hybridisering för tidig kycklingembryon

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafisk Hela Mount högupplöst Dubbel Fluorescerande In Situ Hybridisering

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

Fluorescens På plats Hybridisering (FISH) Protokoll i mänskliga spermier

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Använda Hela Mount På plats Hybridisering till Link Molekyl-och organismbiologi

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Hela berget<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering av E8.5 till E11.5 musembryon

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioaktivt In situ Hybridisering för Upptäcka Diverse Mönster genuttryck i Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Detektering av viralt RNA genom Fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Hög kapacitet fysisk Kartläggning av kromosomer med hjälp av automatiserad<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Analys av encelliga gentranskription av RNA-lysrör<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...