Name: using immunofluorescence to detect pm2.5-induced dna damage in zebrafish embryo hearts
Uploaded: 2021-02-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية لعلوم الطبيعة في الصين (رقم المنحة: 81870239، 81741005، 81972999) وتطوير البرنامج الأكاديمي ذي الأولوية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو.

تم الحصول على سمك الحمار الوحشي البري (AB) المستخدم في هذه الدراسة من المركز الوطني لموارد سمك الحمار الوحشي في ووهان، الصين. وقد تم استعراض جميع الإجراءات الحيوانية المبينة هنا والموافقة عليها من قبل مؤسسة رعاية الحيوان التابعة للجنة الأخلاقيات في جامعة سوتشو.
1. PM2.5 أخ?...

<ol>
	<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Exposure+to+Air+Pollution+and+Risk+of+Congenital+Heart+Defects.">Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects.</a> European Journal of Pediatrics. 175, 1520 (2016).</li><li>Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+exposure+to+PM2.5+and+Congenital+Heart+Diseases+in+Taiwan.">Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan.</a> The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).</li><li>Mesquita, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+assessment+of+urban+atmospheric+particle-bound+PAHs:+relevance+of+composition+and+particle+size+in+Barcelona+(Spain).">Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain).</a> Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+AhR+and+wnt/beta-catenin+signal+pathways+in+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos.">Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).</li><li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-organ+toxicity+induced+by+fine+particulate+matter+PM2.5+in+zebrafish+(Danio+rerio)+model.">Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model.</a> Chemosphere. 180, 24-32 (2017).</li><li>Lorda-Diez, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+senescence,+apoptosis+and+DNA+damage+cooperate+in+the+remodeling+processes+accounting+for+heart+morphogenesis.">Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis.</a> Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).</li><li>Kouassi, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+induced+in+A549+cells+by+physically+and+chemically+characterized+air+particulate+matter+(PM2.5)+collected+in+Abidjan,+Cote+d'Ivoire.">Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire.</a> Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).</li><li>Gualtieri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+A549+cells+exposed+to+Milan+PM2.5.">Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5.</a> Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).</li><li>Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+glycation+endproduct+induces+ROS+accumulation,+apoptosis,+MAP+kinase+activation+and+nuclear+O-GlcNAcylation+in+human+cardiac+myocytes.">Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes.</a> Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).</li><li>Yamashita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+zebrafish+development.">Apoptosis in zebrafish development.</a> Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry &amp; Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).</li><li>Moazzen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acetylcysteine+prevents+congenital+heart+defects+induced+by+pregestational+diabetes.">N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes.</a> Cardiovascular Diabetology. 13, 46 (2014).</li><li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetylcysteine,+reactive+oxygen+species+and+beyond.">N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 9, 109-110 (2010).</li><li>Tu, S., Chi, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+in+cardiac+development+and+congenital+heart+birth+defects.">Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects.</a> Differentiation. 84, 4-16 (2012).</li><li>Asnani, A., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+tool+to+identify+novel+therapies+for+human+cardiovascular+disease.">The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7, 763-767 (2014).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+effects+of+polychlorinated+biphenyls+on+cardiac+development+in+zebrafish.">Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish.</a> Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).</li><li>Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+particulate+matter+from+cigarette+smoke+disrupts+vascular+development+in+zebrafish+brain+(Danio+rerio).">Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio).</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).</li><li>Ren, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AHR-mediated+ROS+production+contributes+to+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos.">AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> The Science of the Total Environment. 719, 135097 (2020).</li><li>van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+consensus+on+cardiac+regeneration.">An emerging consensus on cardiac regeneration.</a> Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).</li><li>Yue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+folic+acid+on+PM2.5-induced+cardiac+developmental+toxicity+in+zebrafish+embryos+by+targeting+AhR+and+Wnt/beta-catenin+signal+pathways.">Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways.</a> Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).</li><li>Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+nanoparticles+induce+oxidative+DNA+damage+and+ROS-triggered+mitochondria-mediated+apoptosis+in+zebrafish+embryos.">Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos.</a> Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).</li><li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity,+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish.">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+effects+on+glutathione-S-transferase+activity+induced+by+atrazine+exposure+in+zebrafish+(Danio+rerio).">DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).</li></ol>

على الرغم من أن سمك الحمار الوحشي هو نموذج فقاري ممتاز لدراسة سمية النمو القلبي للمواد الكيميائية البيئية ، بسبب صغر حجم قلب الجنين ، فمن الصعب الحصول على ما يكفي من البروتين لتحليل البقع الغربية. لذلك، نقدم طريقة immunofluorescence حساسة لتحديد مستويات التعبير البروتين من المؤشرات الحيوية تلف ال...

تلوث الهواء هو الآن مشكلة بيئية خطيرة تواجه العالم. الجسيمات الدقيقة المحيطة (PM2.5)،والتي تعد واحدة من أهم مؤشرات جودة الهواء، يمكن أن تحمل عددا كبيرا من المواد الضارة وتدخل في نظام الدورة الدموية في الدم، مما يسبب ضررا خطيرا لصحة الإنسان1. وقد أظهرت الدراسات الوبائية أن التعرض PM2.5 يمكن أن يؤدي إلى زيادة خطر عيوب القلب الخلقية (CHDs)2,3. كما أظهرت الأدلة المستقاة من التجارب على الحيوانات أن PM2.5 يمكن أن يسبب نموا غير طبيعي في القلب في أجنة حمار وحشي وذرية الفئران ولكن الآليات الجزيئية لسمية نمو القلب من PM2.5 لا تزال غير معروفة إلى حد كبير4،5،6.
تلف الحمض النووي يمكن أن يسبب توقيف دورة الخلية والحث على موت الخلايا المبرمج، والتي قد تدمر على نطاق واسع إمكانات خلايا السلف، وبالتالي، يضعف نمو القلب7). وقد تم توثيق جيدا أن الملوثات البيئية، بما في ذلك PM2.5،لديها القدرة على مهاجمة الحمض النووي من خلال آليات الإجهاد التأكسدي8،9. كل من الإنسان والحمار الوحشي تطور القلب حساسة للإجهاد التأكسدي10،11،12. 8-OHdG هو علامة تلف الحمض النووي التأكسدي، وإشارة γH2AX هو علامة على فواصل حبلا مزدوجة الحمض النووي. N-أسيتيل-L-السيستين (NAC), السلائف الاصطناعية من السيستين داخل الخلايا والجلوتاثيون, يستخدم على نطاق واسع كمركب مضاد للأكسدة. في هذه الدراسة، ونحن نستخدم NAC للتحقيق في دور الإجهاد التأكسدي في PM2.5- تلف الحمض النووي المستحث13.
وقد استخدمت على نطاق واسع حمار وحشي كنموذج الفقاريات لدراسة تطور القلب وأمراض القلب والأوعية الدموية البشرية لأن آليات نمو القلب يتم الحفاظ عليها للغاية بين الفقاريات14،15. وتشمل مزايا استخدام حمار وحشي كنموذج صغر حجمها، والقدرة الإنجابية القوية، وانخفاض تكلفة التغذية. ذات أهمية خاصة لهذه الدراسات، أجنة حمار وحشي لا تعتمد على نظام الدورة الدموية خلال التنمية المبكرة ويمكن البقاء على قيد الحياة تشوه القلب الحاد14. وعلاوة على ذلك، فإن شفافيتها تسمح بمراقبة الجسم بأكمله مباشرة تحت المجهر. وهكذا، توفر أجنة حمار وحشي فرصة متميزة لتقييم الآليات الجزيئية المشاركة في تحريض سمية نمو القلب نتيجة التعرض لمختلف المواد الكيميائية البيئية5و16و17. لقد سبق أن ذكرت أن PM2.5-الناجم عن الإجهاد التأكسدي يؤدي إلى تلف الحمض النووي وموت الخلايا المبرمج, مما أدى إلى تشوهات في القلب في حمار وحشي18. في هذه الدراسة، ونحن نقدم بروتوكول مفصل للتحقيق PM2.5-الناجم عن تلف الحمض النووي في قلب أجنة حمار وحشي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-OHdG Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, USA</td>
			<td>sc-66036</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorius,China</td>
			<td>BSA124S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Solarbio,Beijing,China</td>
			<td>SW3015</td>
			<td>For blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam, USA</td>
			<td>ab104139</td>
			<td>For nuclear counterstain.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Solarbio,Beijing,China</td>
			<td>D8371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>IX73</td>
			<td>For imaging fluorescence signals/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG Cy3</td>
			<td>Carlsbad,USA</td>
			<td>CW0159</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG FITC</td>
			<td>Carlsbad,USA</td>
			<td>RS0003</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine(NAC)</td>
			<td>Adamas-Beta, Shanghai, China</td>
			<td>616-91-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>QILINBEIER,China</td>
			<td>TS-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma,China</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Make 4% paraformaldehyde for fixation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>HyClone,USA</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>Prepare 0.1% Tween in PBS for washing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM2.5 sampler</td>
			<td>TianHong,Wuhan, China</td>
			<td>TH-150C</td>
			<td>For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Re-circulating aquaculture system</td>
			<td>HaiSheng,Shanghai,China</td>
			<td></td>
			<td>The zebrafish was maintained in it.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soxhlet extractor</td>
			<td>ZhengQiao,Shanghai, China</td>
			<td>BSXT-02</td>
			<td>For organic components extraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon,Canada</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td>For heart dissection from zebrafish embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (MS222)</td>
			<td>Sigma,China</td>
			<td>E10521</td>
			<td>To anesthetize zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma,China</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;H2AX Antibody</td>
			<td>Abcam, USA</td>
			<td>ab26350</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using immunofluorescence to detect pm2.5-induced dna damage in zebrafish embryo hearts

يمكن أن يؤدي التعرض للجسيمات الدقيقة المحيطة (PM2.5)إلى سمية نمو القلب ولكن الآليات الجزيئية الأساسية لا تزال غير واضحة. 8-هيدروكسي-2'deoxygenase (8-OHdG) هو علامة على تلف الحمض النووي التأكسدي وγH2AX هو علامة حساسة لاستراقات حبلا مزدوجة الحمض النووي. في هذه الدراسة، كنا نهدف إلى الكشف عن PM2.5-الناجمة عن 8-OHdG و γH2AX التغييرات في قلب أجنة حمار وحشي باستخدام فحص immunofluorescence. عولجت أجنة حمار وحشي مع المسائل العضوية القابلة للاستخراج (EOM) من PM2.5 في 5 ميكروغرام / مل في وجود أو عدم وجود مضادات الأكسدة N-أسيتيل-L-السيستين (NAC, 0.25 ميكرومتر) في 2 ساعة بعد الإخصاب (hpf). تم استخدام DMSO كتحكم في السيارة. في 72 حصان، تم تشريح القلوب من الأجنة باستخدام إبرة حقنة وثابتة و permeabilized. بعد حظرها، تم فحص العينات مع الأجسام المضادة الأولية ضد 8-OHdG و γH2AX. ثم تم غسل العينات واحتضانها بأجسام مضادة ثانوية. وقد لوحظت الصور الناتجة تحت المجهر الفلوري وتم قياسها كميا باستخدام ImageJ. تظهر النتائج أن EOM من PM2.5 عززت بشكل كبير إشارات 8-OHdG و γH2AX في قلب أجنة حمار وحشي. ومع ذلك ، فإن NAC ، الذي يعمل كزبال لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، تصدى جزئيا لتلف الحمض النووي الناجم عن EOM. هنا، نقدم بروتوكولا للمناعة للتحقيق في دور تلف الحمض النووي في عيوب القلب الناجمة عن PM2.5التي يمكن تطبيقها للكشف عن التغيرات البيئية الناجمة عن التعبير البروتيني الناجم عن المواد الكيميائية في قلوب أجنة حمار وحشي.

هذا الفحص immunofluorescence هو وسيلة حساسة ومحددة لقياس التغيرات التعبير البروتين في قلوب أجنة حمار وحشي تتعرض للمواد الكيميائية البيئية.
في هذا التحليل التمثيلي، تم تقييم الأجنة المعرضة لPM2.5 في غياب أو وجود NAC المضادة للأكسدة لوجود تشوها?...

Watch this Scientific Journal Video about Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts at JoVE.com

Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts

يستخدم هذا البروتوكول فحص المناعة للكشف عن تلف الحمض النووي الناجم عن PM2.5في القلوب التشريحية لأجنة حمار وحشي.

باستخدام Immunofluorescence للكشف عن PM2.5-الناجم عن تلف الحمض النووي في قلوب الأجنة حمار وحشي

Ambient fine particulate matter (PM2.5) exposure can lead to cardiac developmental toxicity but the underlying molecular mechanisms are still unclear. ...

يمكن استخدام هذه الطريقة للكشف بدقة وسهولة عن التعبير عن البروتينات المستهدفة في قلب حمار وحشي. يتم الكشف عن التغير في البروتين المستهدف مباشرة عن طريق قياس الفلورسينس المناعي. إجراء جمع جنين حمار وحشي وعلاجه، كما هو موضح في المخطوطة النصية.في 72 ساعة بعد الإخصاب، نقل الأجنة إلى الشرائح الزجاجية، ومراقبتها تحت المجهر ستيريو. سجل تشوهات القلب، مثل وذمة التامور، وتغيير الحلقات وانخفاض الحجم. احسب معدلات التشوه وحلل الاختلافات بين المجموعات باستخدام طريقة واحدة ل ANOVA، يليها اختبار المقارنة المتعدد في تركيا.بعد تخدير الأجنة مع 0.6 ملليغرام لكل ملليلتر MS222، سجل ضربات القلب لمدة 30 ثانية، وتحديد معدلات ضربات القلب باستخدام برنامج Image J. تشريح بعناية قلوب من أجنة السمك حمار وحشي مع إبرة حقنة المتاح تحت المجهر ستيريو. استخدم قلم حاجز مسعور لرسم دائرة على شريحة زجاجية نظيفة.إضافة 50 ميكرولتر من 4٪ paraformaldehyde إلى 1.25 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لجعل حل التثبيت، ثم وضع ثلاثة قلوب تشريح في دائرة حاجز واحد الكاره للماء، واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. decant الحل تحت المجهر وتجفيف العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق على الأقل. غسل الشرائح ثلاث مرات في PBST لمدة خمس دقائق لكل غسل.إضافة 50 ميكرولتر من BSA إلى 1000 ميكرولتر من PBST للحصول على حل 5٪ BSA، واحتضان الشرائح في غرفة رطبة لمدة ساعة واحدة لمنع ربط الأجسام المضادة غير محددة. decant الحل وغسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق لكل غسل. تمييع اثنين من microliters من الأجسام المضادة أحادية النسيلة الماوس ضد 8-هيدروكسيدوكسيجوانوزين واثنين من microliters من الأجسام المضادة متعددة النسيلة أرنب ضد غاما-H2AX في 296 ميكرولتر من PBST للحصول على حل كوكتيل الأجسام المضادة الأولية العاملة.احتضان عينات القلب مع 50 ميكرولتر من محلول كوكتيل الأجسام المضادة الأولية في غرفة رطبة لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. decant الحل وغسل العينات ثلاث مرات مع PBST لمدة خمس دقائق لكل غسل. تمييع واحد microliter من FITC المسمى الماعز المضادة للفأرة الأجسام المضادة الثانوية وmicroliter واحد من الماعز psy-3 المضادة للأرانب الأجسام المضادة الثانوية في 500 ميكرولتر من PBST للحصول على حل كوكتيل الأجسام المضادة الثانوية العاملة.احتضان العينات مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. decant الحل وغسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق لكل غسل. إضافة 20 ميكرولتر من DAPI إلى عينات للتلطيخ النووي، واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.ضعي زلة غطاء على الشريحة واغلقيها بطلاء الأظافر لمنع التجفيف والحركة. صورة العينات تحت المجهر الفلوري وتحديد إشارة الفلورسنت لمنطقة القلب باستخدام برنامج ImageJ. حساب التغييرات النسبية باستخدام متوسط نماذج التحكم DMSO وتحديد الأهمية الإحصائية للبيانات.تم تقييم الأجنة المعرضة لPM 2.5 في غياب أو وجود مضادات الأكسدة، N-أسيتيل-L-السيستين، أو NAC، لوجود تشوهات في القلب. EOM من PM 2.5 تكلف زيادة كبيرة في تكوين المسخيات القلبية، مثل وذمة التامور، وتغيير الحلقات وانخفاض الحجم، مقارنة مع قلوب المعالجة DMSO السيطرة. كما انخفض معدل ضربات القلب بشكل كبير في الأجنة المعرضة ل EOM.إضافة NAC مخففة عيوب القلب الناجمة عن EOM. تم استخدام فحص الفلورة المناعية لتقييم مدى تلف الحمض النووي في الأنسجة المعالجة بالحمض النووي EOM. تم زيادة مستويات التعبير 8-hydroxydeoxyguanosine و gamma-H2AX بشكل كبير في قلوب أجنة حمار وحشي تعامل مع EOM، مما يشير إلى زيادة في تلف الحمض النووي التأكسدي وفواصل حبلا مزدوجة الحمض النووي، على التوالي.تم التصدي جزئيا للضرر الحمض النووي الناجم عن EOM عن طريق مكملات NAC. عند محاولة هذا البروتوكول، يجب الحرص عند غسل العينات باستخدام برنامج تلفزيوني، لأن قلب الحمار الوحشي قد يقشر الشريحة.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

تحليل التنمية Cardiomyocyte باستخدام المناعي في القلب الجنينية الماوس

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microbead زرع الأجنة الزرد

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

تعظيم الاستفادة من الفحص الجرح خدش للكشف عن تغيرات في الفئران الوسيطة اللحمية الهجرة الخلية بعد الأضرار التي كتبها القابلة للذوبان استخراج دخان السجائر

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

التصوير الهياكل التحت خلوية في الأجنة الحية اسماك الزرد

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

مراقبة قسم الميتوزى وديناميكية في الأجنة الزرد لايف

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

تحليل الأوعية التاجية في قلوب الجنينية مسح

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

استخدام إيمونولابيلينج لتحليل Microtubules مستقرة ودينامية، والوليدة في الجنين الزرد

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

فؤاد وميكرورهيولوجي في الخلية صفار الجنين الزرد

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

حركات للوفلر الأنسجة التالية عن طريق فوتوكونفيرسيون خلية في الجنين الزرد

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

نقل الاجنه طفيف التوغل والتزجيج الجنيني في مرحله الجنين الأمثل في نموذج الأرنب

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...