Name: using immunofluorescence to detect pm2.5-induced dna damage in zebrafish embryo hearts
Uploaded: 2021-02-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Nature Sciences Foundation of China (Grant nummer: 81870239, 81741005, 81972999) og The Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.

Vilde type zebrafisk (AB), der anvendes i denne undersøgelse blev opnået fra National Zebrafish Resource Center i Wuhan, Kina. Alle dyreprocedurer, der er skitseret her, er blevet gennemgået og godkendt af Animal Care Institution of The Ethics Committee of Soochow University.
1. PM2,5 prøveudtagning og organisk forbindelsesudvinding
BEMÆRK: PM2.5 blev indsamlet i et byområde i Suzhou, Kina, August 1-7, 2015, som beskrevet tidligere<sup clas...

<ol>
	<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Exposure+to+Air+Pollution+and+Risk+of+Congenital+Heart+Defects.">Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects.</a> European Journal of Pediatrics. 175, 1520 (2016).</li><li>Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+exposure+to+PM2.5+and+Congenital+Heart+Diseases+in+Taiwan.">Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan.</a> The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).</li><li>Mesquita, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+assessment+of+urban+atmospheric+particle-bound+PAHs:+relevance+of+composition+and+particle+size+in+Barcelona+(Spain).">Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain).</a> Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+AhR+and+wnt/beta-catenin+signal+pathways+in+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos.">Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).</li><li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-organ+toxicity+induced+by+fine+particulate+matter+PM2.5+in+zebrafish+(Danio+rerio)+model.">Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model.</a> Chemosphere. 180, 24-32 (2017).</li><li>Lorda-Diez, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+senescence,+apoptosis+and+DNA+damage+cooperate+in+the+remodeling+processes+accounting+for+heart+morphogenesis.">Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis.</a> Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).</li><li>Kouassi, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+induced+in+A549+cells+by+physically+and+chemically+characterized+air+particulate+matter+(PM2.5)+collected+in+Abidjan,+Cote+d'Ivoire.">Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire.</a> Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).</li><li>Gualtieri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+A549+cells+exposed+to+Milan+PM2.5.">Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5.</a> Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).</li><li>Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+glycation+endproduct+induces+ROS+accumulation,+apoptosis,+MAP+kinase+activation+and+nuclear+O-GlcNAcylation+in+human+cardiac+myocytes.">Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes.</a> Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).</li><li>Yamashita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+zebrafish+development.">Apoptosis in zebrafish development.</a> Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry &amp; Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).</li><li>Moazzen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acetylcysteine+prevents+congenital+heart+defects+induced+by+pregestational+diabetes.">N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes.</a> Cardiovascular Diabetology. 13, 46 (2014).</li><li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetylcysteine,+reactive+oxygen+species+and+beyond.">N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 9, 109-110 (2010).</li><li>Tu, S., Chi, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+in+cardiac+development+and+congenital+heart+birth+defects.">Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects.</a> Differentiation. 84, 4-16 (2012).</li><li>Asnani, A., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+tool+to+identify+novel+therapies+for+human+cardiovascular+disease.">The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7, 763-767 (2014).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+effects+of+polychlorinated+biphenyls+on+cardiac+development+in+zebrafish.">Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish.</a> Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).</li><li>Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+particulate+matter+from+cigarette+smoke+disrupts+vascular+development+in+zebrafish+brain+(Danio+rerio).">Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio).</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).</li><li>Ren, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AHR-mediated+ROS+production+contributes+to+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos.">AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> The Science of the Total Environment. 719, 135097 (2020).</li><li>van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+consensus+on+cardiac+regeneration.">An emerging consensus on cardiac regeneration.</a> Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).</li><li>Yue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+folic+acid+on+PM2.5-induced+cardiac+developmental+toxicity+in+zebrafish+embryos+by+targeting+AhR+and+Wnt/beta-catenin+signal+pathways.">Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways.</a> Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).</li><li>Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+nanoparticles+induce+oxidative+DNA+damage+and+ROS-triggered+mitochondria-mediated+apoptosis+in+zebrafish+embryos.">Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos.</a> Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).</li><li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity,+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish.">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+effects+on+glutathione-S-transferase+activity+induced+by+atrazine+exposure+in+zebrafish+(Danio+rerio).">DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).</li></ol>

Selvom zebrafisk er en fremragende hvirveldyrmodel til undersøgelse af hjerteudviklingsmæssig toksicitet af miljøkemikalier på grund af embryohjertets lille størrelse, er det svært at opnå nok protein til vestlig blotanalyse. Derfor præsenterer vi en følsom immunfluorescencemetode til kvantificering af proteinudtryksniveauerne af DNA-skader biomarkører i hjerterne på zebrafiskembryoner, der udsættes for PM2,5.
Under dissektion er det vigtigt at holde hjertets integritet ...

Luftforurening er nu et alvorligt miljøproblem, som verden står over for. Omgivende fine partikler (PM2.5), som er en af de vigtigste indikatorer for luftkvaliteten, kan bære et stort antal skadelige stoffer og komme ind i blodcirkulationssystemet, hvilket forårsager alvorlig skade på menneskers sundhed1. Epidemiologiske undersøgelser har vist , at PM2,5-eksponering kan føre til en øget risiko for medfødte hjertefejl (CHD'er)2,3. Beviser fra dyreforsøg viste også, at PM2,5 kan forårsage unormal hjerteudvikling i zebrafisk embryoner og afkom afmus,men de molekylære mekanismer i hjerteudviklingsmæssige toksicitet PM2,5 er stadig stort set ukendt4,5,6.
DNA-skader kan forårsage cellecyklus anholdelse og fremkalde apoptose, som i vid udstrækning kan ødelægge potentialet i stamcelleceller og dermed forringe hjerteudviklingen7). Det er veldokumenteret, at miljøforurenende stoffer, herunder PM2,5, har potentiale til at angribe DNA gennem oxidative stressmekanismer8,9. Både human og zebrafisk hjerte udvikling er følsomme over for oxidativ stress10,11,12. 8-OHdG er en oxidativ DNA-skadesmarkør, og γH2AX-signal er en markør for DNA-dobbeltstrengsbrud. N-acetyl-L-Cystein (NAC), en syntetisk forløber for intracellulær cystein og glutathion, er meget udbredt som en anti-oxidativ forbindelse. I denne undersøgelse bruger vi NAC til at undersøge den rolle, oxidativ stress i PM2.5- induceret DNA-skade13.
Zebrafisk som model hvirveldyr har været meget udbredt til at studere hjerteudvikling og menneskelige hjerte-kar-sygdomme, fordi mekanismerne i hjerteudvikling er meget bevaret blandt hvirveldyr14,15. Fordelene ved at bruge zebrafisk som model omfatter deres lille størrelse, stærke reproduktive evne og lave fodringsomkostninger. Af særlig interesse for disse undersøgelser er zebrafiskembryoner ikke afhængige af kredsløbssystemet under tidlig udvikling og kan overleve alvorlig hjertemisdannelse14. Desuden gør deres gennemsigtighed det muligt for hele kroppen at blive observeret direkte under et mikroskop. Zebrafiskembryoner giver således en enestående mulighed for at vurdere de molekylære mekanismer, der er involveret i induktion af hjerteudviklingsmæssig toksicitet som følge af eksponering for forskellige miljøkemikalier5,16,17. Vi har tidligere rapporteret, at PM2,5-induceret oxidativ stress fører til DNA-skader og apoptose, hvilket resulterer i hjertemisdannelser hos zebrafisk18. I denne undersøgelse giver vi en detaljeret protokol til undersøgelse af PM2,5-induceret DNA-skade i hjertet af zebrafisk embryoner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-OHdG Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, USA</td>
			<td>sc-66036</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorius,China</td>
			<td>BSA124S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Solarbio,Beijing,China</td>
			<td>SW3015</td>
			<td>For blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam, USA</td>
			<td>ab104139</td>
			<td>For nuclear counterstain.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Solarbio,Beijing,China</td>
			<td>D8371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>IX73</td>
			<td>For imaging fluorescence signals/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG Cy3</td>
			<td>Carlsbad,USA</td>
			<td>CW0159</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG FITC</td>
			<td>Carlsbad,USA</td>
			<td>RS0003</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine(NAC)</td>
			<td>Adamas-Beta, Shanghai, China</td>
			<td>616-91-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>QILINBEIER,China</td>
			<td>TS-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma,China</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Make 4% paraformaldehyde for fixation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>HyClone,USA</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>Prepare 0.1% Tween in PBS for washing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM2.5 sampler</td>
			<td>TianHong,Wuhan, China</td>
			<td>TH-150C</td>
			<td>For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Re-circulating aquaculture system</td>
			<td>HaiSheng,Shanghai,China</td>
			<td></td>
			<td>The zebrafish was maintained in it.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soxhlet extractor</td>
			<td>ZhengQiao,Shanghai, China</td>
			<td>BSXT-02</td>
			<td>For organic components extraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon,Canada</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td>For heart dissection from zebrafish embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (MS222)</td>
			<td>Sigma,China</td>
			<td>E10521</td>
			<td>To anesthetize zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma,China</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;H2AX Antibody</td>
			<td>Abcam, USA</td>
			<td>ab26350</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using immunofluorescence to detect pm2.5-induced dna damage in zebrafish embryo hearts

Omgivende fine partikler (PM2.5)eksponering kan føre til hjerteudviklingstoksicitet, men de underliggende molekylære mekanismer er stadig uklare. 8-hydroxy-2'deoxygenase (8-OHdG) er en markør for oxidativ DNA-skade og γH2AX er en følsom markør for DNA dobbelt streng pauser. I denne undersøgelse, vi havde til formål at opdage PM2,5-induceret 8-OHdG og γH2AX ændringer i hjertet af zebrafisk embryoner ved hjælp af en immunofluorescence assay. Zebrafiskembryoner blev behandlet med ekstraherbare organiske forhold (EOM) fra PM2,5 ved 5 μg/ml i nærvær eller fravær af antioxidant N-acetyl-L-Cystein (NAC, 0,25 μM) ved 2 timer efter befrugtning (hpf). DMSO blev brugt som en køretøjskontrol. Ved 72 hk blev hjerter dissekeret fra embryoner ved hjælp af en sprøjtenål og fastgjort og permeabiliseret. Efter at være blevet blokeret blev prøverne undersøgt med primære antistoffer mod 8-OHdG og γH2AX. Prøverne blev derefter vasket og inkuberet med sekundære antistoffer. De resulterende billeder blev observeret under fluorescensmikroskopi og kvantificeret ved hjælp af ImageJ. Resultaterne viser, at EOM fra PM2,5 signifikant forbedrede 8-OHdG- og γH2AX-signaler i hjertet af zebrafiskembryoner. Nac, der fungerede som en reaktiv iltart (ROS) ådselæder, modvirkede imidlertid delvist den EOM-inducerede DNA-skade. Her præsenterer vi en immunfluorescence protokol til undersøgelse af dna-skadernes rolle i PM2,5-inducerede hjertefejl, der kan anvendes til påvisning af miljømæssige kemisk inducerede proteinudtryksændringer i zebrafiskembryoners hjerter.

Denne immunofluorescence assay er en følsom og specifik metode til måling af protein udtryk ændringer i hjerter zebrafisk embryoner udsat for miljømæssige kemikalier.
I denne repræsentative analyse blev embryoner, der blev udsat for PM2,5 i antioxidantens fravær eller tilstedeværelse, evalueret for tilstedeværelsen af hjertemisdannelser (Figur 1). Som observeret forårsagede EOM ...

Watch this Scientific Journal Video about Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts at JoVE.com

Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts

Denne protokol bruger en immunofluorescence assay til at opdage PM2,5-induceretDNA-skader i dissekeret hjerter zebrafisk embryoner.

Brug af immunofluorescence til at opdage PM2,5-induceret DNA-skade i Zebrafish Embryo Hearts

Ambient fine particulate matter (PM2.5) exposure can lead to cardiac developmental toxicity but the underlying molecular mechanisms are still unclear. ...

Denne metode kan bruges til præcist og nemt at opdage udtrykket af målproteiner i zebrafiskehjertet. Ændringen i målproteinet opdages direkte ved måling af immunofluorescence. Udfør zebrafisk embryo indsamling og behandling, som beskrevet i teksten manuskript.Ved 72 timer efter befrugtning overføres embryonerne til glasrutschebaner og observerer dem under et stereomikroskop. Optag hjertemisdannelser, såsom perikardieødem, ændret looping og nedsat størrelse. Beregn misdannelser, og analysér forskelle mellem grupper ved hjælp af envejs ANOVA efterfulgt af Tyrkiets multiple comparison-test.Efter bedøvelse af embryonerne med 0,6 milligram pr. milliliter MS222, registrere hjerteslag i 30 sekunder, og kvantificere hjertefrekvenser ved hjælp af Image J software. Disseker forsigtigt hjerter fra zebrafiskembryoner med en engangssprøjtenål under et stereomikroskop. Brug en hydrofob barriere pen til at tegne en cirkel på en ren glas slide.Tilsæt 50 mikroliter af 4% paraformaldehyd til 1,25 mikroliter PBS for at lave en fiksativ opløsning, læg derefter tre dissekerede hjerter i en hydrofob barrierecirkel og inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur. Opløsningen dekanter under mikroskopet, og prøverne tørres ved stuetemperatur i mindst fem minutter. Vask diasene tre gange i PBST i fem minutter pr. vask.Tilsæt 50 mikroliter BSA til 1.000 mikroliter PBST for at opnå en 5% BSA-opløsning, og inkuber diasene i et fugtigt kammer i en time for at blokere ikke-specifik antistofbinding. Opløsningen dekanter og vask prøverne tre gange med PBS i fem minutter pr. vask. Fortynd to mikroliter af mus monoklonale antistof mod 8-hydroxydeoxyguanosin og to mikroliter af kanin polyklonale antistof mod gamma-H2AX i 296 mikroliters af PBST at opnå en fungerende primær antistof cocktail løsning.Inkuber hjerteprøverne med 50 mikroliter af den primære antistofcocktailopløsning i et befugtet kammer i mindst en time ved stuetemperatur eller natten over ved fire grader Celsius. Opløsningen dekanter og vaskes prøverne tre gange med PBST i fem minutter pr. vask. Fortynd en mikroliter af FITC-mærket ged anti-mus sekundært antistof og en mikroliter af psy-3 ged anti-kanin sekundært antistof i 500 mikroliters af PBST at opnå en fungerende sekundær antistof cocktail løsning.Inkuber prøverne med de sekundære antistoffer i en time ved stuetemperatur i mørke. Opløsningen dekanter og vask prøverne tre gange med PBS i fem minutter pr. vask. Tilsæt 20 mikroliter AF DAPI til prøverne til nuklear farvning, og inkuber dem i 30 minutter ved stuetemperatur.Påfør et dæksel slip til diaset og forsegle det med neglelak for at forhindre tørring og bevægelse. Billede prøverne under et fluorescensmikroskop og kvantificere det fluorescerende signal i hjerteområdet ved hjælp af ImageJ-software. Beregn de relative ændringer ved hjælp af gennemsnittet af DMSO-kontrolprøverne, og bestem dataenes statistiske betydning.Embryoner, der blev udsat for PM 2,5 i mangel eller tilstedeværelse af antioxidanten, N-acetyl-L-cystein eller NAC, blev evalueret for tilstedeværelsen af hjertemisdannelser. EOM fra PM 2,5 kostede en betydelig stigning i hjerte teratogenese, såsom perikardieødem, ændret looping og nedsat størrelse, sammenlignet med DMSO-kontrol behandlede hjerter. Pulsen blev også signifikant nedsat i embryoner, der blev eksponeret for EOM.Tilsætning af NAC svækkede EOM-inducerede hjertefejl. Der blev anvendt en immunfluorescenceanalyse til at vurdere omfanget af DNA-skader i EOM-behandlet væv. Niveauerne af 8-hydroxydeoxyguanosin og gamma-H2AX udtryk blev signifikant øget i hjerterne på zebrafisk embryoner behandlet med EOM, hvilket indikerer en stigning i oxidative DNA-skader og DNA dobbelt streng pauser, henholdsvis.Den EOM-inducerede DNA-skade blev delvist modvirket af NAC-tilskud. Når du forsøger denne protokol, skal du passe på, når du vasker prøverne med PBS, fordi zebrafiskehjertet kan skrælle diaset af.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse af Cardiomyocyte Development hjælp Immunofluorescens i embryonale Mouse Hjerte

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Mikroperle Implantation i Zebrafisk Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Optimering af såret Scratch-analysen til at påvise ændringer i murine Mesenchymale stromacelle Migration efter skade ved Opløselig Cigaret røgekstrakt

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging Subcellulære Strukturer i Living Zebrafisk Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Observation Mitotisk Division og Dynamics i en Live zebrafisk Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Analyse af koronarkar i Cleared Embryonale hjerter

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Brug af Immunolabeling til at analysere stabil, dynamisk og vordende mikrotubuli i zebrafisk Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM og Microrheology i cellen zebrafisk Embryo æggeblomme

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Følgende endokardial væv bevægelser via celle Photoconversion i zebrafisk Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Minimalt invasivt Embryo Transfer og embryo Vitrificering på det optimale embryo stadie i kanin model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...