Name: using immunofluorescence to detect pm2.5-induced dna damage in zebrafish embryo hearts
Uploaded: 2021-02-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts at JoVE.com

इस काम को नेशनल नेचर साइंसेज फाउंडेशन ऑफ चाइना (ग्रांट नंबर: 81870239, 81741005, 81972999) और जियांग्सू उच्च शिक्षा संस्थानों की प्राथमिकता अकादमिक कार्यक्रम विकास द्वारा समर्थित किया गया था ।

इस अध्ययन में इस्तेमाल किए जाने वाले वाइल्ड टाइप जेब्राफिश (एबी) को चीन के वुहान में नेशनल जेब्राफिश रिसोर्स सेंटर से प्राप्त किया गया था । यहां उल्लिखित सभी पशु प्रक्रियाओं की समीक्षा की गई है और Soochow व?...

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	<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Exposure+to+Air+Pollution+and+Risk+of+Congenital+Heart+Defects.">Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects.</a> European Journal of Pediatrics. 175, 1520 (2016).</li><li>Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+exposure+to+PM2.5+and+Congenital+Heart+Diseases+in+Taiwan.">Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan.</a> The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).</li><li>Mesquita, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+assessment+of+urban+atmospheric+particle-bound+PAHs:+relevance+of+composition+and+particle+size+in+Barcelona+(Spain).">Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain).</a> Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+AhR+and+wnt/beta-catenin+signal+pathways+in+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos.">Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).</li><li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-organ+toxicity+induced+by+fine+particulate+matter+PM2.5+in+zebrafish+(Danio+rerio)+model.">Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model.</a> Chemosphere. 180, 24-32 (2017).</li><li>Lorda-Diez, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+senescence,+apoptosis+and+DNA+damage+cooperate+in+the+remodeling+processes+accounting+for+heart+morphogenesis.">Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis.</a> Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).</li><li>Kouassi, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+induced+in+A549+cells+by+physically+and+chemically+characterized+air+particulate+matter+(PM2.5)+collected+in+Abidjan,+Cote+d'Ivoire.">Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire.</a> Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).</li><li>Gualtieri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+A549+cells+exposed+to+Milan+PM2.5.">Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5.</a> Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).</li><li>Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+glycation+endproduct+induces+ROS+accumulation,+apoptosis,+MAP+kinase+activation+and+nuclear+O-GlcNAcylation+in+human+cardiac+myocytes.">Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes.</a> Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).</li><li>Yamashita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+zebrafish+development.">Apoptosis in zebrafish development.</a> Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry &amp; Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).</li><li>Moazzen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acetylcysteine+prevents+congenital+heart+defects+induced+by+pregestational+diabetes.">N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes.</a> Cardiovascular Diabetology. 13, 46 (2014).</li><li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetylcysteine,+reactive+oxygen+species+and+beyond.">N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 9, 109-110 (2010).</li><li>Tu, S., Chi, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+in+cardiac+development+and+congenital+heart+birth+defects.">Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects.</a> Differentiation. 84, 4-16 (2012).</li><li>Asnani, A., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+tool+to+identify+novel+therapies+for+human+cardiovascular+disease.">The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7, 763-767 (2014).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+effects+of+polychlorinated+biphenyls+on+cardiac+development+in+zebrafish.">Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish.</a> Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).</li><li>Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+particulate+matter+from+cigarette+smoke+disrupts+vascular+development+in+zebrafish+brain+(Danio+rerio).">Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio).</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).</li><li>Ren, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AHR-mediated+ROS+production+contributes+to+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos.">AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> The Science of the Total Environment. 719, 135097 (2020).</li><li>van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+consensus+on+cardiac+regeneration.">An emerging consensus on cardiac regeneration.</a> Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).</li><li>Yue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+folic+acid+on+PM2.5-induced+cardiac+developmental+toxicity+in+zebrafish+embryos+by+targeting+AhR+and+Wnt/beta-catenin+signal+pathways.">Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways.</a> Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).</li><li>Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+nanoparticles+induce+oxidative+DNA+damage+and+ROS-triggered+mitochondria-mediated+apoptosis+in+zebrafish+embryos.">Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos.</a> Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).</li><li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity,+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish.">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+effects+on+glutathione-S-transferase+activity+induced+by+atrazine+exposure+in+zebrafish+(Danio+rerio).">DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).</li></ol>

हालांकि ज़ेब्राफ़िश पर्यावरणीय रसायनों की हृदय विकासात्मक विषाक्तता का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट कशेरुकी मॉडल है, भ्रूण हृदय के छोटे आकार के कारण, पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए पर्याप्त प्रोटीन प...

वायु प्रदूषण अब दुनिया के सामने एक गंभीर पर्यावरणीय समस्या है । परिवेश ठीक कण पदार्थ (पीएम2.5),जो वायु गुणवत्ता के सबसे महत्वपूर्ण संकेतकों में से एक है, बड़ी संख्या में हानिकारक पदार्थ ले जा सकता है और रक्त संचार प्रणाली में प्रवेश कर सकता है, जिससे मानव स्वास्थ्य को गंभीर नुकसान पहुंच सकता है1। महामारी विज्ञान के अध्ययनों से पता चला है कि पीएम2.5 के संपर्क में आने से जन्मजात हृदय दोष (सीएचडी) 2,3का खतरा बढ़सकताहै . पशु प्रयोगों से मिले साक्ष्यों से यह भी पता चला है कि पीएम25 जेब्राफिश भ्रूण और चूहों की संतानों में असामान्य हृदय विकास का कारण बन सकता है लेकिन पीएम25 की हृदय विकासात्मक विषाक्तता का आणविक तंत्र अभी भी काफी हद तक अज्ञात है4,5,6.
डीएनए क्षति सेल चक्र की गिरफ्तारी का कारण बन सकती है और एपोप्टोसिस को प्रेरित कर सकती है, जो बड़े पैमाने पर जनक कोशिकाओं की क्षमता को नष्ट कर सकती है और परिणामस्वरूप, हृदय विकास7को ख़राब कर सकतीहै)। यह अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है कि पीएम2.5सहित पर्यावरण प्रदूषकों में ऑक्सीडेटिव स्ट्रेस मैकेनिज्म8,9के माध्यम से डीएनए पर हमला करने की क्षमता है। मानव और जेब्राफिश हृदय दोनों का विकास ऑक्सीडेटिव तनाव 10 ,11,12के प्रति संवेदनशील है . 8- ओएचडीजी एक ऑक्सीडेटिव डीएनए डैमेज मार्कर है, और γH2AX सिग्नल डीएनए डबल स्ट्रैंड ब्रेक का मार्कर है। एन-एसिटिल-एल-सिस्टीन (एनएसी), इंट्रासेलुलर सिस्टीन और ग्लूटाथिएक का सिंथेटिक अग्रदूत, व्यापक रूप से एंटी-ऑक्सीडेटिव यौगिक के रूप में उपयोग किया जाता है। इस अध्ययन में, हम एनएसी का उपयोग पीएम25में ऑक्सीडेटिव तनाव की भूमिका की जांच करने के लिए करते हैं - प्रेरित डीएनए क्षति13।
एक मॉडल कशेरुकी के रूप में जेब्राफिश का व्यापक रूप से हृदय विकास और मानव हृदय रोगों का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है क्योंकि कशेरुकी विकास के तंत्र14,15कशेरुकी के बीच अत्यधिक संरक्षित होते हैं । एक मॉडल के रूप में ज़ेब्राफ़िश का उपयोग करने के फायदे में उनके छोटे आकार, मजबूत प्रजनन क्षमता और कम भोजन लागत शामिल हैं। इन अध्ययनों के लिए विशेष रुचि के, जेब्राफिश भ्रूण प्रारंभिक विकास के दौरान संचार प्रणाली पर निर्भर नहीं करते हैं और गंभीर हृदय विकृति14जीवित रह सकते हैं। इसके अलावा, उनकी पारदर्शिता पूरे शरीर को सीधे माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जा सकता है। इस प्रकार, जेब्राफिश भ्रूण विभिन्न पर्यावरणीय रसायनों के संपर्क में आने के परिणामस्वरूप हृदय विकासात्मक विषाक्तता के प्रेरण में शामिल आणविक तंत्र का आकलन करने के लिए एक उत्कृष्ट अवसर प्रदानकरतेहैं5,16,17. हमने पहले बताया है कि पीएम२.५-प्रेरितऑक्सीडेटिव स्ट्रेस डीएनए डैमेज और एपोप्टोसिस की ओर ले जाता है, जिसके परिणामस्वरूप जेब्राफिश18में दिल की विकृतियां होती हैं । इस अध्ययन में, हम जेब्राफिश भ्रूण के दिल में पीएम२.५-प्रेरितडीएनए क्षति की जांच के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं ।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>8-OHdG Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, USA</td>
			<td>sc-66036</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorius,China</td>
			<td>BSA124S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Solarbio,Beijing,China</td>
			<td>SW3015</td>
			<td>For blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam, USA</td>
			<td>ab104139</td>
			<td>For nuclear counterstain.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Solarbio,Beijing,China</td>
			<td>D8371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>IX73</td>
			<td>For imaging fluorescence signals/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG Cy3</td>
			<td>Carlsbad,USA</td>
			<td>CW0159</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG FITC</td>
			<td>Carlsbad,USA</td>
			<td>RS0003</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine(NAC)</td>
			<td>Adamas-Beta, Shanghai, China</td>
			<td>616-91-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>QILINBEIER,China</td>
			<td>TS-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma,China</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Make 4% paraformaldehyde for fixation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>HyClone,USA</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>Prepare 0.1% Tween in PBS for washing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM2.5 sampler</td>
			<td>TianHong,Wuhan, China</td>
			<td>TH-150C</td>
			<td>For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Re-circulating aquaculture system</td>
			<td>HaiSheng,Shanghai,China</td>
			<td></td>
			<td>The zebrafish was maintained in it.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soxhlet extractor</td>
			<td>ZhengQiao,Shanghai, China</td>
			<td>BSXT-02</td>
			<td>For organic components extraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon,Canada</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td>For heart dissection from zebrafish embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (MS222)</td>
			<td>Sigma,China</td>
			<td>E10521</td>
			<td>To anesthetize zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma,China</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;H2AX Antibody</td>
			<td>Abcam, USA</td>
			<td>ab26350</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using immunofluorescence to detect pm2.5-induced dna damage in zebrafish embryo hearts

परिवेश ठीक कण पदार्थ (पीएम२.५)जोखिम हृदय विकास विषाक्तता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, लेकिन अंतर्निहित आणविक तंत्र अभी भी स्पष्ट नहीं हैं । 8-हाइड्रोक्सी-2'डिऑक्सीजेनेज (8-ओएचडीजी) ऑक्सीडेटिव डीएनए क्षति का एक मार्कर है और γH2AX डीएनए डबल स्ट्रैंड ब्रेक के लिए एक संवेदनशील मार्कर है। इस अध्ययन में, हम प्रधानमंत्री२.५-प्रेरित8-OHdG का पता लगाने और एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख का उपयोग कर जेब्राफिश भ्रूण के दिल में परिवर्तन γH2AX उद्देश्य । जेब्राफिश भ्रूण 2 घंटे के बाद निषेचन (एचपीएफ) में एंटीऑक्सीडेंट एन-एसिटिल-एल-सिस्टीन (एनएसी, 0.25 माइक्रोन) की उपस्थिति या अनुपस्थिति में पीएम2.5 से एक्सट्रैक्टेबल ऑर्गेनिक मैटर्स (ईओएम) के साथ इलाज किया गया। डीएमएसओ को वाहन नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। ७२ एचपीएफ में, दिल एक सिरिंज सुई का उपयोग कर भ्रूण से विच्छेदित किया गया और तय और permeabilized । अवरुद्ध होने के बाद 8-ओएचडीजी और γH2AX के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ नमूनों की जांच की गई । इसके बाद नमूनों को धोया गया और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेटेड किया गया । इसके परिणामस्वरूप छवियों को फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के तहत देखा गया और इमेजजे का उपयोग करके मात्राकृत किया गया। परिणाम बताते हैं कि पीएम25 से ईओएम ने जेब्राफिश भ्रूण के दिल में 8-ओएचडीजी और γH2AX संकेतों को काफी बढ़ाया। हालांकि, एनएसी, एक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) मेहतर के रूप में कार्य, आंशिक रूप से EOM प्रेरित डीएनए क्षति प्रतिक्रिया व्यक्त की । यहां, हम पीएम२.५-प्रेरितहृदय दोषों में डीएनए क्षति की भूमिका की जांच के लिए एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसे जेब्राफिश भ्रूण के दिलों में पर्यावरणीय रासायनिक प्रेरित प्रोटीन अभिव्यक्ति परिवर्तनों का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है ।

यह इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख पर्यावरणीय रसायनों के संपर्क में आने वाले जेब्राफिश भ्रूण के दिलों में प्रोटीन अभिव्यक्ति परिवर्तन को मापने के लिए एक संवेदनशील और विशिष्ट विधि है।
<p class="jove_content" fo...

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Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts

यह प्रोटोकॉल जेब्राफिश भ्रूण के विच्छेदित दिलों में पीएम२.५-प्रेरितडीएनए क्षति का पता लगाने के लिए एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख का उपयोग करता है ।

ज़ेब्राफिश भ्रूण दिलों में प्रधानमंत्री२.५-प्रेरितडीएनए क्षति का पता लगाने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करना

Ambient fine particulate matter (PM2.5) exposure can lead to cardiac developmental toxicity but the underlying molecular mechanisms are still unclear. ...

इस विधि का उपयोग जेब्राफिश हार्ट में लक्षित प्रोटीन की अभिव्यक्ति का सही और आसानी से पता लगाने के लिए किया जा सकता है। टारगेट प्रोटीन में बदलाव का पता सीधे तौर पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस को मापने से होता है । पाठ पांडुलिपि में वर्णित जेब्राफिश भ्रूण संग्रह और उपचार करें।निषेचन के बाद 72 घंटे में, भ्रूण को ग्लास स्लाइड में स्थानांतरित करें, और उन्हें स्टीरियो माइक्रोस्कोप के नीचे देखें। रिकॉर्ड हृदय विकृतियां, जैसे कि पेरिकार्डियल एडिमा, बदल लूपिंग और आकार में कमी। विकृति दरों की गणना करें और एक तरह से ANOVA का उपयोग कर समूहों के बीच मतभेदों का विश्लेषण, तुर्की के कई तुलना परीक्षण के बाद ।0.6 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर MS222 के साथ भ्रूण को एनेस्थेटाइज करने के बाद, 30 सेकंड के लिए दिल की धड़कन रिकॉर्ड करें, और इमेज जे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके दिल की दरों की मात्रा निर्धारित करें। ध्यान से एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत एक डिस्पोजेबल सिरिंज सुई के साथ जेब्रा मछली भ्रूण से दिल विच्छेदन। एक साफ ग्लास स्लाइड पर एक सर्कल आकर्षित करने के लिए एक हाइड्रोफोबिक बाधा कलम का प्रयोग करें।एक स्थिर समाधान बनाने के लिए पीबीएस के 1.25 माइक्रोलीटर में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें, फिर तीन विच्छेदित दिलों को एक हाइड्रोफोबिक बैरियर सर्कल में रखें, और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। माइक्रोस्कोप के नीचे समाधान को डिकेंट करें और कम से कम पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूनों को सुखाएं। पांच मिनट प्रति वॉश के लिए पीबीएएसटी में तीन बार स्लाइड धोएं।5% बीएसए समाधान प्राप्त करने के लिए पीएसए के 1, 000 माइक्रोलीटर में बीएसए के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें, और गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी बाइंडिंग को ब्लॉक करने के लिए एक घंटे के लिए एक आर्द्र कक्ष में स्लाइड को इनक्यूबेट करें। समाधान को डिकेंट करें और नमूनों को पीबीएस के साथ तीन बार पांच मिनट प्रति वॉश के लिए धोएं। एक काम प्राथमिक एंटीबॉडी कॉकटेल समाधान प्राप्त करने के लिए पीबीएसटी के 296 माइक्रोलीटर में गामा-एच2एक्स में 8-हाइड्रोक्सीडेक्सीगुआनोसिन के खिलाफ माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के दो माइक्रोलीटर और खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के दो माइक्रोलीटर को पतला करें।कमरे के तापमान पर या रात में चार डिग्री सेल्सियस पर कम से एक घंटे के लिए एक आर्द्रीकृत कक्ष में प्राथमिक एंटीबॉडी कॉकटेल समाधान के ५० माइक्रोलीटर के साथ दिल के नमूनों को इनक्यूबेट करें । समाधान को कम करें और नमूनों को पीबीएएसटी के साथ तीन बार पांच मिनट प्रति वॉश के लिए धोएं। फिटसी लेबल बकरी विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी के एक माइक्रोलीटर पतला और पीबीएएसटी के ५०० माइक्रोलीटर में मनोचिकित्सक-3 बकरी विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी के एक माइक्रोलीटर एक काम माध्यमिक एंटीबॉडी कॉकटेल समाधान प्राप्त करने के लिए ।अंधेरे में कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ नमूनों को इनक्यूबेट करें। समाधान को डिकेंट करें और नमूनों को पीबीएस के साथ तीन बार पांच मिनट प्रति वॉश के लिए धोएं। परमाणु धुंधला के लिए नमूनों में DAPI के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें, और उन्हें कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।स्लाइड पर कवर स्लिप लगाएं और सुखाने और मूवमेंट को रोकने के लिए नेल पॉलिश से इसे सील कर दें। एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत नमूनों छवि और ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर दिल क्षेत्र के फ्लोरोसेंट संकेत मात्रा । DMSO नियंत्रण नमूनों के औसत का उपयोग कर सापेक्ष परिवर्तन की गणना और डेटा के सांख्यिकीय महत्व का निर्धारण ।एंटीऑक्सीडेंट, एन-एसिटिल-एल-सिस्टीन, या एनएसी की अनुपस्थिति या उपस्थिति में पीएम २.५ के संपर्क में आने वाले भ्रूणों का मूल्यांकन हृदय विकृतियों की उपस्थिति के लिए किया गया था । पीएम 2.5 से ईओएम ने डीएमएसओ-कंट्रोल ट्रीटेड हार्ट्स की तुलना में कार्डियक टेराटोजेनेसिस में काफी वृद्धि की, जैसे कि पेरिकार्डियल एडीमा, बदल लूपिंग और आकार में कमी आई। ईओएम के संपर्क में आने वाले भ्रूणों में भी हृदय गति में काफी कमी आई थी।एनएसी तनु ईओएम प्रेरित हृदय दोषों के अलावा। ईओएम-उपचारित ऊतकों में डीएनए क्षति की सीमा का मूल्यांकन करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख का उपयोग किया गया था। 8-हाइड्रोक्सीडिऑक्सीगुआनोसिन और गामा-एच2एक्स एक्सप्रेशन के स्तर को ईओएम के साथ इलाज किए गए जेब्राफिश भ्रूण के दिलों में काफी वृद्धि हुई, जो क्रमशः ऑक्सीडेटिव डीएनए क्षति और डीएनए डबल स्ट्रैंड ब्रेक में वृद्धि का संकेत है ।ईओएम-प्रेरित डीएनए क्षति को एनएसी अनुपूरण द्वारा आंशिक रूप से प्रतिकार किया गया था । इस प्रोटोकॉल का प्रयास करते समय, पीबीएस के साथ नमूनों को धोते समय ध्यान रखें, क्योंकि जेब्राफिश दिल स्लाइड को छील सकता है।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

भ्रूण माउस दिल में immunofluorescence का उपयोग cardiomyocyte विकास का विश्लेषण

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Zebrafish भ्रूण में Microbead आरोपण

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

घाव स्क्रैच परख का अनुकूलन घुलनशील सिगरेट के धुएं निकालें द्वारा क्षति के बाद Murine Mesenchymal stromal सेल प्रवासन में परिवर्तन का पता लगाने के लिए

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

लिविंग zebrafish भ्रूण में subcellular संरचनाओं इमेजिंग

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

एक लाइव zebrafish भ्रूण में mitotic डिवीजन और गतिशीलता अवलोकन

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

साफ भ्रूण दिल में कोरोनरी वाहिकाओं का विश्लेषण

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Zebrafish भ्रूण में स्थिर, गतिशील और नवजात Microtubules का विश्लेषण करने के लिए Immunolabeling का उपयोग

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Zebrafish भ्रूण जर्दी सेल में AFM और Microrheology

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Zebrafish भ्रूण में सेल Photoconversion के द्वारा निंनलिखित Endocardial ऊतक आंदोलनों

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

न्यूनतम इनवेसिव भ्रूण हस्तांतरण और खरगोश मॉडल में इष्टतम भ्रूण के चरण में भ्रूण काचन

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...