Name: using immunofluorescence to detect pm2.5-induced dna damage in zebrafish embryo hearts
Uploaded: 2021-02-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Nature Sciences Foundation of China (Anslagsnummer: 81870239, 81741005, 81972999) och Den prioriterade akademiska programutvecklingen för Jiangsu Lärosäten.

Zebrafisk av vild typ (AB) som används i denna studie erhölls från National Zebrafish Resource Center i Wuhan, Kina. Alla djurförsök som beskrivs här har granskats och godkänts av Djurvårdsinstitutionen vid Soochow Universitys etikkommitté.
1. PM2.5 provtagning och extraktion av organiska föreningar
OBS: PM2.5 samlades in i ett stadsområde i Suzhou, Kina, 1-7 augusti 2015, som beskrivits tidigare5.
<ol><li>G...

<ol>
	<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Exposure+to+Air+Pollution+and+Risk+of+Congenital+Heart+Defects.">Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects.</a> European Journal of Pediatrics. 175, 1520 (2016).</li><li>Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+exposure+to+PM2.5+and+Congenital+Heart+Diseases+in+Taiwan.">Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan.</a> The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).</li><li>Mesquita, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+assessment+of+urban+atmospheric+particle-bound+PAHs:+relevance+of+composition+and+particle+size+in+Barcelona+(Spain).">Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain).</a> Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+AhR+and+wnt/beta-catenin+signal+pathways+in+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos.">Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).</li><li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-organ+toxicity+induced+by+fine+particulate+matter+PM2.5+in+zebrafish+(Danio+rerio)+model.">Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model.</a> Chemosphere. 180, 24-32 (2017).</li><li>Lorda-Diez, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+senescence,+apoptosis+and+DNA+damage+cooperate+in+the+remodeling+processes+accounting+for+heart+morphogenesis.">Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis.</a> Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).</li><li>Kouassi, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+induced+in+A549+cells+by+physically+and+chemically+characterized+air+particulate+matter+(PM2.5)+collected+in+Abidjan,+Cote+d'Ivoire.">Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire.</a> Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).</li><li>Gualtieri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+A549+cells+exposed+to+Milan+PM2.5.">Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5.</a> Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).</li><li>Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+glycation+endproduct+induces+ROS+accumulation,+apoptosis,+MAP+kinase+activation+and+nuclear+O-GlcNAcylation+in+human+cardiac+myocytes.">Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes.</a> Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).</li><li>Yamashita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+zebrafish+development.">Apoptosis in zebrafish development.</a> Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry &amp; Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).</li><li>Moazzen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acetylcysteine+prevents+congenital+heart+defects+induced+by+pregestational+diabetes.">N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes.</a> Cardiovascular Diabetology. 13, 46 (2014).</li><li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetylcysteine,+reactive+oxygen+species+and+beyond.">N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 9, 109-110 (2010).</li><li>Tu, S., Chi, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+in+cardiac+development+and+congenital+heart+birth+defects.">Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects.</a> Differentiation. 84, 4-16 (2012).</li><li>Asnani, A., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+tool+to+identify+novel+therapies+for+human+cardiovascular+disease.">The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7, 763-767 (2014).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+effects+of+polychlorinated+biphenyls+on+cardiac+development+in+zebrafish.">Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish.</a> Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).</li><li>Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+particulate+matter+from+cigarette+smoke+disrupts+vascular+development+in+zebrafish+brain+(Danio+rerio).">Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio).</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).</li><li>Ren, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AHR-mediated+ROS+production+contributes+to+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos.">AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> The Science of the Total Environment. 719, 135097 (2020).</li><li>van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+consensus+on+cardiac+regeneration.">An emerging consensus on cardiac regeneration.</a> Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).</li><li>Yue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+folic+acid+on+PM2.5-induced+cardiac+developmental+toxicity+in+zebrafish+embryos+by+targeting+AhR+and+Wnt/beta-catenin+signal+pathways.">Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways.</a> Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).</li><li>Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+nanoparticles+induce+oxidative+DNA+damage+and+ROS-triggered+mitochondria-mediated+apoptosis+in+zebrafish+embryos.">Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos.</a> Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).</li><li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity,+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish.">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+effects+on+glutathione-S-transferase+activity+induced+by+atrazine+exposure+in+zebrafish+(Danio+rerio).">DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).</li></ol>

Även om zebrafisk är en utmärkt ryggradsdjursmodell för att studera miljökemikaliernas hjärtutvecklingstoxicitet, på grund av embryohjärtats lilla storlek, är det svårt att få tillräckligt med protein för västerländsk fläckanalys. Därför presenterar vi en känslig immunofluorescensmetod för kvantifiering av proteinuttrycksnivåerna för DNA-skador biomarkörer i hjärtat på zebrafiskembryon som utsätts för PM2,5.
Under dissekering är det viktigt att hålla hj?...

Luftföroreningar är nu ett allvarligt miljöproblem som världen står inför. Omgivande fina partiklar (PM2.5), som är en av de viktigaste indikatorerna på luftkvalitet, kan bära ett stort antal skadliga ämnen och komma in i blodcirkulationssystemet, vilket orsakar allvarlig skada på människors hälsa1. Epidemiologiska studier har visat att PM2, 5 exponering kan leda till en ökad risk för medfödda hjärtfel (CHDs)2,3. Bevis från djurförsök visade också att PM2,5 kan orsaka onormal hjärtutveckling hos zebrafiskembryon och avkomman till möss men de molekylära mekanismerna i hjärtutvecklingstoxiciteten hos PM2,5 är fortfarande till stor delokänd 4,5,6.
DNA-skador kan orsaka cellcykelstopp och inducera apoptos, vilket i stor utsträckning kan förstöra potentialen hos stamceller och därmed försämra hjärtutvecklingen7). Det har väl dokumenterats att miljöföroreningar, inklusive PM2,5, har potential att attackera DNA genom oxidativastressmekanismer 8,9. Både mänskliga och zebrafisk hjärt utveckling är känsliga för oxidativ stress10,11,12. 8-OHdG är en oxidativ DNA-skademarkör, och γH2AX-signal är en markör för DNA-dubbla strandbrott. N-acetyl-L-cystein (NAC), en syntetisk föregångare till intracellulär cystein och glutation, används ofta som en antioxidantförening. I denna studie använder vi NAC för att undersöka oxidativ stress i PM2.5- inducerad DNA-skada13.
Zebrafisk som modell ryggradsdjur har använts i stor utsträckning för att studera hjärtutveckling och mänskliga hjärt-kärlsjukdomar eftersom mekanismer för hjärtutveckling är mycket bevarade bland ryggradsdjur14,15. Fördelarna med att använda zebrafisk som modell inkluderar deras lilla storlek, starka reproduktiva förmåga och låga utfodringskostnader. Av särskilt intresse för dessa studier är zebrafiskembryon inte beroende av cirkulationssystemet under tidig utveckling och kan överleva allvarlig hjärtmissbildning14. Dessutom gör deras transparens att hela kroppen kan observeras direkt under ett mikroskop. Zebrafiskembryon ger således en enastående möjlighet att bedöma de molekylära mekanismer som är involverade i induktion av hjärtutvecklingstoxicitet till följd av exponering för olikamiljökemikalier 5,16,17. Vi har tidigare rapporterat att PM2,5-induceradoxidativ stress leder till DNA-skador och apoptos, vilket resulterar i hjärtmissbildningar i zebrafisk18. I denna studie tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för att undersöka PM2,5-induceradDNA-skada i hjärtat av zebrafiskembryon.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-OHdG Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, USA</td>
			<td>sc-66036</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorius,China</td>
			<td>BSA124S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Solarbio,Beijing,China</td>
			<td>SW3015</td>
			<td>For blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam, USA</td>
			<td>ab104139</td>
			<td>For nuclear counterstain.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Solarbio,Beijing,China</td>
			<td>D8371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>IX73</td>
			<td>For imaging fluorescence signals/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG Cy3</td>
			<td>Carlsbad,USA</td>
			<td>CW0159</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG FITC</td>
			<td>Carlsbad,USA</td>
			<td>RS0003</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine(NAC)</td>
			<td>Adamas-Beta, Shanghai, China</td>
			<td>616-91-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>QILINBEIER,China</td>
			<td>TS-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma,China</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Make 4% paraformaldehyde for fixation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>HyClone,USA</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>Prepare 0.1% Tween in PBS for washing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM2.5 sampler</td>
			<td>TianHong,Wuhan, China</td>
			<td>TH-150C</td>
			<td>For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Re-circulating aquaculture system</td>
			<td>HaiSheng,Shanghai,China</td>
			<td></td>
			<td>The zebrafish was maintained in it.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soxhlet extractor</td>
			<td>ZhengQiao,Shanghai, China</td>
			<td>BSXT-02</td>
			<td>For organic components extraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon,Canada</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td>For heart dissection from zebrafish embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (MS222)</td>
			<td>Sigma,China</td>
			<td>E10521</td>
			<td>To anesthetize zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma,China</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;H2AX Antibody</td>
			<td>Abcam, USA</td>
			<td>ab26350</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using immunofluorescence to detect pm2.5-induced dna damage in zebrafish embryo hearts

Omgivande fina partiklar (PM2,5) exponering kan leda till hjärt utvecklingstoxicitet men de underliggande molekylära mekanismerna är fortfarande oklart. 8-hydroxy-2'deoxygenas (8-OHdG) är en markör för oxidativ DNA-skada och γH2AX är en känslig markör för DNA dubbelsträngsbrott. I denna studie syftade vi till att upptäcka PM2,5-inducerad8-OHdG och γH2AX förändringar i hjärtat av zebrafiskembryon med hjälp av en immunofluorescensanalys. Zebrafiskembryon behandlades med extrakterbara organiska ämnen (EOM)från PM 2, 5 vid 5 μg/ml i närvaro eller frånvaro av antioxidant N-acetyl-L-cystein (NAC, 0, 25 μM) vid 2 h efter befruktning (hpf). DMSO användes som fordonskontroll. Vid 72 hpf dissekerades hjärtan från embryon med hjälp av en spruta nål och fasta och permeabilized. Efter att ha blockerats undersöktes prover med primära antikroppar mot 8-OHdG och γH2AX. Prover tvättades och inkuberades sedan med sekundära antikroppar. De resulterande bilderna observerades under fluorescensmikroskopi och kvantifierades med ImageJ. Resultaten visar att EOM från PM2,5 avsevärt förbättrade 8-OHdG- och γH2AX-signaler i hjärtat av zebrafiskembryon. NAC, som fungerar som en reaktiv syreart (ROS) asätare, motverkade dock delvis den EOM-inducerade DNA-skadan. Här presenterar vi ett immunofluorescensprotokoll för att undersöka DNA-skadans roll i PM2,5-induceradehjärtfel som kan tillämpas på detektion av miljömässiga kemiskt inducerade proteinuttrycksförändringar i hjärtat på zebrafiskembryon.

Denna immunofluorescensanalys är en känslig och specifik metod för att mäta proteinuttrycksförändringar i hjärtan hos zebrafiskembryon som exponeras för miljökemikalier.
I denna representativa analys utvärderades embryon som exponerats för PM2,5 i avsaknad eller närvaro av antioxidanten NAC för närvaro av hjärtmissbildningar (figur 1). Som observerats orsakade EOM från PM<...

Watch this Scientific Journal Video about Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts at JoVE.com

Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts

Detta protokoll använder en immunofluorescensanalys för att upptäcka PM2,5-induceradDNA-skada i de dissekerade hjärtana hos zebrafiskembryon.

Använda Immunofluorescence för att upptäcka PM2.5-induceradDNA-skada i Zebrafish Embryo Hearts

Ambient fine particulate matter (PM2.5) exposure can lead to cardiac developmental toxicity but the underlying molecular mechanisms are still unclear. ...

Denna metod kan användas för att noggrant och enkelt upptäcka uttrycket av målproteiner i zebrafiskhjärtat. Förändringen i målproteinet detekteras direkt genom mätning av immunfluorescens. Utför zebrafiskembryonsamling och behandling, enligt beskrivningen i textmanuskriptet.Vid 72 timmar efter befruktning, överför embryona till glasrutschbanor och observera dem under ett stereomikroskop. Registrera hjärtfel, såsom perikardell ödem, förändrad looping och minskad storlek. Beräkna missbildningsfrekvenser och analysera skillnader mellan grupper på ett sätt ANOVA, följt av Turkiets flerfaldiga jämförelsetest.Efter att ha bedövat embryona med 0,6 milligram per milliliter MS222, registrera hjärtslag i 30 sekunder och kvantifiera hjärtfrekvenser med image J-programvara. Dissekera noggrant hjärtan från zebrafiskembryon med en engångsspruta under ett stereomikroskop. Använd en hydrofobisk barriärpenna för att rita en cirkel på en ren glasrutschbana.Tillsätt 50 mikroliter 4%paraformaldehyd till 1,25 mikroliter PBS för att göra en fixativ lösning, placera sedan tre dissekerade hjärtan i en hydrofobisk barriärcirkel och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur. Dekanta lösningen under mikroskopet och torka proverna vid rumstemperatur i minst fem minuter. Tvätta bilderna tre gånger i PBST i fem minuter per tvätt.Tillsätt 50 mikroliter BSA till 1 000 mikroliter PBST för att få en 5%BSA-lösning och inkubera bilderna i en fuktig kammare i en timme för att blockera icke-specifik antikroppsbindning. Dekanta lösningen och tvätta proverna tre gånger med PBS i fem minuter per tvätt. Späd två mikroliter mus monoklonal antikropp mot 8-hydroxydeoxyguanosin och två mikroliter kanin polyklonal antikropp mot gamma-H2AX i 296 mikroliter PBST för att erhålla en fungerande primär antikropp cocktaillösning.Inkubera hjärtproverna med 50 mikroliter av den primära antikroppscocktaillösningen i en fuktad kammare i minst en timme vid rumstemperatur eller över natten vid fyra grader Celsius. Dekanta lösningen och tvätta proverna tre gånger med PBST i fem minuter per tvätt. Späd en mikroliter av FITC-märkt get antimus sekundär antikropp och en mikroliter psy-3 get antikanin sekundär antikropp i 500 mikroliter PBST för att få en fungerande sekundär antikropp cocktaillösning.Inkubera proverna med de sekundära antikropparna i en timme vid rumstemperatur i mörker. Dekanta lösningen och tvätta proverna tre gånger med PBS i fem minuter per tvätt. Tillsätt 20 mikroliter DAPI till proverna för kärnfärgning och inkubera dem i 30 minuter vid rumstemperatur.Applicera ett täckstill på rutschkanan och försegla det med nagellack för att förhindra torkning och rörelse. Avbilda proverna under ett fluorescensmikroskop och kvantifiera hjärtområdets fluorescerande signal med ImageJ-programvara. Beräkna de relativa förändringarna med hjälp av medelvärdet av DMSO-kontrollproverna och bestäm uppgifternas statistiska signifikans.Embryon som exponerades för PM 2, 5 i avsaknad eller närvaro av antioxidanten, N-acetyl-L- cystein, eller NAC, utvärderades för förekomst av hjärtmissbildningar. EOM från PM 2,5 kostade en betydande ökning av hjärt teratogenes, såsom perikardial ödem, förändrad looping och minskad storlek, jämfört med DMSO-kontroll behandlade hjärtan. Hjärtfrekvensen minskade också signifikant hos embryon som exponerades för EOM.Tillägg av NAC försvagade EOM-inducerad hjärtfel. En immunofluorescensanalys användes för att utvärdera omfattningen av DNA-skador i EOM-behandlade vävnader. Nivåerna av 8-hydroxydeoxyguanosin och gamma-H2AX uttryck ökade avsevärt i hjärtan av zebrafisk embryon behandlas med EOM, vilket tyder på en ökning av oxidativ DNA-skador respektive DNA dubbel strand bryter, respektive.EOM-inducerad DNA-skador motverkades delvis av NAC tillskott. När du försöker detta protokoll, var försiktig när du tvättar proverna med PBS, eftersom zebrafiskhjärtat kan skala av bilden.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analys av cardiomyocyte Development använder Immunfluorescens i embryonal Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microbead Implantation i zebrafisk embryot

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Optimering av sår Scratch analys för att upptäcka förändringar i Murine Mesenkymala Stromal Cell Migration Efter Skador av lösliga cigarett rökextrakt

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging subcellulära strukturer i vardagsZebraFish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Observation Mitotisk Division och dynamik i en Live Zebrafisk Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Analys av kranskärlen i clearade embryonala hjärtan

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Användning av Immunolabeling att analysera stabil, dynamisk och begynnande mikrotubuli i zebrafiskar embryot

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM och Microrheology i cellen zebrafiskar Embryo äggula

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Följande endokardiella vävnad rörelser via Cell Photoconversion i zebrafiskar embryot

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Minimalinvasiv embryoöverföring och embryo-förglasning vid det optimala embryonala steget i Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...