Name: using immunofluorescence to detect pm2.5-induced dna damage in zebrafish embryo hearts
Uploaded: 2021-02-15T13:00:00
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이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 : 81870239, 81741005, 81972999)과 장쑤 고등 교육 기관의 우선 교육 프로그램 개발에 의해 지원되었다.

이 연구에 사용된 야생형 제브라피쉬(AB)는 중국 우한에 있는 국립 제브라피시 자원 센터에서 입수되었다. 여기에 설명된 모든 동물 절차는 소오하우 대학 윤리위원회의 동물 관리 기관에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. PM2.5 샘플링 및 유기 화합물 추출
참고: PM2.5는 2015년 8월 1일부터 7일까지 중국 쑤저우의 한 도시 지역에서 수집되었으?...

<ol>
	<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Exposure+to+Air+Pollution+and+Risk+of+Congenital+Heart+Defects.">Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects.</a> European Journal of Pediatrics. 175, 1520 (2016).</li><li>Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+exposure+to+PM2.5+and+Congenital+Heart+Diseases+in+Taiwan.">Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan.</a> The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).</li><li>Mesquita, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+assessment+of+urban+atmospheric+particle-bound+PAHs:+relevance+of+composition+and+particle+size+in+Barcelona+(Spain).">Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain).</a> Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+AhR+and+wnt/beta-catenin+signal+pathways+in+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos.">Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).</li><li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-organ+toxicity+induced+by+fine+particulate+matter+PM2.5+in+zebrafish+(Danio+rerio)+model.">Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model.</a> Chemosphere. 180, 24-32 (2017).</li><li>Lorda-Diez, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+senescence,+apoptosis+and+DNA+damage+cooperate+in+the+remodeling+processes+accounting+for+heart+morphogenesis.">Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis.</a> Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).</li><li>Kouassi, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+induced+in+A549+cells+by+physically+and+chemically+characterized+air+particulate+matter+(PM2.5)+collected+in+Abidjan,+Cote+d'Ivoire.">Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire.</a> Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).</li><li>Gualtieri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+A549+cells+exposed+to+Milan+PM2.5.">Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5.</a> Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).</li><li>Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+glycation+endproduct+induces+ROS+accumulation,+apoptosis,+MAP+kinase+activation+and+nuclear+O-GlcNAcylation+in+human+cardiac+myocytes.">Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes.</a> Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).</li><li>Yamashita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+zebrafish+development.">Apoptosis in zebrafish development.</a> Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry &amp; Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).</li><li>Moazzen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acetylcysteine+prevents+congenital+heart+defects+induced+by+pregestational+diabetes.">N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes.</a> Cardiovascular Diabetology. 13, 46 (2014).</li><li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetylcysteine,+reactive+oxygen+species+and+beyond.">N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 9, 109-110 (2010).</li><li>Tu, S., Chi, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+in+cardiac+development+and+congenital+heart+birth+defects.">Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects.</a> Differentiation. 84, 4-16 (2012).</li><li>Asnani, A., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+tool+to+identify+novel+therapies+for+human+cardiovascular+disease.">The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7, 763-767 (2014).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+effects+of+polychlorinated+biphenyls+on+cardiac+development+in+zebrafish.">Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish.</a> Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).</li><li>Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+particulate+matter+from+cigarette+smoke+disrupts+vascular+development+in+zebrafish+brain+(Danio+rerio).">Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio).</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).</li><li>Ren, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AHR-mediated+ROS+production+contributes+to+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos.">AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> The Science of the Total Environment. 719, 135097 (2020).</li><li>van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+consensus+on+cardiac+regeneration.">An emerging consensus on cardiac regeneration.</a> Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).</li><li>Yue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+folic+acid+on+PM2.5-induced+cardiac+developmental+toxicity+in+zebrafish+embryos+by+targeting+AhR+and+Wnt/beta-catenin+signal+pathways.">Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways.</a> Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).</li><li>Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+nanoparticles+induce+oxidative+DNA+damage+and+ROS-triggered+mitochondria-mediated+apoptosis+in+zebrafish+embryos.">Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos.</a> Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).</li><li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity,+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish.">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+effects+on+glutathione-S-transferase+activity+induced+by+atrazine+exposure+in+zebrafish+(Danio+rerio).">DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).</li></ol>

제브라피쉬는 환경 화학물질의 심장 발달 독성을 연구하기 위한 우수한 척추동물 모델이지만, 배아 심장의 크기가 작기 때문에 서양 얼룩 분석을 위한 충분한 단백질을 얻기가 어렵다. 따라서, PM2.5에노출된 제브라피쉬 배아의 심장에 DNA 손상 바이오마커의 단백질 발현 수준을 정량화하기 위한 민감한 면역형광방법을 제시한다.
해부 동안, 마음의 무결성을 온전하게 ...

대기 오염은 이제 세계가 직면한 심각한 환경 문제입니다. 대기질의 가장 중요한 지표 중 하나인 주변 미세미립자 물질(PM2.5)은많은 유해 물질을 운반하고 혈액 순환 시스템에 들어갈 수 있어 인체 건강에 심각한 해를 끼칠 수있다 1. 역학 연구는 PM2.5 노출이 선천성 심장 결함 (CHDs)2,3의증가한 리스크로 이끌어 낼 수 있다는 것을 보여주었습니다. 동물 실험에서 증거는 또한 PM2.5가 제브라피시 배아와 마우스의 자손에서 비정상적인 심장 발달을 일으킬 수 있지만 PM2.5의 심장 발달 독성의 분자 메커니즘은 여전히 크게 알려지지 않은4,5,6을보여주었다.
DNA 손상은 세포 주기 체포를 유발하고 세포 세포의 잠재력을 광범위하게 파괴할 수 있는 세포 세포 멸망을 유발할 수 있으며, 결과적으로 심장발달7을손상시킬 수 있다. PM2.5를포함한 환경 오염 물질이 산화 스트레스 메커니즘8,9를통해 DNA를 공격할 가능성이 있다는 것이 잘 문서화되어 있다. 인간과 제브라피쉬 심장 발달은 산화 스트레스10,11,12에민감하다. 8-OHdG는 산화 DNA 손상 마커이며, γH2AX 신호는 DNA 이중 가닥 파손의 마커이다. N-아세틸-L-시스테인 (NAC), 세포 내 시스테인과 글루타티온의 합성 선구자, 널리 산화 화합물로 사용 된다. 이 연구에서는 NAC를 사용하여 PM2.5에서산화 스트레스의 역할을 조사합니다 - 유도된 DNA손상(13).
모델 척추동물로서 제브라피쉬는 심장 발달 및 인간 심혈관 질환을 연구하는 데 널리 사용되고 있으며, 이는 심장 발달의 메커니즘이 척추동물14,15사이에서 높게 보존되기 때문이다. 모델로 제브라피쉬를 사용하는 장점은 작은 크기, 강한 생식 능력 및 낮은 수유 비용을 포함합니다. 이러한 연구에 특히 관심이 있는 제브라피시 배아는 초기 발달 중 순환 시스템에 의존하지 않으며 심한 심장기형(14)에서살아남을 수 있다. 더욱이, 그들의 투명성은 현미경의 밑에 바디 전체가 직접 관찰될 수 있습니다. 따라서, 제브라피쉬 배아는 다양한 환경화학물질5,16,17에노출됨에 따라 심장 발달 독성유도에 관여하는 분자기전기를 평가할 수 있는 뛰어난 기회를 제공한다. 우리는 이전에 PM2.5유도 된 산화 스트레스가 DNA 손상및 석멸증으로 이어지며, 제브라피시 18에서 심장 기형이 발생한다고보고했습니다. 이 연구에서는, 우리는 제브라피시 배아의 심혼에 있는 PM2.5유도한 DNA 손상을 조사하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-OHdG Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, USA</td>
			<td>sc-66036</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorius,China</td>
			<td>BSA124S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Solarbio,Beijing,China</td>
			<td>SW3015</td>
			<td>For blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam, USA</td>
			<td>ab104139</td>
			<td>For nuclear counterstain.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Solarbio,Beijing,China</td>
			<td>D8371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>IX73</td>
			<td>For imaging fluorescence signals/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG Cy3</td>
			<td>Carlsbad,USA</td>
			<td>CW0159</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG FITC</td>
			<td>Carlsbad,USA</td>
			<td>RS0003</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine(NAC)</td>
			<td>Adamas-Beta, Shanghai, China</td>
			<td>616-91-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>QILINBEIER,China</td>
			<td>TS-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma,China</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Make 4% paraformaldehyde for fixation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>HyClone,USA</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>Prepare 0.1% Tween in PBS for washing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM2.5 sampler</td>
			<td>TianHong,Wuhan, China</td>
			<td>TH-150C</td>
			<td>For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Re-circulating aquaculture system</td>
			<td>HaiSheng,Shanghai,China</td>
			<td></td>
			<td>The zebrafish was maintained in it.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soxhlet extractor</td>
			<td>ZhengQiao,Shanghai, China</td>
			<td>BSXT-02</td>
			<td>For organic components extraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon,Canada</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td>For heart dissection from zebrafish embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (MS222)</td>
			<td>Sigma,China</td>
			<td>E10521</td>
			<td>To anesthetize zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma,China</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;H2AX Antibody</td>
			<td>Abcam, USA</td>
			<td>ab26350</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using immunofluorescence to detect pm2.5-induced dna damage in zebrafish embryo hearts

주변 의 미세 미립자 물질 (PM2.5)노출은 심장 발달 독성으로 이어질 수 있지만 기본 분자 메커니즘은 여전히 불분명합니다. 8-하이드록시-2'탈산소제(8-OHdG)는 산화 DNA 손상의 마커이며 γH2AX는 DNA 이중 가닥 파손에 대한 민감한 마커이다. 이 연구에서는 면역형광 분석기를 사용하여 제브라피시 배아의 심장에서 PM2.5-유도8-OHdG 및 γH2AX 의 변화를 검출하는 것을 목표로 했습니다. Zebrafish 배아는 2h 후 수정(hpf)에서 항산화 N-아세틸-L-시스테인(NAC, 0.25 μM)의 존재 또는 부재 시 PM2.5에서 추출 가능한 유기 물질(EOM)으로 치료되었다. DMSO는 차량 제어로 사용되었습니다. 72 hpf에서, 심혼은 주사기 바늘을 사용하여 배아에서 해부되고 고정되고 permeabilized되었습니다. 차단 된 후, 샘플은 8-OHdG 및 γH2AX에 대한 1 차 적인 항체로 조사되었다. 시료는 그 때 세척하고 이차 항체로 배양하였다. 결과 심상은 형광 현미경 검사의 밑에 관찰되고 ImageJ를 사용하여 정량화되었습니다. 결과는 PM2.5에서 EOM이 제브라피시 배아의 심장에 있는 8-OHdG 및 γH2AX 신호를 현저하게 향상했다는 것을 보여줍니다. 그러나, NAC는 반응성 산소 종(ROS) 폐포제로 작용하여 EOM 유도 DNA 손상을 부분적으로 중화하였다. 여기서, 우리는 제브라피시 배아의 심장에서 환경 화학 유발 단백질 발현 변화의 검출에 적용될 수 있는 PM2.5-유도된심장 결함에서 DNA 손상의 역할을 조사하기 위한 면역형성 프로토콜을 제시한다.

이러한 면역형분석법은 환경 화학물질에 노출된 제브라피시 배아의 심장에서 단백질 발현 변화를 측정하는 민감하고 구체적인 방법입니다.
본 대표적인 분석에서, 항산화 NAC의 부재 또는 존재시 PM2.5에 노출된 배아는 심장 기형의 존재에 대해 평가하였다(도1). 관찰된 바와 같이, PM2.5로부터EO...

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Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts

이 프로토콜은 면역 형광 분석기를 사용하여 제브라피시 배아의 해부 된 심장에서 PM2.5-유도 된 DNA 손상을 감지합니다.

면역 형광을 사용하여 제브라피시 배아 심장에서 PM2.5-유도 된 DNA 손상을 감지합니다.

Ambient fine particulate matter (PM2.5) exposure can lead to cardiac developmental toxicity but the underlying molecular mechanisms are still unclear. ...

이 방법은 제브라피시 심장에서 표적 단백질의 발현을 정확하고 쉽게 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 표적 단백질의 변화는 면역 형광을 측정하여 직접 검출됩니다. 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 제브라피시 배아 수집 및 치료를 수행합니다.72 시간 후 수정, 유리 슬라이드에 배아를 전송하고 스테레오 현미경으로 관찰. 심근 부종, 변경 된 반복 및 감소 된 크기와 같은 심장 기형을 기록하십시오. 기형 비율을 계산하고 터키의 다중 비교 테스트 다음에 ANOVA를 사용하여 그룹 간의 차이를 분석합니다.밀리리터 MS222당 0.6밀리그램으로 배아를 마취한 후 30초 동안 하트비트를 기록하고 Image J 소프트웨어를 사용하여 심박수를 정량화합니다. 스테레오 현미경 의 밑에 일회용 주사기 바늘로 얼룩말 물고기 배아에서 조심스럽게 심혼을 해부합니다. 소수성 장벽 펜을 사용하여 깨끗한 유리 슬라이드에 원을 그립니다.PBS의 1.25 마이크로리터에 4%의 파라포름알데히드50마이크로리터를 추가한 다음, 해부된 3개의 하트를 하나의 소수성 장벽 원에 넣고 실온에서 20분 동안 배양합니다. 현미경의 밑에 용액을 데크로하고 적어도 5 분 동안 실온에서 샘플을 건조. PBST에서 슬라이드를 세 번 세척당 5분간 세척합니다.50 마이크로리터의 BSA를 PBST 1, 000 마이크로리터에 추가하여 5%BSA 용액을 확보하고, 비특이적 항체 결합을 차단하기 위해 습한 챔버에서 슬라이드를 1시간 동안 배양한다. 액액을 데수수고 PBS로 시료를 세척당 5분간 3회 세척합니다. 8-하이드록시데옥시구아노신에 대한 마우스 단일클론 항체 2개와 PBST의 296마이크로리터에서 감마-H2AX에 대한 토끼 폴리클론 항체 2개의 마이크로리터를 희석하여 1차 항체 칵테일 용액을 확보하였다.심장 샘플을 1차 항체 칵테일 용액 50마이크로리터로 실내 온도에서 최소 1시간 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 가습된 챔버에 배양합니다. 용액을 데수제하고 세척당 5분 동안 PBST로 샘플을 세 번 세척합니다. FITC 표지염소 이차 항체 1개와 Psy-3 염소 항토끼 이차 항체 1개를 PBST 의 500 마이크로리터에 희석하여 이차 항체 칵테일 용액을 확보한다.어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 이차 항체와 샘플을 배양. 액액을 데수수고 PBS로 시료를 세척당 5분간 3회 세척합니다. 핵 염색을 위해 샘플에 DAPI 20 마이크로리터를 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.슬라이드에 커버 슬립을 바르고 매니큐어로 밀봉하여 건조와 움직임을 방지합니다. 형광 현미경의 밑에 견본을 심상하고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 심부지역의 형광 신호를 정량화합니다. DMSO 제어 샘플의 평균을 사용하여 상대적 변화를 계산하고 데이터의 통계적 유의여부를 결정합니다.항산화제의 부재 또는 존재시 PM 2.5에 노출된 배아, N-아세틸-L-시스테인 또는 NAC는 심장 기형의 존재를 평가하였다. PM 2.5로부터EOM은 DMSO 대조군 처리 된 심장에 비해 심근 부종, 변경 된 반복 및 감소 된 크기와 같은 심장 성각 발생에 상당한 증가를 요합니다. 심박수는 또한 EOM에 드러난 태아에서 현저하게 감소했습니다.NAC의 추가 감쇠 EOM 유도 심장 결함. 면역형광 분석은 EOM 처리된 조직에서 DNA 손상의 정도를 평가하기 위하여 이용되었습니다. 8-하이드록시데옥시구아노신과 감마-H2AX 발현의 수준은 EOM으로 치료된 제브라피시 배아의 심장에서 크게 증가하여 각각 산화 DNA 손상과 DNA 이중 가닥 파손의 증가를 나타낸다.EOM 유도 된 DNA 손상은 NAC 보충에 의해 부분적으로 중화되었다. 이 프로토콜을 시도 할 때, 제브라피쉬 심장이 슬라이드를 벗겨 낼 수 있기 때문에 PBS로 샘플을 세척 할 때주의하십시오.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

배아 마우스 마음에 면역 형광을 이용하여 심근 개발 분석

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

연구

발생학

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Zebrafish의 배아에 주입 마이크로 비드

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

상처 스크래치 분석의 최적화 가용성 담배 연기 추출물에 의한 손상 후 쥐 중간 엽 기질 세포 이동의 변화를 감지 할

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

라이브 Zebrafish의 배아에서 유사 분열 부문 및 역학을 관찰

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

해제 배아 마음에 관상 동맥 혈관의 분석

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

분석, 동적, 안정과 초기 Microtubules Zebrafish 태아에 있는 Immunolabeling의 사용

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM와 Microrheology Zebrafish 태아 노른자위 셀에

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Zebrafish 태아에 있는 세포 Photoconversion 통해 다음 Endocardial 조직 움직임

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

토끼 모형에 있는 최적 배아 단계에서 최소 침 습 배아 이식 및 배아 확산

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...