Name: using immunofluorescence to detect pm2.5-induced dna damage in zebrafish embryo hearts
Uploaded: 2021-02-15T13:00:00
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この研究は、中国国立自然科学財団(助成金番号:81870239、81741005、81972999)と江蘇高等教育機関の優先学術プログラム開発によって支援されました。

本研究で使用された野生型ゼブラフィッシュ(AB)は、中国武漢市の国立ゼブラフィッシュ資源センターから入手した。ここで概説されているすべての動物の手順は、スーチョウ大学の倫理委員会の動物ケア機関によって見直され、承認されています.
1. PM2.5 サンプリングと有機化合物抽出
注:PM2.5 は、前に説明したよう?...

<ol>
	<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Exposure+to+Air+Pollution+and+Risk+of+Congenital+Heart+Defects.">Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects.</a> European Journal of Pediatrics. 175, 1520 (2016).</li><li>Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+exposure+to+PM2.5+and+Congenital+Heart+Diseases+in+Taiwan.">Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan.</a> The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).</li><li>Mesquita, S. 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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+senescence,+apoptosis+and+DNA+damage+cooperate+in+the+remodeling+processes+accounting+for+heart+morphogenesis.">Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis.</a> Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).</li><li>Kouassi, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+induced+in+A549+cells+by+physically+and+chemically+characterized+air+particulate+matter+(PM2.5)+collected+in+Abidjan,+Cote+d'Ivoire.">Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire.</a> Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).</li><li>Gualtieri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+A549+cells+exposed+to+Milan+PM2.5.">Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5.</a> Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).</li><li>Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. 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Part B, Biochemistry &amp; Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).</li><li>Moazzen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acetylcysteine+prevents+congenital+heart+defects+induced+by+pregestational+diabetes.">N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes.</a> Cardiovascular Diabetology. 13, 46 (2014).</li><li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetylcysteine,+reactive+oxygen+species+and+beyond.">N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 9, 109-110 (2010).</li><li>Tu, S., Chi, N. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+tool+to+identify+novel+therapies+for+human+cardiovascular+disease.">The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7, 763-767 (2014).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+effects+of+polychlorinated+biphenyls+on+cardiac+development+in+zebrafish.">Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish.</a> Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).</li><li>Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+consensus+on+cardiac+regeneration.">An emerging consensus on cardiac regeneration.</a> Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).</li><li>Yue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+folic+acid+on+PM2.5-induced+cardiac+developmental+toxicity+in+zebrafish+embryos+by+targeting+AhR+and+Wnt/beta-catenin+signal+pathways.">Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways.</a> Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).</li><li>Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+nanoparticles+induce+oxidative+DNA+damage+and+ROS-triggered+mitochondria-mediated+apoptosis+in+zebrafish+embryos.">Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos.</a> Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).</li><li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity,+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish.">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+effects+on+glutathione-S-transferase+activity+induced+by+atrazine+exposure+in+zebrafish+(Danio+rerio).">DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).</li></ol>

ゼブラフィッシュは、環境化学物質の心臓発達毒性を研究するための優れた脊椎動物モデルであるが、胚心臓の小さいサイズに起因して、ウェスタンブロット分析のための十分なタンパク質を得ることは困難である。そこで、PM2.5に曝露したゼブラフィッシュ胚の心臓におけるDNA損傷バイオマーカーのタンパク質発現レベルを定量化するための高感度免疫蛍光法を提示する。
<p clas...

大気汚染は今や世界が直面している深刻な環境問題です。大気質の最も重要な指標の一つである周囲微小粒子状物質(PM2.5)は、多数の有害物質を運び、血液循環系に入り、人間の健康に深刻な害を及ぼす可能性がある。疫学研究は、PM2.5曝露が先天性心不全(CHD)2、3のリスクの増加につながることを実証した。また、動物実験の証拠は、PM2.5がゼブラフィッシュの胚およびマウスの子孫に異常な心臓発達を引き起こす可能性があることを示したが、PM2.5の心臓発達毒性の分子機構は依然としてほとんど知られていない4、5、6である。
DNA損傷は、細胞周期停止を引き起こし、アポトーシスを誘発し、前駆細胞の可能性を広範囲に破壊し、その結果、心臓の発達を損なう可能性がある7)。PM2.5を含む環境汚染物質は、酸化ストレス機構8,9を通じてDNAを攻撃する可能性を有することが十分に文書化されている。ヒトとゼブラフィッシュの心臓の発達は、酸化ストレス10、11、12に敏感です。8-OHdGは酸化的DNA損傷マーカーであり、γH2AXシグナルはDNA二重鎖切断のマーカーである。細胞内システインとグルタチオンの合成前駆体であるN-アセチル-L-システイン(NAC)は、抗酸化化合物として広く使用されています。本研究では、NACを用い、PM2.5-誘導DNA損傷13における酸化ストレスの役割を調べる。
脊椎動物のモデルとしてのゼブラフィッシュは、脊椎動物14,15の間で心臓開発のメカニズムが高度に保存されているため、心臓の発達やヒト心血管疾患の研究に広く用いられている。ゼブラフィッシュをモデルとして使用する利点には、小型、強力な生殖能力、低給餌コストなどがあります。これらの研究に特に興味深いのは、ゼブラフィッシュ胚は初期の発達の間に循環系に依存せず、重度の心臓奇形14を生き残ることができる。さらに、その透明性により、全身を顕微鏡下で直接観察することができます。このように、ゼブラフィッシュ胚は、種々の環境化学物質への曝露の結果として心臓発達毒性の誘導に関与する分子機構を評価する優れた機会を提供する5、16、17。我々は以前にPM2.5誘導酸化ストレスがDNA損傷およびアポトーシスをもたらし、ゼブラフィッシュ18の心臓奇形をもたらすことを報告した。本研究では、ゼブラフィッシュ胚の心臓部におけるPM2.5誘導DNA損傷を調査するための詳細なプロトコルを提供する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-OHdG Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, USA</td>
			<td>sc-66036</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorius,China</td>
			<td>BSA124S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Solarbio,Beijing,China</td>
			<td>SW3015</td>
			<td>For blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam, USA</td>
			<td>ab104139</td>
			<td>For nuclear counterstain.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Solarbio,Beijing,China</td>
			<td>D8371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>IX73</td>
			<td>For imaging fluorescence signals/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG Cy3</td>
			<td>Carlsbad,USA</td>
			<td>CW0159</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG FITC</td>
			<td>Carlsbad,USA</td>
			<td>RS0003</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine(NAC)</td>
			<td>Adamas-Beta, Shanghai, China</td>
			<td>616-91-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>QILINBEIER,China</td>
			<td>TS-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma,China</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Make 4% paraformaldehyde for fixation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>HyClone,USA</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>Prepare 0.1% Tween in PBS for washing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM2.5 sampler</td>
			<td>TianHong,Wuhan, China</td>
			<td>TH-150C</td>
			<td>For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Re-circulating aquaculture system</td>
			<td>HaiSheng,Shanghai,China</td>
			<td></td>
			<td>The zebrafish was maintained in it.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soxhlet extractor</td>
			<td>ZhengQiao,Shanghai, China</td>
			<td>BSXT-02</td>
			<td>For organic components extraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon,Canada</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td>For heart dissection from zebrafish embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (MS222)</td>
			<td>Sigma,China</td>
			<td>E10521</td>
			<td>To anesthetize zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma,China</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;H2AX Antibody</td>
			<td>Abcam, USA</td>
			<td>ab26350</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using immunofluorescence to detect pm2.5-induced dna damage in zebrafish embryo hearts

周囲の微小粒子状物質(PM2.5)曝露は心臓発達毒性を引き起こす可能性があるが、基礎となる分子メカニズムはまだ不明である。8-ヒドロキシ-2'デオキシゲナーゼ(8-OHdG)は、酸化的DNA損傷のマーカーであり、γH2AXはDNA二重鎖切断のための感受性マーカーである。本研究では、免疫蛍光アッセイを用いてゼブラフィッシュ胚の心臓部におけるPM2.5誘導8-OHdGおよびγH2AXの変化を検出することを目的とした。ゼブラフィッシュ胚は、受精後2時間(hpf)で抗酸化N-アセチルL-システイン(NAC,0.25 μM)の有無に関して、PM2.5 から5μg/mLで抽出可能な有機物質(EOM)で処理した。DMSOは車両制御として使用されました。72hpfでは、注射針を使用して胚から心臓を解剖し、固定して透過させた。ブロックされた後、サンプルを8-OHdGおよびγH2AXに対する一次抗体でプローブした。次いで、試料を洗浄し、二次抗体でインキュベートした。得られた画像を蛍光顕微鏡観察下で観察し、ImageJを用いて定量した。結果は、PM2.5 からのEOMがゼブラフィッシュ胚の心臓部で8-OHdGおよびγH2AX信号を有意に増強したことを示す。しかしながら、NACは、活性酸素種(ROS)スカベンジャーとして作用し、EOM誘導DNA損傷を部分的に打ち消した。ここでは、ゼブラフィッシュ胚の心臓における環境化学的誘導タンパク質発現変化の検出に適用できるPM2.5-誘発心臓欠陥におけるDNA損傷の役割を調べるための免疫蛍光プロトコルを提示する。

この免疫蛍光アッセイは、環境化学物質にさらされたゼブラフィッシュ胚の心臓におけるタンパク質発現変化を測定するための敏感かつ特異的な方法である。
この代表的な分析では、抗酸化物質NACの存在の有無または存在下でPM2.5にさらされた胚は、心臓奇形の存在について評価した(図1)。?...

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Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts

このプロトコルは、免疫蛍光アッセイを使用して、ゼブラフィッシュ胚の解剖された心臓におけるPM2.5誘発DNA損傷を検出する。

免疫蛍光を使用して、ゼブラフィッシュ胚の心臓におけるPM2.5誘導DNA損傷を検出する

Ambient fine particulate matter (PM2.5) exposure can lead to cardiac developmental toxicity but the underlying molecular mechanisms are still unclear. ...

この方法は、ゼブラフィッシュ心臓における標的タンパク質の発現を正確かつ容易に検出するために使用することができる。標的タンパク質の変化は、免疫蛍光を測定することによって直接検出される。テキスト原稿に記載されているようにゼブラフィッシュ胚の収集と治療を行う。受精後72時間で、胚をガラススライドに移し、ステレオ顕微鏡で観察します。心膜浮腫、ループの変化、サイズの減少などの心臓奇形を記録する。奇形率を計算し、一方の方法ANOVAを使用してグループ間の差異を分析し、続いてトルコの多重比較検定を行います。ミリリットルMS222あたり0.6ミリグラムで胚を麻酔した後、30秒間心拍を記録し、Image Jソフトウェアを使用して心拍数を定量化します。ステレオ顕微鏡の下で使い捨ての注射針でシマウマの魚の胚から心臓を慎重に解剖する。疎水性バリアペンを使用して、きれいなガラススライドに円を描きます。4%パラホルムアルデヒドの50マイクロリットルをPBSの1.25マイクロリットルに加えて固定液溶液を作り、解剖した心臓を1つの疎水性バリアサークルに入れ、室温で20分間インキュベートします。溶液を顕微鏡下でデカントし、サンプルを室温で少なくとも5分間乾燥させます。PBSTで3回、洗浄ごとに5分間洗浄します。50マイクロリットルのBSAを1,000マイクロリットルのPBSTに加えて5%BSA溶液を得て、湿度の高いチャンバーで1時間インキュベートして非特異的抗体結合を遮断します。溶液をデカントし、PBSで3回、洗浄ごとに5分間洗浄します。8-ヒドロキシデオキシグアノシンに対してマウスモノクローナル抗体の2マイクロリットルを希釈し、296マイクロリットルのPBSTでγ-H2AXに対してウサギのポリクローナル抗体を2マイクロリットル希釈し、一次抗体カクテル溶液の働きを得る。加湿チャンバーに50マイクロリットルの一次抗体カクテル溶液を用いて、心臓サンプルを室温で少なくとも1時間、摂氏4度で一晩インキュベートします。溶液をデカントし、PBSTで3回、洗浄ごとに5分間洗浄します。FITC標識ヤギ抗マウス二次抗体の1マイクロリットルと500マイクロリットルのPBSTのpsy-3ヤギ抗ウサギ二次抗体の1マイクロリットルを希釈し、働く二次抗体カクテル溶液を得る。暗い温度で1時間二次抗体でサンプルをインキュベートします。溶液をデカントし、PBSで3回、洗浄ごとに5分間洗浄します。核染色用のサンプルに20マイクロリットルのDAPIを加え、室温で30分間インキュベートします。スライドにカバースリップを適用し、乾燥や動きを防ぐためにマニキュアでそれを密封します。蛍光顕微鏡でサンプルを画像化し、ImageJソフトウェアを使用して心臓領域の蛍光シグナルを定量化します。DMSO制御サンプルの平均を用いて相対変化を計算し、データの統計的有意性を決定します。抗酸化物質の存在または存在下でPM2.5にさらされた胚は、N-アセチル-L-システイン、またはNAC、心臓奇形の存在について評価した。PM 2.5からのEOMは、DMSO対照処置心臓と比較して、心膜浮腫、変化したループおよびサイズの減少などの心臓奇形発生の有意な増加を犠牲にした。また、EOMに曝露された胚においても心拍数が有意に低下した。NACの付加はEOM誘発の心臓欠陥を弱めた。EOM処理組織におけるDNA損傷の程度を評価するために免疫蛍光アッセイを用いた。EOMで処理したゼブラフィッシュ胚の心臓では8-ヒドロキシデオキシグアノシンおよびγ-H2AX発現のレベルが有意に増加し、酸化DNA損傷およびDNA二重鎖の破壊の増加を示した。EOMによるDNA損傷は、NAC補充によって部分的に打ち消された。このプロトコルを試みるとき、ゼブラフィッシュの心臓がスライドから剥がれる可能性があるため、PBSでサンプルを洗浄する際には注意してください。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

胚性マウスの心臓に免疫蛍光を用いて、心筋細胞の開発の分析

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

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Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

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リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

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ライブゼブラフィッシュ胚における有糸分裂とダイナミクスを観察します

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Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

クリア胚ハーツにおける冠状血管の分析

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Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

ゼブラフィッシュ胚の安定した、動的、および初期の微小管を分析する反応の利用

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AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

原子間力顕微鏡とゼブラフィッシュ胚の卵黄細胞のレオロジー

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Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

ウサギモデルにおける最適胚期における低侵襲胚移植と胚ガラス化

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...