Name: using immunofluorescence to detect pm2.5-induced dna damage in zebrafish embryo hearts
Uploaded: 2021-02-15T13:00:00
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Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences de la nature de Chine (numéro de subvention: 81870239, 81741005, 81972999) et le développement du programme académique prioritaire des établissements d’enseignement supérieur du Jiangsu.

Le poisson-zèbre de type sauvage (AB) utilisé dans cette étude a été obtenu auprès du National Zebrafish Resource Center de Wuhan, en Chine. Toutes les procédures animales décrites ici ont été examinées et approuvées par l’Établissement de soins aux animaux du Comité d’éthique de l’Université Soochow.
1. Échantillonnage des PM2,5 et extraction des composés organiques
REMARQUE : Les PM2,5 ont été collectées dans une zone...

<ol>
	<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Exposure+to+Air+Pollution+and+Risk+of+Congenital+Heart+Defects.">Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects.</a> European Journal of Pediatrics. 175, 1520 (2016).</li><li>Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+exposure+to+PM2.5+and+Congenital+Heart+Diseases+in+Taiwan.">Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan.</a> The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).</li><li>Mesquita, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+assessment+of+urban+atmospheric+particle-bound+PAHs:+relevance+of+composition+and+particle+size+in+Barcelona+(Spain).">Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain).</a> Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+AhR+and+wnt/beta-catenin+signal+pathways+in+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos.">Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).</li><li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-organ+toxicity+induced+by+fine+particulate+matter+PM2.5+in+zebrafish+(Danio+rerio)+model.">Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model.</a> Chemosphere. 180, 24-32 (2017).</li><li>Lorda-Diez, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+senescence,+apoptosis+and+DNA+damage+cooperate+in+the+remodeling+processes+accounting+for+heart+morphogenesis.">Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis.</a> Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).</li><li>Kouassi, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+induced+in+A549+cells+by+physically+and+chemically+characterized+air+particulate+matter+(PM2.5)+collected+in+Abidjan,+Cote+d'Ivoire.">Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire.</a> Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).</li><li>Gualtieri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+A549+cells+exposed+to+Milan+PM2.5.">Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5.</a> Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).</li><li>Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+glycation+endproduct+induces+ROS+accumulation,+apoptosis,+MAP+kinase+activation+and+nuclear+O-GlcNAcylation+in+human+cardiac+myocytes.">Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes.</a> Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).</li><li>Yamashita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+zebrafish+development.">Apoptosis in zebrafish development.</a> Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry &amp; Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).</li><li>Moazzen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acetylcysteine+prevents+congenital+heart+defects+induced+by+pregestational+diabetes.">N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes.</a> Cardiovascular Diabetology. 13, 46 (2014).</li><li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetylcysteine,+reactive+oxygen+species+and+beyond.">N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 9, 109-110 (2010).</li><li>Tu, S., Chi, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+in+cardiac+development+and+congenital+heart+birth+defects.">Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects.</a> Differentiation. 84, 4-16 (2012).</li><li>Asnani, A., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+tool+to+identify+novel+therapies+for+human+cardiovascular+disease.">The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7, 763-767 (2014).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+effects+of+polychlorinated+biphenyls+on+cardiac+development+in+zebrafish.">Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish.</a> Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).</li><li>Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+particulate+matter+from+cigarette+smoke+disrupts+vascular+development+in+zebrafish+brain+(Danio+rerio).">Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio).</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).</li><li>Ren, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AHR-mediated+ROS+production+contributes+to+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos.">AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> The Science of the Total Environment. 719, 135097 (2020).</li><li>van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+consensus+on+cardiac+regeneration.">An emerging consensus on cardiac regeneration.</a> Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).</li><li>Yue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+folic+acid+on+PM2.5-induced+cardiac+developmental+toxicity+in+zebrafish+embryos+by+targeting+AhR+and+Wnt/beta-catenin+signal+pathways.">Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways.</a> Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).</li><li>Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+nanoparticles+induce+oxidative+DNA+damage+and+ROS-triggered+mitochondria-mediated+apoptosis+in+zebrafish+embryos.">Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos.</a> Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).</li><li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity,+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish.">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+effects+on+glutathione-S-transferase+activity+induced+by+atrazine+exposure+in+zebrafish+(Danio+rerio).">DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).</li></ol>

Bien que le poisson-zèbre soit un excellent modèle de vertébrés pour étudier la toxicité pour le développement cardiaque des produits chimiques environnementaux, en raison de la petite taille du cœur embryonnaire, il est difficile d’obtenir suffisamment de protéines pour l’analyse par transfert de Western. Par conséquent, nous présentons une méthode d’immunofluorescence sensible pour quantifier les niveaux d’expression protéique des biomarqueurs de dommages à l’ADN dans le cœur des embryons de po...

La pollution de l’air est aujourd’hui un grave problème environnemental auquel le monde est confronté. Les particules fines ambiantes (PM2,5),qui sont l’un des indicateurs les plus importants de la qualité de l’air, peuvent transporter un grand nombre de substances nocives et pénétrer dans le système circulatoire sanguin, causant de graves dommages à la santé humaine1. Des études épidémiologiques ont démontré que l’exposition aux PM2,5 peut entraîner un risque accru de malformations cardiaques congénitales (CHD)2,3. Les preuves provenant d’expériences animales ont également montré que les PM2,5 peuvent provoquer un développement cardiaque anormal chez les embryons de poisson-zèbre et la progéniture de souris, mais les mécanismes moléculaires de la toxicité pour le développement cardiaque des PM2,5 sont encore largement inconnus4,5,6.
Les dommages à l’ADN peuvent provoquer l’arrêt du cycle cellulaire et induire l’apoptose, ce qui peut détruire considérablement le potentiel des cellules progénitaires et, par conséquent, nuire au développement cardiaque7). Il a été bien documenté que les polluants environnementaux, y compris les PM2,5,ont le potentiel d’attaquer l’ADN par des mécanismes de stress oxydatif8,9. Le développement cardiaque humain et le poisson-zèbre sont sensibles au stress oxydatif10,11,12. Le 8-OHdG est un marqueur oxydatif de dommages à l’ADN, et le signal γH2AX est un marqueur des cassures double brin de l’ADN. La N-acétyl-L-cystéine (NAC), un précurseur synthétique de la cystéine intracellulaire et du glutathion, est largement utilisée comme composé antioxydant. Dans cette étude, nous utilisons le NAC pour étudier le rôle du stress oxydatif dans les dommages à l’ADN induits par les PM2,513.
Le poisson-zèbre en tant que vertébré modèle a été largement utilisé pour étudier le développement cardiaque et les maladies cardiovasculaires humaines, car les mécanismes du développement cardiaque sont très conservés chez les vertébrés14,15. Les avantages de l’utilisation du poisson-zèbre comme modèle comprennent leur petite taille, leur forte capacité de reproduction et leur faible coût d’alimentation. D’un intérêt particulier pour ces études, les embryons de poisson zèbre ne dépendent pas du système circulatoire au cours du développement précoce et peuvent survivre à une malformation cardiaque grave14. De plus, leur transparence permet d’observer directement l’ensemble du corps au microscope. Ainsi, les embryons de poisson zèbre offrent une occasion exceptionnelle d’évaluer les mécanismes moléculaires impliqués dans l’induction de la toxicité pour le développement cardiaque à la suite de l’exposition à divers produits chimiquesenvironnementaux 5,16,17. Nous avons précédemment rapporté que le stress oxydatif induit par les PM2,5entraîne des dommages à l’ADN et l’apoptose, entraînant des malformations cardiaques chez le poisson-zèbre18. Dans cette étude, nous fournissons un protocole détaillé pour étudier les dommages à l’ADN induits par les PM2,5dans le cœur des embryons de poisson-zèbre.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-OHdG Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, USA</td>
			<td>sc-66036</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorius,China</td>
			<td>BSA124S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Solarbio,Beijing,China</td>
			<td>SW3015</td>
			<td>For blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam, USA</td>
			<td>ab104139</td>
			<td>For nuclear counterstain.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Solarbio,Beijing,China</td>
			<td>D8371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>IX73</td>
			<td>For imaging fluorescence signals/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG Cy3</td>
			<td>Carlsbad,USA</td>
			<td>CW0159</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG FITC</td>
			<td>Carlsbad,USA</td>
			<td>RS0003</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine(NAC)</td>
			<td>Adamas-Beta, Shanghai, China</td>
			<td>616-91-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>QILINBEIER,China</td>
			<td>TS-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma,China</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Make 4% paraformaldehyde for fixation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>HyClone,USA</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>Prepare 0.1% Tween in PBS for washing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM2.5 sampler</td>
			<td>TianHong,Wuhan, China</td>
			<td>TH-150C</td>
			<td>For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Re-circulating aquaculture system</td>
			<td>HaiSheng,Shanghai,China</td>
			<td></td>
			<td>The zebrafish was maintained in it.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soxhlet extractor</td>
			<td>ZhengQiao,Shanghai, China</td>
			<td>BSXT-02</td>
			<td>For organic components extraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon,Canada</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td>For heart dissection from zebrafish embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (MS222)</td>
			<td>Sigma,China</td>
			<td>E10521</td>
			<td>To anesthetize zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma,China</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;H2AX Antibody</td>
			<td>Abcam, USA</td>
			<td>ab26350</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using immunofluorescence to detect pm2.5-induced dna damage in zebrafish embryo hearts

L’exposition aux particules fines ambiantes (PM2,5)peut entraîner une toxicité pour le développement cardiaque, mais les mécanismes moléculaires sous-jacents ne sont pas encore clairs. La 8-hydroxy-2'désoxygénase (8-OHdG) est un marqueur des dommages oxydatifs à l’ADN et γH2AX est un marqueur sensible pour les cassures double brin de l’ADN. Dans cette étude, nous avons cherché à détecter les changements 8-OHdG etγH2AXinduits par les PM 2,5 au cœur des embryons de poisson-zèbre à l’aide d’un test d’immunofluorescence. Les embryons de poisson-zèbre ont été traités avec des matières organiques extractibles (EOM) de PM2,5 à 5 μg/mL en présence ou en l’absence d’antioxydant n-acétyl-L-cystéine (NAC, 0,25 μM) à 2 h après la fécondation (HPF). Le DMSO a été utilisé comme contrôle du véhicule. À 72 hpf, les cœurs ont été disséqués à partir d’embryons à l’aide d’une aiguille de seringue et fixés et perméabilisés. Après avoir été bloqués, les échantillons ont été sondés avec des anticorps primaires contre le 8-OHdG et l’γH2AX. Les échantillons ont ensuite été lavés et incubés avec des anticorps secondaires. Les images résultantes ont été observées en microscopie à fluorescence et quantifiées à l’aide d’ImageJ. Les résultats montrent que la MOE des PM2,5 a significativement amélioré les signaux 8-OHdG et γH2AX au cœur des embryons de poissons-zèbres. Cependant, le NAC, agissant comme un piégeur d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), a partiellement contrecarré les dommages à l’ADN induits par la MOE. Ici, nous présentons un protocole d’immunofluorescence pour étudier le rôle des dommages à l’ADN dans les malformations cardiaques induites par les PM2,5qui peuvent être appliqués à la détection des changements d’expression protéique induits par des produits chimiques environnementaux dans le cœur des embryons de poisson-zèbre.

Ce test d’immunofluorescence est une méthode sensible et spécifique pour mesurer les changements d’expression des protéines dans le cœur des embryons de poisson-zèbre exposés à des produits chimiques environnementaux.
Dans cette analyse représentative, les embryons exposés aux PM2,5 en l’absence ou en présence de l’antioxydant NAC ont été évalués pour la présence de malformations cardiaques (<st...

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Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts

Ce protocole utilise un test d’immunofluorescence pour détecter les dommages à l’ADN induits par les PM2,5dans les cœurs disséqués des embryons de poisson-zèbre.

Utilisation de l’immunofluorescence pour détecter les dommages à l’ADN induits par les PM2,5dans les cœurs embryonnaires de poisson-zèbre

Ambient fine particulate matter (PM2.5) exposure can lead to cardiac developmental toxicity but the underlying molecular mechanisms are still unclear. ...

Cette méthode peut être utilisée pour détecter avec précision et facilité l’expression des protéines cibles dans le cœur du poisson-zèbre. Le changement dans la protéine cible est directement détecté en mesurant l’immunofluorescence. Effectuer la collecte et le traitement d’embryons de poisson-zèbre, comme décrit dans le manuscrit du texte.72 heures après la fécondation, transférez les embryons sur des lames de verre et observez-les au stéréomicroscope. Enregistrez les malformations cardiaques, telles que l’œdème péricardique, l’altération de la boucle et la diminution de la taille. Calculer les taux de malformation et analyser les différences entre les groupes en utilisant l’ANOVA à sens unique, suivie du test de comparaison multiple de la Turquie.Après avoir anesthésique les embryons avec 0,6 milligramme par millilitre MS222, enregistrez les battements cardiaques pendant 30 secondes et quantifiez les fréquences cardiaques à l’aide du logiciel Image J. Disséquez soigneusement les cœurs des embryons de poisson zèbre avec une aiguille de seringue jetable sous un stéréomicroscope. Utilisez un stylo barrière hydrophobe pour dessiner un cercle sur une glissière en verre propre.Ajouter 50 microlitres de paraformaldéhyde à 4% à 1,25 microlitres de PBS pour obtenir une solution fixative, puis placer trois cœurs disséqués dans un cercle barrière hydrophobe et incuber pendant 20 minutes à température ambiante. Décantez la solution au microscope et séchez les échantillons à température ambiante pendant au moins cinq minutes. Lavez les lames trois fois dans PBST pendant cinq minutes par lavage.Ajouter 50 microlitres de BSA à 1 000 microlitres de PBST pour obtenir une solution de BSA à 5 % et incuber les lames dans une chambre humide pendant une heure pour bloquer la liaison aux anticorps non spécifiques. Décantez la solution et lavez les échantillons trois fois avec du PBS pendant cinq minutes par lavage. Diluer deux microlitres d’anticorps monoclonaux de souris contre la 8-hydroxydésoxyguanosine et deux microlitres d’anticorps polyclonaux de lapin contre le gamma-H2AX dans 296 microlitres de PBST pour obtenir une solution cocktail d’anticorps primaires fonctionnelle.Incuber les échantillons cardiaques avec 50 microlitres de la solution primaire de cocktail d’anticorps dans une chambre humidifiée pendant au moins une heure à température ambiante ou pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Décantez la solution et lavez les échantillons trois fois avec du PBST pendant cinq minutes par lavage. Diluer un microlitre d’anticorps secondaire anti-souris de chèvre marqué fitC et un microlitre d’anticorps secondaire anti-lapin de chèvre psy-3 dans 500 microlitres de PBST pour obtenir une solution de cocktail d’anticorps secondaires fonctionnelle.Incuber les échantillons avec les anticorps secondaires pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité. Décantez la solution et lavez les échantillons trois fois avec du PBS pendant cinq minutes par lavage. Ajouter 20 microlitres de DAPI aux échantillons pour la coloration nucléaire et les incuber pendant 30 minutes à température ambiante.Appliquez un couvercle sur la glissière et scellez-la avec du vernis à ongles pour éviter le séchage et le mouvement. Imagez les échantillons sous un microscope à fluorescence et quantifiez le signal fluorescent de la région cardiaque à l’aide du logiciel ImageJ. Calculer les changements relatifs à l’aide de la moyenne des échantillons témoins du DMSO et déterminer la signification statistique des données.Les embryons exposés aux PM 2,5 en l’absence ou en présence de l’antioxydant, la N-acétyl-L-cystéine, ou NAC, ont été évalués pour la présence de malformations cardiaques. L’EOM des PM 2,5 a coûté une augmentation significative de la tératogenèse cardiaque, telle qu’un œdème péricardique, une altération de la boucle et une diminution de la taille, par rapport aux cœurs traités par DMSO. La fréquence cardiaque a également été significativement diminuée chez les embryons exposés à l’EOM.Ajout de malformations cardiaques atténuées par EOM atténuées par le CNA. Un test d’immunofluorescence a été utilisé pour évaluer l’étendue des dommages à l’ADN dans les tissus traités par EOM. Les niveaux d’expression de 8-hydroxydésoxyguanosine et de gamma-H2AX ont été significativement augmentés dans le cœur des embryons de poisson-zèbre traités par EOM, indiquant une augmentation des dommages oxydatifs à l’ADN et des cassures double brin de l’ADN, respectivement.Les dommages à l’ADN induits par la MOE ont été partiellement contrecarrés par la supplémentation en NAC. Lorsque vous essayez ce protocole, faites attention lorsque vous lavez les échantillons avec du PBS, car le cœur du poisson-zèbre peut se décoller de la glissière.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse du développement des cardiomyocytes par immunofluorescence dans le Coeur embryonnaires de souris

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Recherche

Biologie du développement

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microbead implantation dans l&#39;embryon de poisson zèbre

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Optimisation du dosage Blessure Scratch pour détecter les changements dans murin mésenchymateuses stromales migration cellulaire Après Dommages par Soluble Extrait Cigarette Smoke

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imagerie Structures subcellulaires dans le Embryo Living Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

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Observer Division et dynamique mitotique dans un embryon de poisson zèbre en direct

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Analyse des vaisseaux coronaires dans Coeurs embryonnaires Effacé

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Utilisation d’immunomarquage pour analyser des Microtubules stables et dynamiques naissants dans l’embryon de poisson zèbre

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM et microrhéologie dans la cellule de jaune de œuf embryon de poisson zèbre

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Mouvements de tissu endocardique suivant via Photoconversion de cellules dans l’embryon de poisson zèbre

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Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Transfert d’embryon et vitrification d’embryons au stade optimal de l’embryon dans le modèle Rabbit

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...