Name: using immunofluorescence to detect pm2.5-induced dna damage in zebrafish embryo hearts
Uploaded: 2021-02-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts at JoVE.com

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe numarası: 81870239, 81741005, 81972999) ve Jiangsu Yükseköğretim Kurumlarının Öncelikli Akademik Program Geliştirilmesi tarafından desteklendi.

Bu çalışmada kullanılan yabani tip zebra balığı (AB), Çin'in Wuhan kentindeki Ulusal Zebra Balığı Kaynak Merkezi'nden elde edilmiştir. Burada özetlenen tüm hayvan prosedürleri Soochow Üniversitesi Etik Kurulu Hayvan Bakım Kurumu tarafından incelenmiş ve onaylanmıştır.
1. PM2.5 örnekleme ve organik bileşik ekstraksiyon
NOT: PM2.5, daha önce açıklandığı gibi 1-7 Ağustos 2015 tarihleri arasında Suzhou, Çin'de kentsel...

<ol>
	<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Exposure+to+Air+Pollution+and+Risk+of+Congenital+Heart+Defects.">Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects.</a> European Journal of Pediatrics. 175, 1520 (2016).</li><li>Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+exposure+to+PM2.5+and+Congenital+Heart+Diseases+in+Taiwan.">Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan.</a> The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).</li><li>Mesquita, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+assessment+of+urban+atmospheric+particle-bound+PAHs:+relevance+of+composition+and+particle+size+in+Barcelona+(Spain).">Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain).</a> Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+AhR+and+wnt/beta-catenin+signal+pathways+in+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos.">Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).</li><li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-organ+toxicity+induced+by+fine+particulate+matter+PM2.5+in+zebrafish+(Danio+rerio)+model.">Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model.</a> Chemosphere. 180, 24-32 (2017).</li><li>Lorda-Diez, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+senescence,+apoptosis+and+DNA+damage+cooperate+in+the+remodeling+processes+accounting+for+heart+morphogenesis.">Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis.</a> Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).</li><li>Kouassi, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+induced+in+A549+cells+by+physically+and+chemically+characterized+air+particulate+matter+(PM2.5)+collected+in+Abidjan,+Cote+d'Ivoire.">Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire.</a> Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).</li><li>Gualtieri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+A549+cells+exposed+to+Milan+PM2.5.">Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5.</a> Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).</li><li>Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+glycation+endproduct+induces+ROS+accumulation,+apoptosis,+MAP+kinase+activation+and+nuclear+O-GlcNAcylation+in+human+cardiac+myocytes.">Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes.</a> Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).</li><li>Yamashita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+zebrafish+development.">Apoptosis in zebrafish development.</a> Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry &amp; Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).</li><li>Moazzen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acetylcysteine+prevents+congenital+heart+defects+induced+by+pregestational+diabetes.">N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes.</a> Cardiovascular Diabetology. 13, 46 (2014).</li><li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetylcysteine,+reactive+oxygen+species+and+beyond.">N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 9, 109-110 (2010).</li><li>Tu, S., Chi, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+in+cardiac+development+and+congenital+heart+birth+defects.">Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects.</a> Differentiation. 84, 4-16 (2012).</li><li>Asnani, A., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+tool+to+identify+novel+therapies+for+human+cardiovascular+disease.">The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7, 763-767 (2014).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+effects+of+polychlorinated+biphenyls+on+cardiac+development+in+zebrafish.">Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish.</a> Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).</li><li>Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+particulate+matter+from+cigarette+smoke+disrupts+vascular+development+in+zebrafish+brain+(Danio+rerio).">Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio).</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).</li><li>Ren, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AHR-mediated+ROS+production+contributes+to+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos.">AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> The Science of the Total Environment. 719, 135097 (2020).</li><li>van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+consensus+on+cardiac+regeneration.">An emerging consensus on cardiac regeneration.</a> Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).</li><li>Yue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+folic+acid+on+PM2.5-induced+cardiac+developmental+toxicity+in+zebrafish+embryos+by+targeting+AhR+and+Wnt/beta-catenin+signal+pathways.">Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways.</a> Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).</li><li>Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+nanoparticles+induce+oxidative+DNA+damage+and+ROS-triggered+mitochondria-mediated+apoptosis+in+zebrafish+embryos.">Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos.</a> Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).</li><li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity,+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish.">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+effects+on+glutathione-S-transferase+activity+induced+by+atrazine+exposure+in+zebrafish+(Danio+rerio).">DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).</li></ol>

Zebra balığı, embriyo kalbinin küçük boyutu nedeniyle çevresel kimyasalların kardiyak gelişimsel toksisitesini incelemek için mükemmel bir omurgalı modeli olmasına rağmen, batı leke analizi için yeterli protein elde etmek zordur. Bu nedenle, PM2.5'emaruz kalan zebra balığı embriyolarının kalplerindeki DNA hasarı biyobelirteçlerinin protein ekspresyon seviyelerini ölçmek için hassas bir immünofluoresans yöntemi sunuyoruz.
Diseksiyon sırasında kalbin büt...

Hava kirliliği artık dünyanın karşı karşıya olduğu ciddi bir çevre sorunudur. Hava kalitesinin en önemli göstergelerinden biri olan ortam ince partikül maddesi (PM2.5),çok sayıda zararlı madde taşıyabilir ve kan dolaşım sistemine girerek insan sağlığına ciddi zararlar verebilir1. Epidemiyoloji çalışmaları PM2.5 maruziyetinin doğumsal kalp kusurları (CHD)2,3riskinin artmasına yol açabileceğini göstermiştir. Hayvan deneylerinden elde edilen kanıtlar, PM2.5'in zebra balığı embriyolarında ve farelerin yavrularında anormal kardiyak gelişime neden olabileceğini göstermiştir, ancak PM2.5'in kardiyak gelişimsel toksisitesinin moleküler mekanizmaları hala büyük ölçüde bilinmemektedir4,5,6.
DNA hasarı hücre döngüsünün tutuklanmasına neden olabilir ve apoptoza neden olabilir, bu da progenitör hücrelerin potansiyelini büyük ölçüde yok edebilir ve sonuç olarak kalp gelişimini bozabilir7). PM2.5de dahil olmak üzere çevresel kirleticilerinoksidatifstres mekanizmaları 8,9aracılığıyla DNA'ya saldırma potansiyeline sahip olduğu iyi belgelenmiştir. Hem insan hem de zebra balığı kardiyak gelişimi oksidatif strese karşı hassastır10,11,12. 8-OHdG oksidatif bir DNA hasar belirtecidir ve φH2AX sinyali DNA çift iplikçik kırılmalarının bir işaretidir. Hücre içi sistein ve glutatyonun sentetik öncüsü olan N-asetil-L-sistein (NAC), yaygın olarak anti-oksidatif bileşik olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmada, PM2.5'teoksidatif stresin rolünü araştırmak için NAC kullanıyoruz - indüklenmiş DNA hasarı13.
Zebra balığı bir model omurgalı olarak kardiyak gelişimi ve insan kardiyovasküler hastalıklarını incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır, çünkü kardiyak gelişim mekanizmaları omurgalılar arasında yüksek oranda korunmaktadır14,15. Zebra balıklarını model olarak kullanmanın avantajları arasında küçük boyutları, güçlü üreme yetenekleri ve düşük beslenme maliyeti bulunur. Bu çalışmaların özellikle ilgisini çeken zebra balığı embriyoları erken gelişim sırasında dolaşım sistemine bağlı değildir ve şiddetli kalp malformasyonunda hayatta kalabilir14. Ayrıca, saydamlıkları tüm vücudun doğrudan mikroskop altında gözlemlenmesine izin verir. Bu nedenle, zebra balığı embriyoları, çeşitli çevresel kimyasallara maruz kalmanın bir sonucu olarak kardiyak gelişimsel toksisitenin indüksiyonunda yer alan moleküler mekanizmaları değerlendirmek için olağanüstü bir fırsat sağlar5,16,17. Daha önce PM2.5kaynaklı oksidatif stresin DNA hasarına ve apoptoza yol açtığını ve zebra balıklarında kalp malformasyonlarına neden olduğunu bildirmiştik18. Bu çalışmada zebra balığı embriyolarının kalbinde pm2.5kaynaklı DNA hasarının araştırılması için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-OHdG Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, USA</td>
			<td>sc-66036</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorius,China</td>
			<td>BSA124S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Solarbio,Beijing,China</td>
			<td>SW3015</td>
			<td>For blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam, USA</td>
			<td>ab104139</td>
			<td>For nuclear counterstain.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Solarbio,Beijing,China</td>
			<td>D8371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>IX73</td>
			<td>For imaging fluorescence signals/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG Cy3</td>
			<td>Carlsbad,USA</td>
			<td>CW0159</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG FITC</td>
			<td>Carlsbad,USA</td>
			<td>RS0003</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine(NAC)</td>
			<td>Adamas-Beta, Shanghai, China</td>
			<td>616-91-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>QILINBEIER,China</td>
			<td>TS-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma,China</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Make 4% paraformaldehyde for fixation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>HyClone,USA</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>Prepare 0.1% Tween in PBS for washing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM2.5 sampler</td>
			<td>TianHong,Wuhan, China</td>
			<td>TH-150C</td>
			<td>For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Re-circulating aquaculture system</td>
			<td>HaiSheng,Shanghai,China</td>
			<td></td>
			<td>The zebrafish was maintained in it.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soxhlet extractor</td>
			<td>ZhengQiao,Shanghai, China</td>
			<td>BSXT-02</td>
			<td>For organic components extraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon,Canada</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td>For heart dissection from zebrafish embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (MS222)</td>
			<td>Sigma,China</td>
			<td>E10521</td>
			<td>To anesthetize zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma,China</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;H2AX Antibody</td>
			<td>Abcam, USA</td>
			<td>ab26350</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using immunofluorescence to detect pm2.5-induced dna damage in zebrafish embryo hearts

Ortam ince partikül madde (PM2.5)maruziyeti kardiyak gelişimsel toksisiteye yol açabilir, ancak altta yatan moleküler mekanizmalar hala belirsizdir. 8-hidroksi-2'deoksijenaz (8-OHdG) oksidatif DNA hasarının bir belirtecidir ve φH2AX DNA çift iplikçik kırılmaları için hassas bir belirteçtir. Bu çalışmada zebra balığı embriyolarının kalbindeki PM2.5kaynaklı 8-OHdG ve φH2AX değişikliklerinin immünofluoresans tahlilini kullanarak tespit edilmesi amaçlanmıştır. Zebra balığı embriyoları,2 saat sonra döllenme (hpf) sırasında antioksidan N-asetil-L-sistein (NAC, 0.25 μM) varlığında veya yokluğunda PM 2.5'ten 5 μg/mL'de çıkarılabilir organik konularla (EOM) tedavi edildi. DMSO araç kontrolü olarak kullanıldı. 72 hpf'de kalpler şırınga iğnesi kullanılarak embriyolardan parçalandı ve sabitlendi ve permeabilize edildi. Bloke edildikten sonra, örnekler 8-OHdG ve φH2AX'a karşı primer antikorlarla araştırıldı. Numuneler daha sonra ikincil antikorlarla yıkandı ve inkübe edildi. Elde edilen görüntüler floresan mikroskopisi altında gözlemlendi ve ImageJ kullanılarak ölçülmedi. Sonuçlar, PM2.5'ten EOM'nin zebra balığı embriyolarının kalbinde 8-OHdG ve φH2AX sinyallerini önemli ölçüde artırdığını göstermektedir. Bununla birlikte, reaktif bir oksijen türü (ROS) çöpçü olarak hareket eden NAC, EOM kaynaklı DNA hasarına kısmen karşı koydu. Burada, zebra balığı embriyolarının kalplerindeki çevresel kimyasal kaynaklı protein ekspresyon değişikliklerinin tespitine uygulanabilecek PM2.5kaynaklı kalp kusurlarında DNA hasarının rolünü araştırmak için bir immünofluoresans protokolü sunuyoruz.

Bu immünoresans tahlili, çevresel kimyasallara maruz kalan zebra balığı embriyolarının kalplerindeki protein ekspresyon değişikliklerini ölçmek için hassas ve spesifik bir yöntemdir.
Bu temsili analizde, antioksidan NAC'nin yokluğunda veya varlığında PM2.5'e maruz kalan embriyolar kalp malformasyonlarının varlığı açısından değerlendirildi (Şekil 1). Gözlendiği...

Watch this Scientific Journal Video about Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts at JoVE.com

Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts

Bu protokol, zebra balığı embriyolarının parçalanmış kalplerinde PM2.5kaynaklı DNA hasarını tespit etmek için bir immünofluoresans testi kullanır.

Zebra Balığı Embriyo Kalplerinde PM2.5kaynaklı DNA Hasarını Tespit Etmek için İmmünofluoresans Kullanma

Ambient fine particulate matter (PM2.5) exposure can lead to cardiac developmental toxicity but the underlying molecular mechanisms are still unclear. ...

Bu yöntem, zebra balığı kalbindeki hedef proteinlerin ekspresyonunun doğru ve kolay bir şekilde tespit edilmesi için kullanılabilir. Hedef proteindeki değişim immünofluoresans ölçümü ile doğrudan tespit edilir. Metin el yazmasında açıklandığı gibi zebra balığı embriyo toplama ve tedavi gerçekleştirin.Döllenmeden 72 saat sonra embriyoları cam slaytlara aktarın ve stereo mikroskop altında gözlemleyin. Perikardiyal ödem, değiştirilmiş döngü ve küçülme boyutu gibi kalp malformasyonlarını kaydedin. Malformasyon oranlarını hesaplayın ve tek yönlü ANOVA kullanarak gruplar arasındaki farklılıkları analiz edin ve ardından Türkiye'nin çoklu karşılaştırma testi.Embriyoları mililitre MS222 başına 0,6 miligram ile uyuşturuyorktan sonra, 30 saniye boyunca kalp atışlarını kaydedin ve Image J yazılımını kullanarak kalp atışlarını ölçün. Stereo mikroskop altında tek kullanımlık şırınga iğnesi ile zebra balığı embriyolarından kalpleri dikkatlice inceleyin. Temiz bir cam kaydırağa daire çizmek için hidrofobik bir bariyer kalemi kullanın.Fiksatif bir çözüm yapmak için 1,25 pbs mikrolitresine% 4 paraformaldehitin 50 mikrolitresini ekleyin, ardından üç parçalanmış kalbi bir hidrofobik bariyer dairesine yerleştirin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın. Çözeltiyi mikroskop altında kurutun ve numuneleri oda sıcaklığında en az beş dakika kurutun. Slaytları PBST'de yıkama başına beş dakika boyunca üç kez yıkayın.%5 BSA çözeltisi elde etmek için 1.000 mikrolitre PBST'ye 50 mikrolitre BSA ekleyin ve spesifik olmayan antikor bağlamasını engellemek için slaytları nemli bir odada bir saat kuluçkaya yatırın. Çözeltiyi dekante edin ve numuneleri PBS ile üç kez yıkama başına beş dakika yıkayın. Çalışan bir birincil antikor kokteyl çözeltisi elde etmek için 8-hidroksideoksiguanosin'e karşı iki mikrolitre fare monoklonal antikorunu ve 296 pbst mikrolitresinde gama-H2AX'a karşı iki mikrolitre tavşan poliklonal antikorunu seyreltin.Kalp örneklerini, oda sıcaklığında veya dört santigrat derecede gece boyunca nemlendirilmiş bir odada 50 mikrolitre birincil antikor kokteyl çözeltisi ile kuluçkaya yatırın. Çözeltiyi dekante edin ve numuneleri PBST ile üç kez yıkama başına beş dakika yıkayın. Çalışan bir ikincil antikor kokteyl çözeltisi elde etmek için 500 pbst mikrolitresinde fitc etiketli keçi anti-fare ikincil antikorunun bir mikrolitresini ve bir mikrolitre psy-3 keçi anti-tavşan ikincil antikorun seyreltin.Örnekleri sekonder antikorlarla karanlıkta oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Çözeltiyi dekante edin ve numuneleri PBS ile üç kez yıkama başına beş dakika yıkayın. Nükleer boyama için numunelere 20 mikrolitre DAPI ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.Slayda bir kapak kayması uygulayın ve kurumasını ve hareketi önlemek için oje ile kapatın. Örnekleri floresan mikroskop altında görüntüleyin ve ImageJ yazılımını kullanarak kalp bölgesinin floresan sinyalini ölçün. DMSO denetim örneklerinin ortalamasını kullanarak göreli değişiklikleri hesaplayın ve verilerin istatistiksel önemini belirleyin.Antioksidan, N-asetil-L-sistein veya NAC'nin yokluğunda veya varlığında PM 2.5'e maruz kalan embriyolar kalp malformasyonlarının varlığı açısından değerlendirildi. PM 2.5'ten EOM, DMSO kontrolü ile tedavi edilen kalplere kıyasla perikardiyal ödem, değiştirilmiş döngü ve küçülme boyutu gibi kardiyak teratogenezde önemli bir artışa mal oldu. EOM'ye maruz kalan embriyolarda da kalp atış hızı önemli ölçüde azaldı.NAC zayıflatılmış EOM kaynaklı kalp kusurlarının eklenmesi. EOM ile tedavi edilen dokularda DNA hasarının boyutunu değerlendirmek için immünoresans testi kullanıldı. EOM ile tedavi edilen zebra balığı embriyolarının kalplerinde 8-hidroksideoksiguanosin ve gama-H2AX ekspresyozin düzeyleri önemli ölçüde artmış, bu da sırasıyla oksidatif DNA hasarında ve DNA çift iplikçik kırılmalarında artış olduğunu gösterir.EOM kaynaklı DNA hasarı NAC takviyesi ile kısmen etkisiz hale bırakıldı. Bu protokolü denerken, örnekleri PBS ile yıkarken dikkatli olun, çünkü zebra balığı kalbi slayttan soyulabilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Embriyonik Fare Heart Immunofluorescence kullanarak kardiyomiyosit Geliştirme Analizi

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Zebra balığı Embriyo microbead İmplantasyonu

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Yara Scratch Testi optimizasyonu Çözünür Sigara Duman Özü ile Hasar sonrası Fare Mezenkimal Stromal Hücre Göç Değişiklik Algılama

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Canlı Zebra balığı Embriyo Mitotik Bölümü ve Dinamikleri gözlemleme

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Temizlendi Embriyonik Kalpler Koroner Damarlar Analizi

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Zebra balığı embriyo, dinamik, kararlı ve doğmakta olan mikrotübüller analiz etmek için Immunolabeling kullanımı

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM ve Zebra balığı embriyo sarısı hücre Microrheology

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Zebra balığı embriyo hücre Photoconversion ile aşağıdaki Endocardial doku hareketleri

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

En düşük Invaziv embriyo transferi ve tavşan modelinde optimum embriyo aşamasında embriyo vitrifikasyon

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...