Name: refined clarity-based tissue clearing for three-dimensional fibroblast organization in healthy and injured mouse hearts
Uploaded: 2021-05-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts at JoVE.com

Forfatterne vil gerne anerkende CCHMC Confocal Imaging Core for deres hjælp og vejledning i udviklingen af denne model, samt Matt Batie fra Clinical Engineering for udformningen af alle 3D-trykte dele. Demetria Fischesser blev støttet af et uddannelsestilskud fra National Institutes of Health (NHLBI, T32 HL125204) og Jeffery D. Molkentin blev støttet af Howard Hughes Medical Institute.

Alle forsøg med mus blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på Cincinnati Children's Hospital Medical Center. Institutionen er også AAALAC (American Association for Akkreditering af Laboratory Animal Care) certificeret. Mus blev aflivet via cervikal dislokation, og mus, der gennemgik overlevelse kirurgiske procedurer fik smertelindring (se nedenfor). Alle metoder, der anvendes til smertebehandling og aktiv dødshjælp er baseret på anbefalinger fra panelet om aktiv dødshjælp af American...

<ol>
	<li>Nagaraju, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblast+phenotype+and+reversibility+of+fibrosis+in+patients+With+end-stage+heart+failure.">Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure.</a> Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).</li><li>Yoon, S., Eom, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+failure+with+preserved+ejection+fraction:+present+status+and+future+directions.">Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions.</a> Experimental and Molecular Medicine. 51 (12), 1-9 (2019).</li><li>Borlaug, B. A., Redfield, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diastolic+and+systolic+heart+failure+are+distinct+phenotypes+within+the+heart+failure+spectrum.">Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum.</a> Circulation. 123, 2006-2014 (2011).</li><li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+cardiac+fibroblast.">Defining the cardiac fibroblast.</a> Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+fibroblast+differentiated+states+underlie+scar+formation+in+the+infarcted+mouse+heart.">Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (5), 2127-2143 (2018).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Sadeghi, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+3D+cardiac+fibrotic+tissue+to+study+fibrotic+remodeling.">Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (11), 1601434 (2017).</li><li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+diverse+cardiac+cell+types+by+reprogramming+fibroblasts+with+cardiac+transcription+factors.">Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors.</a> Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).</li><li>Bruns, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+right+ventricular+fibroblast+secretome+drives+cardiomyocyte+dedifferentiation.">The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation.</a> PLoS One. 14 (8), 0220573 (2019).</li><li>Ski&#246;ldebrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+activation+of+human+cardiac+fibroblasts+leads+to+altered+calcium+signaling,+decreased+connexin+43+expression+and+increased+glutamate+secretion.">Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion.</a> Heliyon. 3 (10), 00406 (2017).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+pegasos+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method.</a> Cell Research. 28, 803-818 (2018).</li><li>Kolesov&#225;, H., &#268;apek, M., Radochov&#225;, B., Jan&#225;&#269;ek, J., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+tissue+clearing+methods+and+3D+imaging+techniques+for+visualization+of+GFP-expressing+mouse+embryos+and+embryonic+hearts.">Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).</li><li>Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+cardiac+injury+response+of+targeted+cell+populations+via+cleared+heart+three-dimensional+imaging.">Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+transparent+intact+cardiac+tissue+with+single-cell+resolution.">Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution.</a> Biomedical Optics Express. 9 (2), 423-436 (2018).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Yokoyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+sympathetic+hyperinnervation+and+denervation+after+myocardial+infarction+by+three-dimensional+assessment+of+the+cardiac+sympathetic+network+in+cleared+transparent+murine+hearts.">Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts.</a> PLoS One. 12 (7), 0182072 (2017).</li><li>Perbellini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-of-Acrylamide+SDS-based+Tissue+Clearing+(FASTClear)+for+three+dimensional+visualization+of+myocardial+tissue.">Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue.</a> Scientific Reports. 7, 5188 (2017).</li><li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling.">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li><li>Nehrhoff, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+in+CUBIC-cleared+mouse+heart+tissue:+going+deeper.">3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper.</a> Biomedical Optics Express. 7 (9), 3716-3720 (2016).</li><li>Yamamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+reporter+mouse+line+for+Cre-+and+FLP-dependent+lineage+analysis.">A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis.</a> Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).</li><li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+substances+to+laboratory+animals:+Routes+of+administration+and+factors+to+consider.">Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).</li><li>Means, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+1-phosphate+S1P2+and+S1P3+receptor-mediated+Akt+activation+protects+against+in+vivo+myocardial+ischemia-reperfusion+injury.">Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 292 (6), 2944-2951 (2007).</li><li>Michael, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+ischemia+and+reperfusion:+A+murine+model.">Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 269 (6), 2147-2154 (1995).</li><li>Ahn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+myocardial+infarcts+of+a+predictable+size+and+location+by+branch+pattern+probability-assisted+coronary+ligation+in+C57BL/6+mice.">Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice.</a> American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).</li><li>Patten, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+remodeling+in+a+mouse+model+of+myocardial+infarction.">Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 274 (5), 1812-1820 (1998).</li><li>Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+echocardiographic+assessment+of+left+ventricular+dimensions+and+function+after+myocardial+infarction+in+mice.">Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice.</a> Cardiovascular Research. 45 (2), 330-338 (2000).</li><li>Vagnozzi, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acute+immune+response+underlies+the+benefit+of+cardiac+stem+cell+therapy.">An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy.</a> Nature. 577, 405-409 (2020).</li><li>Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist+mechanics+of+the+left+ventricle.+Principles+and+application.">Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application.</a> Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 366-376 (2008).</li><li>Arts, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macroscopic+three-dimensional+motion+patterns+of+the+left+ventricle.">Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).</li><li>Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+muscle+actin-positive+cells+in+healing+human+myocardial+scars.">The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars.</a> American Journal of Pathology. 145 (4), 868-875 (1994).</li><li>Hashmi, S., Al-Salam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myocardial+infarction+and+myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+A+comparison.">Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison.</a> International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).</li></ol>

Denne artikel præsenterer en raffineret metode til vævsrydning, der giver mulighed for visualisering af hjertefibroblaster in vivo, både ved baseline og efter skade, for at karakterisere og bedre forstå fibroblaster i musehjertet. Denne udvidede protokol omhandler begrænsninger i eksisterende vævsrydningsprotokoller , der har forsøgt at identificere bestemte celletyper i voksent eller neonatalt hjerte12,13,14,<...

Selvom kardiomyocytter udgør den største volumenfraktion i hjertet, er hjertefibroblaster mere rigelige og er kritisk involveret i reguleringen af dette organs grundlæggende strukturelle og reparative træk. Hjertefibroblaster er meget mobile, mekanisk lydhøre og fænotypisk spænder afhængigt af omfanget af deres aktivering. Hjertefibroblaster er nødvendige for at opretholde normale niveauer af ekstracellulær matrix (ECM), og for lidt eller for meget ECM-produktion af disse celler kan føre til sygdom1,2,3. I betragtning af deres betydning i sygdom er hjertefibroblaster blevet et stadig vigtigere undersøgelsesemne til at identificere nye behandlingsstrategier, især i forsøget på at begrænse overdreven fibrose4,5,6,7. Ved skade aktiverer og differentierer fibroblaster sig til en mere syntetisk celletype kendt som en myofibroblast, som kan være proliferativ og udskille rigelig ECM, samt have kontraktil aktivitet, der hjælper med at ombygge ventriklerne.
Mens hjertefibroblaster er blevet grundigt evalueret for deres egenskaber i 2-D kulturer6,8,9,10, forstås meget mindre af deres egenskaber og dynamik i 3D levende hjerte, enten ved baseline eller med sygdomsstimulering. Her er en raffineret metode blevet beskrevet til væv rydde voksen mus hjertet og samtidig opretholde fluorescens af fibroblaster mærket med en Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer genetisk reporter system. I hjertet er Tcf21 en relativt specifik markør for hvilende fibroblaster4. Efter tamoxifen er givet for at aktivere det inducible MerCreMer protein, vil stort set alle hvilende fibroblaster permanent udtrykke forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP) fra Rosa26 locus, som giver mulighed for deres sporing in vivo.
Talrige veletablerede væv clearing protokoller findes, hvoraf nogle er blevet anvendt til hjertet11,12,13,14,15,16,17. Mange af de reagenser, der anvendes i forskellige vævsrydningsprotokoller, har imidlertid vist sig at slukke endogene fluorescenssignaler18. Derudover er det voksne hjerte svært at rydde på grund af rigelige heme gruppeholdige proteiner, der genererer autofluorescens19. Derfor var målet med denne protokol at bevare fibroblast markør fluorescens med samtidig hæmning af heme autofluorescens i det skadede voksne hjerte for optimal 3-D visualisering in vivo12,13,14,16,17,20.
Tidligere undersøgelser, der forsøgte at undersøge den anvendte hjertefibroblast in vivo perfunderede antistoffer til mærkning af disse celler, selv om sådanne undersøgelser var begrænset af antistofindtrængning og hjertevaskulær struktur14,16,17,20. Selv salamon et al. har vist væv clearing med vedligeholdelse af aktuelle neuronale fluorescens i neonatal hjerte, og Nehrhoff et al. har vist vedligeholdelse af fluorescens mærkning myeloid celler, vedligeholdelse af endogene fluorescens gennem hele ventrikelvæggen er endnu ikke blevet påvist, herunder visualisering af voksne hjerte fibroblaster ved baseline eller efter skade13,20. Denne vævsclearingprotokol forfiner en blanding af tidligere protokoller baseret på CLARITY-metoden (klar lipidbytteret acrylamid-hybridiseret stiv Imaging/immunostaining/in situ-hybridization-compatible tissue hydrogel) og PEGASOS (polyethylen glycol (PEG)-associeret opløsningsmiddelsystem). Denne raffinerede protokol tillod en mere robust undersøgelse af hjertefibroblaster i musehjertet ved baseline og af, hvordan de reagerer på forskellige typer skader. Protokollen er ligetil og reproducerbar og vil hjælpe med at karakterisere adfærden af hjertefibroblaster in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 braided silk</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K871H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-0 prolene</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8730H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiotensin II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9525-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial Tear Ointment</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>048272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D27802-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLUture topical tissue adhesive</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Start Analysis Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-osmotic pumps</td>
			<td>Alzet</td>
			<td>Model 1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements Analysis Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R HD upright microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal autoclaved chow</td>
			<td>Labdiet</td>
			<td>5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, 
			N&#39;-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide</td>
			<td>CosmoBio</td>
			<td>AXS-1002424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine Hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoinitiator</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>VA-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>Jax Stock No:012429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride solution</td>
			<td>Hospira, Inc.</td>
			<td>NDC 0409-4888-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen food</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>TD.130860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol, N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>122262-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoretic clearing chamber</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C30001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoretic clearing solution</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoresis tissue basket</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoresis tissue basket holder</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C12002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

refined clarity-based tissue clearing for three-dimensional fibroblast organization in healthy and injured mouse hearts

Hjerte-kar-sygdomme er den mest udbredte årsag til dødelighed på verdensplan og er ofte præget af øget hjertefibrose, der kan føre til øget ventrikelstivhed med ændret hjertefunktion. Denne stigning i hjerte ventrikulær fibrose skyldes aktivering af residente fibroblaster, selv om hvordan disse celler fungerer inden for 3-dimensionelle (3-D) hjerte, ved baseline eller efter aktivering, er ikke godt forstået. For at undersøge, hvordan fibroblaster bidrager til hjertesygdomme og deres dynamik i 3D-hjertet, blev der udviklet en raffineret KLARHED-baseret vævsclearing- og billeddannelsesmetode, der viser fluorescerende mærkede hjertefibroblaster i hele musehjertet. Væv bosiddende fibroblaster blev genetisk mærket ved hjælp af Rosa26-loxP-eGFP florescent reporter mus krydset med hjerte fibroblast udtrykke Tcf21-MerCreMer knock-in linje. Denne teknik blev brugt til at observere fibroblast lokalisering dynamik i hele voksne venstre hjertekammer i raske mus og i fibrotiske mus modeller af hjertesygdomme. Interessant, i en skade model, unikke mønstre af hjerte fibroblaster blev observeret i den skadede mus hjerte, der fulgte bands af indpakkede fibre i kontraktile retning. I iskæmiske skadesmodeller indtraf fibroblastdøden efterfulgt af en genopfyldning fra den infarkte grænsezone. Samlet set giver denne raffinerede hjertevævskonderingsteknik og digitaliserede billeddannelsessystem mulighed for 3D-visualisering af hjertefibroblaster i hjertet uden begrænsninger af antistofindtrængningssvigt eller tidligere problemer omkring tabt fluorescens på grund af vævsbehandling.

Hjertefibroblaster er afgørende for hjertets baselinefunktion såvel som for reaktion på hjerteskade. Tidligere forsøg på at forstå arrangementet og morfologien af disse celler er stort set blevet udført i 2D-indstillinger. Der er imidlertid blevet offentliggjort en raffineret hjertere væv clearing (Figur 2) og 3-D billedbehandling teknik, som giver mulighed for avanceret, mere detaljeret visualisering af hjerte fibroblaster. Med denne billeddannelse teknik, fibroblaster blev anset fo...

Watch this Scientific Journal Video about Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts at JoVE.com

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

En raffineret metode til væv clearing blev udviklet og anvendt på den voksne mus hjerte. Denne metode blev designet til at rydde tæt, autofluorescerende hjertevæv, samtidig med at mærket fibroblast fluorescens tilskrives en genetisk reporter strategi.

Raffineret KLARHED-baseret væv Clearing for tre-dimensionelle Fibroblast Organisation i sunde og sårede Mouse Hearts

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

Denne nye væv clearing protokol forbedrer eksisterende teknologi til at give mulighed for en mere præcis in vivo se på specifikke celletyper i hjertet og deres adfærd under skade betingelser. Denne protokol er hurtig og forholdsvis enkel. Det giver mulighed for vedligeholdelse af marca fluorescens med minimal interferens fra baggrundsvæv auto fluorescens uden at kræve celle eller væv farvning.Begynd med at bruge en 70% ethanol gennemblødt gazepude til at rense den eksperimentelle muss ventrale overflade. Brug kirurgisk saks til at lave et tre centimeter tværgående snit, cirka tre meter under xiphoidprocessen og deglove musen fra maven til xiphoidprocessen for at adskille huden fra det underliggende mavevægvæv. Lav et to centimeter tværgående snit i det subkutane bugvægsvæv, tre centimeter under xiphoidprocessen og lav et lodret snit fra dette snit op midterlinjen gennem brystkassen.Fastgør brystkassen tilbage for at afsløre hjertet. Og brug en 10-milliliter sprøjte udstyret med en 27 gauge nål til at injicere kolde PBS i den overlegne vena cava og aorta. Når alt blodet er blevet skyllet fra hjertet, skal du levere 10 milliliter kulde 4%PFA i den overlegne vena cava og aorta for at begynde fikseringsprocessen.Når alle de fikseringsmiddel er blevet blinket, punktafgifter hjertet og bruge en lige klinge skalpel til at adskille atri, højre ventrikel og septum og venstre hjertekammer. Placer hjertet i en 15-milliliter konisk rør af kulde 4%PFA for en overnatning inkubation ved fire grader celsius på en nutator. Næste morgen tilsættes en 0,25% fotoinitiativtageropløsning til en frisklavet hydrogelsopløsning og overfører hjertet til hydrogelen.Wrap det koniske rør i folie til en overnatning inkubation ved fire grader celsius uden fysisk forstyrrelse. Den næste morgen varme røret i en 37 grader celsius perle bad i 2,5 timer, før du bruger pincet til omhyggeligt at overføre hjertet til en 15-milliliter rør PBS. Vask hjertet tre gange i PBS i en time pr vask ved 37 grader celsius på en nutator og overføre hjertet i kurven af en aktiv elektroforese maskine.Fastgør låget på plads og fyld det aktive elektroforesekammerbeholder med elektroforeseclearingopløsning. Når kammeret er fyldt, nedsænkes kurven i opløsningen, og hætten på elektroforesemaskinen strammes på plads. Kør derefter elektroforesemaskinen ved 1,5 ampere og 37 grader celsius i 1,5 timer.Efter elektroforese skal du kontrollere hjertets visuelt for at sikre, at der ikke er uigennemsigtigt væv tilbage. Vask det ryddede hjerte tre gange i en 15-milliliter to i en time i frisk PBS ved 37 grader celsius pr. Vask på en nutator. Før nedsænkning hjertet i decolorizing agent til at reducere heme auto fluorescens.Efter 48 timer, vaske hjertet tre gange i PBS som demonstreret og ekvilibrere hjertet i frisklavede RIMS i 48 timer før billeddannelse. For 3D-billeddannelse af det ryddede hjerte skal du først placere et tyndt lag vakuumfedt på bunden af et 3D-printet bundreservoir, samme højde som prøven afbildes. Fyld reservoiret med RIMS og brug en pipettespids til at fjerne eventuelle bobler.Placer forsigtigt hjertet i RIMS med venstre ventrikelvæg vendt op, idet du sørger for, at der ikke indføres bobler i opløsningen. Brug vakuumfedt til at fastgøre et glasdæksels slip til bunden af et 3D-trykt topbeholderstykke og læg det øverste reservoirdæksel ned på de nederste reservoirer, og pas på at undgå bobler. Fyld derefter de øverste reservoirer med glycerol.Brug et konfokalt mikroskop til at afbilde de ryddede hjerter. Ved at kombinere raffineret hjerterevævsclearing med 3D-billeddannelse kan der opnås en avanceret detaljeret visualisering af hjertefibroblaster. Ved hjælp af denne billeddannelsesteknik observeres fibroblaster at være tæt pakket og at have en spindelt morfologi i uskadte hjerter.Efter iskæmi reperfusion skade, et tab af hjerte fibroblaster ses i iskæmisk region for de første tre dage efter skaden. På dag syv og 14, fibroblaster har migreret eller formeret til at genbefolke de sårede væv område. Ved dag 28, hjerte fibroblast befolkning omkring de sårede områder af hjertet er på deres største tæthed.Halvanden dag efter myokardie infarkt skade, få fibroblaster forblive inden for de sårede venstre hjertekammer. Ved dag tre dog fibroblaster udvide og er til stede i det meste af venstre hjertekammer. I modsætning til iskæmisk kirurgi, infusion af angiotensin to og phenolefrin over flere uger ikke resulterer i hjertevæv tab og væg udtynding.I stedet, fibroblast tilpasse langs aksen af højrehåndet helix sammentrækning mønster som set, når du bruger raffineret til væv clearing protokol. Hertil kommer, at efter angiotensin to og phenolefrin behandling, fibroblaster synes små og afrundede i modsætning til spindel form observeret i modeller af iskæmi reprofusion og myokardie infarkt skade. Den elektrofobtiske clearing skal udføres omhyggeligt, især når man arbejder med hjerter, der har gennemgået skadesprotokoller.Denne protokol kan bruges til at vurdere, hvordan hjertefibroblaster reagerer på skader in vivo. Forskellige fluorescerende markører kan også bruges til at forstå, hvordan hjertet reagerer på skader på celleniveau.

Research

JoVE Journal

Medicine

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Heterotypisk tredimensionale<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellering af Stromal-Epiteliale Interactions Under Kræft i æggestokkene Indledning og Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Et tredimensionalt Tissue Culture Model til Study Primary human knoglemarv og dens Maligne

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Tre-dimensionel Co-kultur Model for Tumor-stromale Interaktion

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Tre-Dimensional (3D) Tumor Sfæroide Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

Tre-dimensionel Alginat-perle dyrkning af humane hypofyseadenom Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children

Orale Biofilm prøveudtagning for Microbiome analyse i sunde børn

Oral biofilm and its molecular analysis provide a basis for investigating various dental research and clinical questions. Knowledge of biofilm composition ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optisk clearing og billeddannelse af Immunolabeled nyre væv

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

On-Site Sampling and Extraction of Brain Tumors for Metabolomics and Lipidomics Analysis

Prøveudtagning og udvinding af hjernetumorer til metabolomics og lipidomics-analyse på stedet

Despite the variety of tools available for cancer diagnosis and classification, methods that enable fast and simple characterization of tumors are still ...

Advanced Cardiac Rhythm Management by Applying Optogenetic Multi-Site Photostimulation in Murine Hearts

Avanceret hjerterytmestyring ved anvendelse af optogenetisk multi-site fotostimulation i Murine Hearts

Ventricular tachyarrhythmias are a major cause of mortality and morbidity worldwide. Electrical defibrillation using high-energy electric shocks is ...

Three-Dimensional Collagen Matrix Scaffold Implantation as a Liver Regeneration Strategy

Tre-dimensionelle kollagen Matrix Stillads implantation som en lever regenerering strategi

Liver diseases are the leading cause of death worldwide. Excessive alcohol consumption, a high-fat diet, and hepatitis C virus infection promote fibrosis, ...