Name: using immunofluorescence to detect pm2.5-induced dna damage in zebrafish embryo hearts
Uploaded: 2021-02-15T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias de la Naturaleza de China (número de subvención: 81870239, 81741005, 81972999) y el Desarrollo del Programa Académico Prioritario de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu.

El pez cebra de tipo salvaje (AB) utilizado en este estudio se obtuvo del Centro Nacional de Recursos de Pez Cebra en Wuhan, China. Todos los procedimientos de animales descritos aquí han sido revisados y aprobados por la Institución de Cuidado Animal del Comité de Ética de la Universidad de Soochow.
1. Muestreo de PM2.5 y extracción de compuestos orgánicos
NOTA: PM2.5 se recolectó en un área urbana en Suzhou, China, del 1 al 7 de agosto ...

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	<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Exposure+to+Air+Pollution+and+Risk+of+Congenital+Heart+Defects.">Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects.</a> European Journal of Pediatrics. 175, 1520 (2016).</li><li>Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+exposure+to+PM2.5+and+Congenital+Heart+Diseases+in+Taiwan.">Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan.</a> The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).</li><li>Mesquita, S. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+induced+in+A549+cells+by+physically+and+chemically+characterized+air+particulate+matter+(PM2.5)+collected+in+Abidjan,+Cote+d'Ivoire.">Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire.</a> Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).</li><li>Gualtieri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+A549+cells+exposed+to+Milan+PM2.5.">Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5.</a> Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).</li><li>Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+glycation+endproduct+induces+ROS+accumulation,+apoptosis,+MAP+kinase+activation+and+nuclear+O-GlcNAcylation+in+human+cardiac+myocytes.">Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes.</a> Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).</li><li>Yamashita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+zebrafish+development.">Apoptosis in zebrafish development.</a> Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry &amp; Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).</li><li>Moazzen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acetylcysteine+prevents+congenital+heart+defects+induced+by+pregestational+diabetes.">N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes.</a> Cardiovascular Diabetology. 13, 46 (2014).</li><li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetylcysteine,+reactive+oxygen+species+and+beyond.">N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 9, 109-110 (2010).</li><li>Tu, S., Chi, N. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+tool+to+identify+novel+therapies+for+human+cardiovascular+disease.">The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7, 763-767 (2014).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+effects+of+polychlorinated+biphenyls+on+cardiac+development+in+zebrafish.">Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish.</a> Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).</li><li>Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+particulate+matter+from+cigarette+smoke+disrupts+vascular+development+in+zebrafish+brain+(Danio+rerio).">Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio).</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).</li><li>Ren, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AHR-mediated+ROS+production+contributes+to+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos.">AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> The Science of the Total Environment. 719, 135097 (2020).</li><li>van Berlo, J. H., Molkentin, J. 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Aunque el pez cebra es un excelente modelo de vertebrados para estudiar la toxicidad del desarrollo cardíaco de los productos químicos ambientales, debido al pequeño tamaño del corazón embrionario, es difícil obtener suficiente proteína para el análisis de western blot. Por lo tanto, presentamos un método de inmunofluorescencia sensible para cuantificar los niveles de expresión de proteínas de los biomarcadores de daño al ADN en los corazones de embriones de pez cebra expuestos a PM2.5.
<p clas...

La contaminación del aire es ahora un grave problema ambiental que enfrenta el mundo. Las partículas finas ambientales (PM2.5),que es uno de los indicadores más importantes de la calidad del aire, pueden transportar una gran cantidad de sustancias nocivas y entrar en el sistema circulatorio de la sangre, causando graves daños a la salud humana1. Los estudios epidemiológicos han demostrado que la exposición a PM2.5 puede conducir a un mayor riesgo de defectos cardíacos congénitos (CHD)2,3. La evidencia de experimentos con animales también mostró que PM2.5 puede causar un desarrollo cardíaco anormal en embriones de pez cebra y la descendencia de ratones, pero los mecanismos moleculares de la toxicidad del desarrollo cardíaco de PM2.5 aún se desconocen en gran medida4,5,6.
El daño en el ADN puede causar la detención del ciclo celular e inducir apoptosis, lo que puede destruir ampliamente el potencial de las células progenitoras y, en consecuencia, afectar el desarrollo del corazón7). Se ha documentado bien que los contaminantes ambientales, incluyendo PM2.5,tienen el potencial de atacar el ADN a través de mecanismos de estrés oxidativo8,9. Tanto el desarrollo cardíaco humano como el pez cebra son sensibles al estrés oxidativo10,11,12. 8-OHdG es un marcador de daño oxidativo del ADN, y la señal γH2AX es un marcador de roturas de doble cadena de ADN. La N-acetil-L-cisteína (NAC), un precursor sintético de la cisteína intracelular y el glutatión, es ampliamente utilizado como compuesto antioxidante. En este estudio, utilizamos NAC para investigar el papel del estrés oxidativo en PM2.5- daño inducido por el ADN13.
El pez cebra como vertebrado modelo ha sido ampliamente utilizado para estudiar el desarrollo cardíaco y las enfermedades cardiovasculares humanas porque los mecanismos del desarrollo cardíaco están altamente conservados entre los vertebrados14,15. Las ventajas de usar el pez cebra como modelo incluyen su pequeño tamaño, fuerte capacidad reproductiva y bajo costo de alimentación. De particular interés para estos estudios, los embriones de pez cebra no dependen del sistema circulatorio durante el desarrollo temprano y pueden sobrevivir a una malformación cardíaca grave14. Además, su transparencia permite observar directamente todo el cuerpo bajo un microscopio. Por lo tanto, los embriones de pez cebra brindan una excelente oportunidad para evaluar los mecanismos moleculares involucrados en la inducción de la toxicidad del desarrollo cardíaco como resultado de la exposición a diversos productos químicos ambientales5,16,17. Hemos informado previamente que el estrés oxidativo inducido por PM2.5conduce al daño del ADN y la apoptosis, lo que resulta en malformaciones cardíacas en el pez cebra18. En este estudio, proporcionamos un protocolo detallado para investigar el daño al ADN inducido por PM2.5en el corazón de embriones de pez cebra.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-OHdG Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, USA</td>
			<td>sc-66036</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorius,China</td>
			<td>BSA124S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Solarbio,Beijing,China</td>
			<td>SW3015</td>
			<td>For blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam, USA</td>
			<td>ab104139</td>
			<td>For nuclear counterstain.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Solarbio,Beijing,China</td>
			<td>D8371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>IX73</td>
			<td>For imaging fluorescence signals/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG Cy3</td>
			<td>Carlsbad,USA</td>
			<td>CW0159</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG FITC</td>
			<td>Carlsbad,USA</td>
			<td>RS0003</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine(NAC)</td>
			<td>Adamas-Beta, Shanghai, China</td>
			<td>616-91-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>QILINBEIER,China</td>
			<td>TS-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma,China</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Make 4% paraformaldehyde for fixation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>HyClone,USA</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>Prepare 0.1% Tween in PBS for washing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM2.5 sampler</td>
			<td>TianHong,Wuhan, China</td>
			<td>TH-150C</td>
			<td>For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Re-circulating aquaculture system</td>
			<td>HaiSheng,Shanghai,China</td>
			<td></td>
			<td>The zebrafish was maintained in it.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soxhlet extractor</td>
			<td>ZhengQiao,Shanghai, China</td>
			<td>BSXT-02</td>
			<td>For organic components extraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon,Canada</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td>For heart dissection from zebrafish embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (MS222)</td>
			<td>Sigma,China</td>
			<td>E10521</td>
			<td>To anesthetize zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma,China</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;H2AX Antibody</td>
			<td>Abcam, USA</td>
			<td>ab26350</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using immunofluorescence to detect pm2.5-induced dna damage in zebrafish embryo hearts

La exposición a partículas finas ambientales (PM2.5)puede conducir a toxicidad para el desarrollo cardíaco, pero los mecanismos moleculares subyacentes aún no están claros. La 8-hidroxi-2'desoxigenasa (8-OHdG) es un marcador de daño oxidativo del ADN y γH2AX es un marcador sensible para las roturas de doble cadena del ADN. En este estudio, nuestro objetivo fue detectar cambios en PM2.5-inducidos por 8-OHdG y γH2AX en el corazón de embriones de pez cebra utilizando un ensayo de inmunofluorescencia. Los embriones de pez cebra fueron tratados con materia orgánica extraíble (EOM) a partir de PM2.5 a 5 μg/mL en presencia o ausencia de antioxidante N-acetil-L-cisteína (NAC, 0.25 μM) a las 2 h después de la fertilización (hpf). DMSO se utilizó como control de vehículos. A 72 hpf, los corazones se diseccionaron de embriones usando una aguja de jeringa y se fijaron y permeabilizaron. Después de ser bloqueadas, las muestras fueron sondeada con anticuerpos primarios contra 8-OHdG y γH2AX. Las muestras se lavaron e incubaron con anticuerpos secundarios. Las imágenes resultantes se observaron bajo microscopía de fluorescencia y se cuantificaron utilizando ImageJ. Los resultados muestran que la OMA de PM2.5 mejoró significativamente las señales 8-OHdG y γH2AX en el corazón de los embriones de pez cebra. Sin embargo, NAC, actuando como un eliminador de especies reactivas de oxígeno (ROS), contrarrestó parcialmente el daño del ADN inducido por la OMA. Aquí, presentamos un protocolo de inmunofluorescencia para investigar el papel del daño en el ADN en los defectos cardíacos inducidos por PM2.5que se pueden aplicar a la detección de cambios en la expresión de proteínas inducidas por químicos ambientales en los corazones de embriones de pez cebra.

Este ensayo de inmunofluorescencia es un método sensible y específico para medir los cambios en la expresión de proteínas en los corazones de embriones de pez cebra expuestos a productos químicos ambientales.
En este análisis representativo, se evaluaron embriones expuestos a PM2.5 en ausencia o presencia del antioxidante NAC para la presencia de malformaciones cardíacas (Figura 1)...

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Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts

Este protocolo utiliza un ensayo de inmunofluorescencia para detectar el daño en el ADN inducido por PM2.5en los corazones disecados de embriones de pez cebra.

Uso de la inmunofluorescencia para detectar el daño al ADN inducido por PM2.5en corazones de embriones de pez cebra

Ambient fine particulate matter (PM2.5) exposure can lead to cardiac developmental toxicity but the underlying molecular mechanisms are still unclear. ...

Este método se puede utilizar para detectar con precisión y facilidad la expresión de proteínas objetivo en el corazón del pez cebra. El cambio en la proteína diana se detecta directamente midiendo la inmunofluorescencia. Realizar la recolección y el tratamiento de embriones de pez cebra, como se describe en el texto manuscrito.A las 72 horas después de la fertilización, transfiera los embriones a portaobjetos de vidrio y obsérquelos bajo un microscopio estereoscópico. Registre malformaciones cardíacas, como edema pericárdico, alteración del bucle y disminución del tamaño. Calcule las tasas de malformación y analice las diferencias entre los grupos utilizando ANOVA unidireccional, seguido de la prueba de comparación múltiple de Turquía.Después de anestesiar los embriones con 0,6 miligramos por mililitro MS222, registre los latidos del corazón durante 30 segundos y cuantifique las frecuencias cardíacas utilizando el software Image J. Diseccione cuidadosamente los corazones de los embriones de pez cebra con una aguja de jeringa desechable bajo un microscopio estereoscópico. Use una pluma de barrera hidrofóbica para dibujar un círculo en un portaobjetos de vidrio limpio.Agregue 50 microlitros de paraformaldehído al 4% a 1,25 microlitros de PBS para hacer una solución fijadora, luego coloque tres corazones disecados en un círculo de barrera hidrofóbico e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente. Decantar la solución bajo el microscopio y secar las muestras a temperatura ambiente durante al menos cinco minutos. Lave los portaobjetos tres veces en PBST durante cinco minutos por lavado.Agregue 50 microlitros de BSA a 1, 000 microlitros de PBST para obtener una solución de BSA al 5%, e incube los portaobjetos en una cámara húmeda durante una hora para bloquear la unión de anticuerpos no específicos. Decantar la solución y lavar las muestras tres veces con PBS durante cinco minutos por lavado. Diluir dos microlitros de anticuerpo monoclonal de ratón contra 8-hidroxidesoxiguanosina y dos microlitros de anticuerpo policlonal de conejo contra gamma-H2AX en 296 microlitros de PBST para obtener una solución de cóctel de anticuerpos primarios en funcionamiento.Incubar las muestras de corazón con 50 microlitros de la solución de cóctel de anticuerpos primarios en una cámara humidificada durante al menos una hora a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados centígrados. Decantar la solución y lavar las muestras tres veces con PBST durante cinco minutos por lavado. Diluya un microlitro de anticuerpo secundario anti-ratón de cabra marcado con FITC y un microlitro de anticuerpo secundario anti-conejo de cabra psy-3 en 500 microlitros de PBST para obtener una solución de cóctel de anticuerpos secundarios en funcionamiento.Incubar las muestras con los anticuerpos secundarios durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Decantar la solución y lavar las muestras tres veces con PBS durante cinco minutos por lavado. Agregue 20 microlitros de DAPI a las muestras para la tinción nuclear e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.Aplique un resbalón de cubierta al portaobjetos y séllelo con esmalte de uñas para evitar el secado y el movimiento. Imagine las muestras bajo un microscopio de fluorescencia y cuantifique la señal fluorescente del área del corazón utilizando el software ImageJ. Calcule los cambios relativos utilizando el promedio de las muestras de control DMSO y determine la significación estadística de los datos.Los embriones expuestos a PM 2.5 en ausencia o presencia del antioxidante, N-acetil-L-cisteína, o NAC, fueron evaluados para detectar la presencia de malformaciones cardíacas. La OMA de PM 2.5 costó un aumento significativo en la teratogénesis cardíaca, como edema pericárdico, asa alterada y disminución del tamaño, en comparación con los corazones tratados con DMSO-control. La frecuencia cardíaca también disminuyó significativamente en embriones expuestos a la OMA.Adición de defectos cardíacos inducidos por la OMA atenuada por NAC. Se utilizó un ensayo de inmunofluorescencia para evaluar el alcance del daño en el ADN en los tejidos tratados con OMA. Los niveles de 8-hidroxidesoxiguanosina y la expresión de gamma-H2AX aumentaron significativamente en los corazones de embriones de pez cebra tratados con EOM, lo que indica un aumento en el daño oxidativo del ADN y las roturas de doble cadena de ADN, respectivamente.El daño del ADN inducido por la OMA fue parcialmente contrarrestado por la suplementación con NAC. Al intentar este protocolo, tenga cuidado al lavar las muestras con PBS, ya que el corazón del pez cebra puede desprenderse del portaobjetos.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Análisis para el Desarrollo de los cardiomiocitos mediante inmunofluorescencia en el corazón de embriones de ratón

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microbead Implantación en el embrión de pez cebra

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Optimización del ensayo arañazos herida para detectar cambios en Murino mesenquimales estromales migración de células después de daño por Soluble Extracto humo del cigarrillo

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

La observación de la división mitótica y dinámica en un embrión de pez cebra en vivo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Análisis de los vasos coronarios en los corazones embrionarias aclarados

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Uso de inmunomarcación para analizar microtúbulos estables, dinámicos y emergente en el embrión de pez cebra

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM y Microrheology en la celda de yema de embrión de pez cebra

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Siguientes movimientos de tejido endocárdico vía Photoconversion de la célula en el embrión de pez cebra

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Transferencia de embriones mínimamente invasiva y vitrificación de embriones en la etapa óptima del embrión en el modelo Rabbit

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...