Name: using immunofluorescence to detect pm2.5-induced dna damage in zebrafish embryo hearts
Uploaded: 2021-02-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Nature Sciences Foundation of China (Grant number: 81870239, 81741005, 81972999) og The Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.

Vill type sebrafisk (AB) som ble brukt i denne studien ble hentet fra National Zebrafish Resource Center i Wuhan, Kina. Alle dyreprosedyrer som er skissert her, er gjennomgått og godkjent av Dyrepleieinstitusjonen ved Etikkutvalget ved Soochow University.
1. PM2.5 prøvetaking og organisk sammensatt ekstraksjon
MERK: PM2.5 ble samlet inn i et urbant område i Suzhou, Kina, 1-7 august 2015, som beskrevet tidligere5.
<o...

<ol>
	<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Exposure+to+Air+Pollution+and+Risk+of+Congenital+Heart+Defects.">Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects.</a> European Journal of Pediatrics. 175, 1520 (2016).</li><li>Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+exposure+to+PM2.5+and+Congenital+Heart+Diseases+in+Taiwan.">Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan.</a> The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).</li><li>Mesquita, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+assessment+of+urban+atmospheric+particle-bound+PAHs:+relevance+of+composition+and+particle+size+in+Barcelona+(Spain).">Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain).</a> Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+AhR+and+wnt/beta-catenin+signal+pathways+in+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos.">Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).</li><li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-organ+toxicity+induced+by+fine+particulate+matter+PM2.5+in+zebrafish+(Danio+rerio)+model.">Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model.</a> Chemosphere. 180, 24-32 (2017).</li><li>Lorda-Diez, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+senescence,+apoptosis+and+DNA+damage+cooperate+in+the+remodeling+processes+accounting+for+heart+morphogenesis.">Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis.</a> Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).</li><li>Kouassi, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+induced+in+A549+cells+by+physically+and+chemically+characterized+air+particulate+matter+(PM2.5)+collected+in+Abidjan,+Cote+d'Ivoire.">Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire.</a> Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).</li><li>Gualtieri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+A549+cells+exposed+to+Milan+PM2.5.">Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5.</a> Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).</li><li>Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+glycation+endproduct+induces+ROS+accumulation,+apoptosis,+MAP+kinase+activation+and+nuclear+O-GlcNAcylation+in+human+cardiac+myocytes.">Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes.</a> Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).</li><li>Yamashita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+zebrafish+development.">Apoptosis in zebrafish development.</a> Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry &amp; Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).</li><li>Moazzen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acetylcysteine+prevents+congenital+heart+defects+induced+by+pregestational+diabetes.">N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes.</a> Cardiovascular Diabetology. 13, 46 (2014).</li><li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetylcysteine,+reactive+oxygen+species+and+beyond.">N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 9, 109-110 (2010).</li><li>Tu, S., Chi, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+in+cardiac+development+and+congenital+heart+birth+defects.">Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects.</a> Differentiation. 84, 4-16 (2012).</li><li>Asnani, A., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+tool+to+identify+novel+therapies+for+human+cardiovascular+disease.">The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7, 763-767 (2014).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+effects+of+polychlorinated+biphenyls+on+cardiac+development+in+zebrafish.">Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish.</a> Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).</li><li>Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+particulate+matter+from+cigarette+smoke+disrupts+vascular+development+in+zebrafish+brain+(Danio+rerio).">Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio).</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).</li><li>Ren, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AHR-mediated+ROS+production+contributes+to+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos.">AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> The Science of the Total Environment. 719, 135097 (2020).</li><li>van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+consensus+on+cardiac+regeneration.">An emerging consensus on cardiac regeneration.</a> Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).</li><li>Yue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+folic+acid+on+PM2.5-induced+cardiac+developmental+toxicity+in+zebrafish+embryos+by+targeting+AhR+and+Wnt/beta-catenin+signal+pathways.">Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways.</a> Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).</li><li>Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+nanoparticles+induce+oxidative+DNA+damage+and+ROS-triggered+mitochondria-mediated+apoptosis+in+zebrafish+embryos.">Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos.</a> Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).</li><li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity,+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish.">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+effects+on+glutathione-S-transferase+activity+induced+by+atrazine+exposure+in+zebrafish+(Danio+rerio).">DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).</li></ol>

Selv om sebrafisk er en utmerket virveldyrmodell for å studere hjerteutviklingstoksisiteten til miljøkjemikalier, på grunn av den lille størrelsen på embryohjertet, er det vanskelig å skaffe nok protein til vestlig blotanalyse. Derfor presenterer vi en sensitiv immunfluorescensmetode for å kvantifisere proteinuttrykksnivåene av DNA-skadebiomarkører i hjertene til sebrafiskembryoer utsatt for PM2.5.
Under disseksjonen er det viktig å holde hjertets integritet intakt. Vår e...

Luftforurensning er nå et alvorlig miljøproblem verden står overfor. Omgivende fint svevestøv (PM2.5), som er en av de viktigste indikatorene for luftkvalitet, kan bære et stort antall skadelige stoffer og komme inn i blodsirkulasjonssystemet, noe som forårsaker alvorlig skade på menneskers helse1. Epidemiologi studier har vist at PM2.5 eksponering kan føre til økt risiko for medfødte hjertefeil (CHDs)2,3. Bevis fra dyreforsøk viste også at PM2.5 kan forårsake unormal hjerteutvikling i sebrafiskembryoer og avkom av mus, men de molekylære mekanismene for hjerteutviklingstoksisiteten til PM2.5 er fortsatt stort sett ukjent4,5,6.
DNA-skade kan forårsake cellesyklusstans og indusere apoptose, noe som i stor grad kan ødelegge potensialet til stamceller og dermed svekkehjerteutviklingen 7). Det er godt dokumentert at miljøgifter, inkludert PM2.5, har potensial til å angripe DNA gjennom oksidative stressmekanismer8,9. Både menneskelig og sebrafisk hjerteutvikling er følsom for oksidativt stress10,11,12. 8-OHdG er en oksidativ DNA-skademarkør, og γH2AX-signal er en markør for DNA-dobbeltstrengsbrudd. N-acetyl-L-cystein (NAC), en syntetisk forløper for intracellulær cystein og glutathione, er mye brukt som en antioksidantforbindelse. I denne studien bruker vi NAC til å undersøke rollen som oksidativt stress i PM2.5- indusert DNA-skade13.
Sebrafisk som modell vertebrat har blitt mye brukt til å studere hjerteutvikling og menneskelige kardiovaskulære sykdommer fordi mekanismer for hjerteutvikling er høyt bevart blant vertebrater14,15. Fordelene ved å bruke sebrafisk som modell inkluderer deres lille størrelse, sterke reproduktive evne og lave fôringskostnader. Av spesiell interesse for disse studiene er sebrafisk embryoer ikke avhengige av sirkulasjonssystemet under tidlig utvikling og kan overleve alvorlighjertefeildannelse 14. Videre tillater deres gjennomsiktighet hele kroppen å bli direkte observert under et mikroskop. Dermed gir sebrafiskembryoer en enestående mulighet til å vurdere molekylære mekanismer som er involvert i induksjon av hjerteutviklingstoksisitet som følge av eksponering for ulike miljøkjemikalier5,16,17. Vi har tidligere rapportert at PM2,5-indusertoksidativt stress fører til DNA-skade og apoptose, noe som resulterer i hjerte misdannelser i sebrafisk18. I denne studien gir vi en detaljert protokoll for undersøkelse av PM2,5-indusertDNA-skade i hjertet av sebrafiskembryoer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-OHdG Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, USA</td>
			<td>sc-66036</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorius,China</td>
			<td>BSA124S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Solarbio,Beijing,China</td>
			<td>SW3015</td>
			<td>For blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam, USA</td>
			<td>ab104139</td>
			<td>For nuclear counterstain.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Solarbio,Beijing,China</td>
			<td>D8371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>IX73</td>
			<td>For imaging fluorescence signals/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG Cy3</td>
			<td>Carlsbad,USA</td>
			<td>CW0159</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG FITC</td>
			<td>Carlsbad,USA</td>
			<td>RS0003</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine(NAC)</td>
			<td>Adamas-Beta, Shanghai, China</td>
			<td>616-91-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>QILINBEIER,China</td>
			<td>TS-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma,China</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Make 4% paraformaldehyde for fixation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>HyClone,USA</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>Prepare 0.1% Tween in PBS for washing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM2.5 sampler</td>
			<td>TianHong,Wuhan, China</td>
			<td>TH-150C</td>
			<td>For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Re-circulating aquaculture system</td>
			<td>HaiSheng,Shanghai,China</td>
			<td></td>
			<td>The zebrafish was maintained in it.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soxhlet extractor</td>
			<td>ZhengQiao,Shanghai, China</td>
			<td>BSXT-02</td>
			<td>For organic components extraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon,Canada</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td>For heart dissection from zebrafish embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (MS222)</td>
			<td>Sigma,China</td>
			<td>E10521</td>
			<td>To anesthetize zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma,China</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;H2AX Antibody</td>
			<td>Abcam, USA</td>
			<td>ab26350</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using immunofluorescence to detect pm2.5-induced dna damage in zebrafish embryo hearts

Omgivende fint svevestøv (PM2.5) eksponering kan føre til hjerteutviklingstoksisitet, men de underliggende molekylære mekanismene er fortsatt uklare. 8-hydroksy-2'deoksygenase (8-OHdG) er en markør for oksidativ DNA-skade og γH2AX er en følsom markør for DNA-dobbeltstrengsbrudd. I denne studien hadde vi som mål å oppdage PM2,5-induserte8-OHdG- og γH2AX-endringer i hjertet av sebrafiskembryoer ved hjelp av en immunfluorescensanalyse. Sebrafiskembryoer ble behandlet med ekstraherbare organiske stoffer (EOM) fra PM2,5 ved 5 μg/ml i nærvær eller fravær av antioksidant N-acetyl-L-cystein (NAC, 0,25 μM) ved 2 timers etterbefruktning (hpf). DMSO ble brukt som kjøretøykontroll. Ved 72 hkf ble hjerter dissekert fra embryoer ved hjelp av en sprøytenål og festet og permeabilisert. Etter å ha blitt blokkert, ble prøver undersøkt med primære antistoffer mot 8-OHdG og γH2AX. Prøver ble deretter vasket og inkubert med sekundære antistoffer. De resulterende bildene ble observert under fluorescensmikroskopi og kvantifisert ved hjelp av ImageJ. Resultatene viser at EOM fra PM2,5 signifikant forbedret 8-OHdG- og γH2AX-signaler i hjertet av sebrafiskembryoer. Nac, som fungerer som en reaktiv oksygenart (ROS) scavenger, motvirket imidlertid delvis den EOM-induserte DNA-skaden. Her presenterer vi en immunfluorescence protokoll for å undersøke rollen som DNA-skade i PM2.5-induserte hjertefeil som kan brukes på påvisning av miljøkjemisk-indusert protein uttrykk endringer i hjertene til sebrafisk embryoer.

Denne immunfluorescensanalysen er en sensitiv og spesifikk metode for måling av proteinuttrykksendringer i hjertene til sebrafiskembryoer utsatt for miljøkjemikalier.
I denne representative analysen ble embryoer utsatt for PM2.5 i fravær eller tilstedeværelse av antioksidanten NAC evaluert for tilstedeværelsen av hjertefeil (figur 1). Som observert forårsaket EOM fra PM2.5</sub...

Watch this Scientific Journal Video about Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts at JoVE.com

Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts

Denne protokollen bruker en immunfluorescensanalyse for å oppdage PM2,5-indusertDNA-skade i dissekerte hjerter av sebrafiskembryoer.

Bruke immunfluorescens for å oppdage PM2,5-indusertDNA-skade i sebrafisk embryohjerter

Ambient fine particulate matter (PM2.5) exposure can lead to cardiac developmental toxicity but the underlying molecular mechanisms are still unclear. ...

Denne metoden kan brukes til å nøyaktig og enkelt oppdage uttrykket av målproteiner i sebrafiskhjertet. Endringen i målproteinet oppdages direkte ved å måle immunfluorescens. Utfør sebrafisk embryosamling og -behandling, som beskrevet i tekstmanuskriptet.På 72 timer etter befruktning, overfør embryoene til glasssklier, og observere dem under et stereomikroskop. Registrer hjertefeil, for eksempel perikardødem, endret løkke og redusert størrelse. Beregn misdannelsesrater og analyser forskjeller mellom grupper på en måte ANOVA, etterfulgt av Tyrkias multippel sammenligningstest.Etter bedøvelse av embryoene med 0,6 milligram per milliliter MS222 registrerer du hjerteslag i 30 sekunder og kvantifiserer hjertefrekvensen ved hjelp av Image J-programvare. Disseker hjerter forsiktig fra sebrafiskembryoene med en engangs sprøytenål under et stereomikroskop. Bruk en hydrofob barrierepenn til å tegne en sirkel på et rent glasssklie.Tilsett 50 mikroliter 4% paraformaldehyd til 1,25 mikroliter PBS for å lage en fikseringsløsning, legg deretter tre dissekerte hjerter i en hydrofob barrieresirkel og inkuber i 20 minutter ved romtemperatur. Dekanter løsningen under mikroskopet og tørk prøvene ved romtemperatur i minst fem minutter. Vask lysbildene tre ganger i PBST i fem minutter per vask.Tilsett 50 mikroliter BSA til 1000 mikroliter PBST for å få en 5% BSA-løsning, og inkuber lysbildene i et fuktig kammer i en time for å blokkere ikke-spesifikk antistoffbinding. Dekanter løsningen og vask prøvene tre ganger med PBS i fem minutter per vask. Fortynn to mikroliter musmonokrin antistoff mot 8-hydroksydeoksyguanosin og to mikroliter kaninpolyklonalt antistoff mot gamma-H2AX i 296 mikroliter PBST for å oppnå en fungerende primær antistoffcocktailløsning.Inkuber hjerteprøvene med 50 mikroliter av den primære antistoffcocktailløsningen i et fuktet kammer i minst en time ved romtemperatur eller over natten ved fire grader Celsius. Dekanter oppløsningen og vask prøvene tre ganger med PBST i fem minutter per vask. Fortynn en mikroliter fitc-merket geit anti-mus sekundært antistoff og en mikroliter psy-3 geit anti-kanin sekundært antistoff i 500 mikroliter PBST for å oppnå en fungerende sekundær antistoff cocktail løsning.Inkuber prøvene med sekundære antistoffer i en time ved romtemperatur i mørket. Dekanter løsningen og vask prøvene tre ganger med PBS i fem minutter per vask. Tilsett 20 mikroliter DAPI i prøvene for kjernefysisk farging, og inkuber dem i 30 minutter ved romtemperatur.Påfør en dekselglidning på lysbildet og forsegle det med neglelakk for å forhindre tørking og bevegelse. Bilde prøvene under et fluorescensmikroskop og kvantifisere fluorescerende signalet fra hjerteområdet ved hjelp av ImageJ-programvare. Beregn de relative endringene ved hjelp av gjennomsnittet av DMSO-kontrolleksemplene, og bestem den statistiske betydningen av dataene.Embryoer eksponert for PM 2.5 i fravær eller tilstedeværelse av antioksidant, N-acetyl-L-cystein, eller NAC, ble evaluert for tilstedeværelse av hjerte misdannelser. EOM fra PM 2.5 kostet en betydelig økning i hjerteteatogenese, som perikardødem, endret looping og redusert størrelse, sammenlignet med DMSO-kontrollbehandlede hjerter. Hjertefrekvensen ble også signifikant redusert i embryoer eksponert for EOM.Tilsetning av NAC svekket EOM-induserte hjertefeil. En immunfluorescensanalyse ble brukt til å evaluere omfanget av DNA-skade i EOM-behandlet vev. Nivåene av 8-hydroksydeoksyguanosin og gamma-H2AX-uttrykk ble betydelig økt i hjertene til sebrafiskembryoer behandlet med EOM, noe som indikerer en økning i henholdsvis oksidativ DNA-skade og DNA-dobbeltstrengbrudd.Den EOM-induserte DNA-skaden ble delvis motvirket av NAC-tilskudd. Når du prøver denne protokollen, må du være forsiktig når du vasker prøvene med PBS, fordi sebrafiskhjertet kan skrelle av lysbildet.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse av cardiomyocyte Development hjelp Immunfluorescens i Embryonic Mouse Hjerte

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Mikro Implantasjon i sebrafisk Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Optimalisering av Wound Scratch analysen å oppdage endringer i Murint Mesenchymale stromal Cell Migration Etter Skade ved Løselig sigarettrøyk Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging subcellulære strukturer i Living Sebrafisk Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Observerer Mitotisk divisjon og Dynamics i en Live Sebrafisk Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Analyse av koronarkar i Slettet embryonale Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Bruk av Immunolabeling å analysere stabil, dynamisk og gryende piskehale som henger i sebrafisk Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM og Microrheology i sebrafisk Embryo eggeplomme cellen

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Følgende Endocardial vev bevegelser via celle Photoconversion i sebrafisk Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Minimalt invasiv embryo Transfer og embryo vitrifikasjon på optimal embryo Stage i Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...