Name: refined clarity-based tissue clearing for three-dimensional fibroblast organization in healthy and injured mouse hearts
Uploaded: 2021-05-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts at JoVE.com

De auteurs willen de CCHMC Confocal Imaging Core erkennen voor hun hulp en begeleiding bij de ontwikkeling van dit model, evenals Matt Batie van Clinical Engineering voor het ontwerp van alle 3D-geprinte onderdelen. Demetria Fischesser werd ondersteund door een opleidingsbeurs van de National Institutes of Health (NHLBI, T32 HL125204) en Jeffery D. Molkentin werd ondersteund door het Howard Hughes Medical Institute.

Alle experimenten met muizen werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Cincinnati Children's Hospital Medical Center. De instelling is ook AAALAC (American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care) gecertificeerd. Muizen werden geëuthanaseerd via cervicale dislocatie en muizen die overlevingschirurgische ingrepen ondergingen, kregen pijnverlichting (zie hieronder). Alle methoden die worden gebruikt voor pijnbestrijding en euthanasie zijn gebaseerd op aanbeveli...

<ol>
	<li>Nagaraju, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblast+phenotype+and+reversibility+of+fibrosis+in+patients+With+end-stage+heart+failure.">Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure.</a> Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).</li><li>Yoon, S., Eom, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+failure+with+preserved+ejection+fraction:+present+status+and+future+directions.">Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions.</a> Experimental and Molecular Medicine. 51 (12), 1-9 (2019).</li><li>Borlaug, B. A., Redfield, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diastolic+and+systolic+heart+failure+are+distinct+phenotypes+within+the+heart+failure+spectrum.">Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum.</a> Circulation. 123, 2006-2014 (2011).</li><li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+cardiac+fibroblast.">Defining the cardiac fibroblast.</a> Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+fibroblast+differentiated+states+underlie+scar+formation+in+the+infarcted+mouse+heart.">Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (5), 2127-2143 (2018).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Sadeghi, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+3D+cardiac+fibrotic+tissue+to+study+fibrotic+remodeling.">Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (11), 1601434 (2017).</li><li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+diverse+cardiac+cell+types+by+reprogramming+fibroblasts+with+cardiac+transcription+factors.">Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors.</a> Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).</li><li>Bruns, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+right+ventricular+fibroblast+secretome+drives+cardiomyocyte+dedifferentiation.">The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation.</a> PLoS One. 14 (8), 0220573 (2019).</li><li>Ski&#246;ldebrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+activation+of+human+cardiac+fibroblasts+leads+to+altered+calcium+signaling,+decreased+connexin+43+expression+and+increased+glutamate+secretion.">Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion.</a> Heliyon. 3 (10), 00406 (2017).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+pegasos+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method.</a> Cell Research. 28, 803-818 (2018).</li><li>Kolesov&#225;, H., &#268;apek, M., Radochov&#225;, B., Jan&#225;&#269;ek, J., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+tissue+clearing+methods+and+3D+imaging+techniques+for+visualization+of+GFP-expressing+mouse+embryos+and+embryonic+hearts.">Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).</li><li>Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+cardiac+injury+response+of+targeted+cell+populations+via+cleared+heart+three-dimensional+imaging.">Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+transparent+intact+cardiac+tissue+with+single-cell+resolution.">Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution.</a> Biomedical Optics Express. 9 (2), 423-436 (2018).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Yokoyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+sympathetic+hyperinnervation+and+denervation+after+myocardial+infarction+by+three-dimensional+assessment+of+the+cardiac+sympathetic+network+in+cleared+transparent+murine+hearts.">Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts.</a> PLoS One. 12 (7), 0182072 (2017).</li><li>Perbellini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-of-Acrylamide+SDS-based+Tissue+Clearing+(FASTClear)+for+three+dimensional+visualization+of+myocardial+tissue.">Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue.</a> Scientific Reports. 7, 5188 (2017).</li><li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling.">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li><li>Nehrhoff, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+in+CUBIC-cleared+mouse+heart+tissue:+going+deeper.">3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper.</a> Biomedical Optics Express. 7 (9), 3716-3720 (2016).</li><li>Yamamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+reporter+mouse+line+for+Cre-+and+FLP-dependent+lineage+analysis.">A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis.</a> Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).</li><li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+substances+to+laboratory+animals:+Routes+of+administration+and+factors+to+consider.">Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).</li><li>Means, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+1-phosphate+S1P2+and+S1P3+receptor-mediated+Akt+activation+protects+against+in+vivo+myocardial+ischemia-reperfusion+injury.">Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 292 (6), 2944-2951 (2007).</li><li>Michael, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+ischemia+and+reperfusion:+A+murine+model.">Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 269 (6), 2147-2154 (1995).</li><li>Ahn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+myocardial+infarcts+of+a+predictable+size+and+location+by+branch+pattern+probability-assisted+coronary+ligation+in+C57BL/6+mice.">Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice.</a> American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).</li><li>Patten, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+remodeling+in+a+mouse+model+of+myocardial+infarction.">Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 274 (5), 1812-1820 (1998).</li><li>Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+echocardiographic+assessment+of+left+ventricular+dimensions+and+function+after+myocardial+infarction+in+mice.">Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice.</a> Cardiovascular Research. 45 (2), 330-338 (2000).</li><li>Vagnozzi, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acute+immune+response+underlies+the+benefit+of+cardiac+stem+cell+therapy.">An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy.</a> Nature. 577, 405-409 (2020).</li><li>Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist+mechanics+of+the+left+ventricle.+Principles+and+application.">Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application.</a> Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 366-376 (2008).</li><li>Arts, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macroscopic+three-dimensional+motion+patterns+of+the+left+ventricle.">Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).</li><li>Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+muscle+actin-positive+cells+in+healing+human+myocardial+scars.">The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars.</a> American Journal of Pathology. 145 (4), 868-875 (1994).</li><li>Hashmi, S., Al-Salam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myocardial+infarction+and+myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+A+comparison.">Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison.</a> International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).</li></ol>

Dit artikel presenteert een verfijnde methode voor weefselopruiming die visualisatie van hartfibroblasten in vivo mogelijk maakt, zowel bij aanvang als na letsel, om fibroblasten in het muizenhart te karakteriseren en beter te begrijpen. Dit verbeterde protocol pakt beperkingen aan in bestaande weefselontruimingsprotocollen die hebben geprobeerd specifieke celtypen in het volwassen of neonatale hart te identificeren12,13,14...

Hoewel cardiomyocyten de grootste volumefractie in het hart vormen, zijn hartfibroblasten overvloediger en zijn ze kritisch betrokken bij het reguleren van de structurele en herstellende basiskenmerken van dit orgaan. Cardiale fibroblasten zijn zeer mobiel, mechanisch responsief en fenotypisch variërend afhankelijk van de mate van activering. Cardiale fibroblasten zijn nodig om normale niveaus van extracellulaire matrix (ECM) te handhaven, en te weinig of te veel ECM-productie door deze cellen kan leiden tot ziekte1,2,3. Gezien hun belang bij ziekten zijn hartfibroses een steeds belangrijker onderwerp van onderzoek geworden om nieuwe behandelingsstrategieën te identificeren, vooral in een poging om overmatige fibrose te beperken4,5,6,7. Bij letsel activeren en differentiëren fibroblasten in een meer synthetisch celtype dat bekend staat als een myofibroblast, die proliferatie kan zijn en overvloedig ECM kan afscheiden, evenals contractiele activiteit heeft die helpt bij het remodelleren van de ventrikels.
Terwijl hartfibroblasten uitgebreid zijn geëvalueerd op hun eigenschappen in 2D-culturen6,8,9,10, wordt veel minder begrepen van hun eigenschappen en dynamiek in het 3D-levende hart, hetzij bij aanvang of met ziektestimulatie. Hier is een verfijnde methode beschreven om het volwassen muishart te zuiveren met behoud van de fluorescentie van fibroblasten gelabeld met een Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer genetisch verslaggeversysteem. In het hart is Tcf21 een relatief specifieke marker van rustgevende fibroblasten4. Nadat tamoxifen is gegeven om het induceerbare MerCreMer-eiwit te activeren, zullen in wezen alle rustgevende fibroblasten permanent versterkt groen fluorescerend eiwit (eGFP) uitdrukken van de Rosa26-locus, waardoor ze in vivo kunnen worden gevolgd.
Er bestaan talrijke gevestigde weefselophelderingsprotocollen, waarvan sommige zijn toegepast op het hart11,12,13,14,15,16,17. Veel van de reagentia die in verschillende weefselontruimingsprotocollen worden gebruikt, blijken echter endogene fluorescentiesignalen te onderdrukken18. Bovendien is het volwassen hart moeilijk te wissen vanwege overvloedige heemgroephoudende eiwitten die autofluorescentie genereren19. Daarom was het doel van dit protocol om fibroblastmarkerfluorescentie te behouden met de gelijktijdige remming van heemautofluorescentie in het gewonde volwassen hart voor optimale 3D-visualisatie in vivo12,13,14,16,17,20.
Eerdere studies die probeerden de cardiale fibroblast in vivo te onderzoeken, gebruikten geperfuseerde antilichamen om deze cellen te labelen, hoewel dergelijke studies beperkt waren door antilichaampenetratie en cardiale vasculaire structuur14,16,17,20. Hoewel Salamon et al. weefselontruiming hebben aangetoond met behoud van topische neuronale fluorescentie in het neonatale hart, en Nehrhoff et al. hebben aangetoond dat fluorescentie myeloïde cellen markeert, is het behoud van endogene fluorescentie door de gehele ventriculaire wand nog niet aangetoond, inclusief de visualisatie van volwassen cardiale fibroblasten bij aanvang of na letsel13,20. Dit weefselontruimingsprotocol verfijnt een mengsel van eerdere protocollen op basis van de CLARITY-methode (clear lipid-exchanged acrylamide-hybridized rigid Imaging/immunostaining/in situ-hybridization-compatible tissue hydrogel) en PEGASOS (polyethyleenglycol (PEG)-geassocieerd oplosmiddelsysteem). Dit verfijnde protocol maakte een robuuster onderzoek van hartfibrose in het muizenhart bij aanvang mogelijk en van hoe ze reageren op verschillende soorten letsel. Het protocol is eenvoudig en reproduceerbaar en zal helpen het gedrag van hartfibrose in vivo te karakteriseren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 braided silk</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K871H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-0 prolene</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8730H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiotensin II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9525-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial Tear Ointment</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>048272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D27802-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLUture topical tissue adhesive</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Start Analysis Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-osmotic pumps</td>
			<td>Alzet</td>
			<td>Model 1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements Analysis Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R HD upright microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal autoclaved chow</td>
			<td>Labdiet</td>
			<td>5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, 
			N&#39;-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide</td>
			<td>CosmoBio</td>
			<td>AXS-1002424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine Hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoinitiator</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>VA-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>Jax Stock No:012429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride solution</td>
			<td>Hospira, Inc.</td>
			<td>NDC 0409-4888-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen food</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>TD.130860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol, N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>122262-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoretic clearing chamber</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C30001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoretic clearing solution</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoresis tissue basket</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoresis tissue basket holder</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C12002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

refined clarity-based tissue clearing for three-dimensional fibroblast organization in healthy and injured mouse hearts

Hart- en vaatziekten zijn wereldwijd de meest voorkomende oorzaak van mortaliteit en worden vaak gekenmerkt door verhoogde hartfibrose die kan leiden tot verhoogde ventriculaire stijfheid met veranderde hartfunctie. Deze toename van cardiale ventriculaire fibrose is te wijten aan activering van ingezeten fibroblasten, hoewel hoe deze cellen werken binnen het 3-dimensionale (3D) hart, bij aanvang of na activering, niet goed wordt begrepen. Om te onderzoeken hoe fibroblasten bijdragen aan hartaandoeningen en hun dynamiek in het 3D-hart, is een verfijnde op CLARITY gebaseerde weefselophelderings- en beeldvormingsmethode ontwikkeld die fluorescerend gelabelde hartfibroblasten in het hele muishart laat zien. Weefsel ingezeten fibroblasten werden genetisch gelabeld met behulp van Rosa26-loxP-eGFP florescent reporter muizen gekruist met de cardiale fibroblast uitdrukken Tcf21-MerCreMer knock-in lijn. Deze techniek werd gebruikt om fibroblastlokalisatiedynamiek in de hele volwassen linkerventrikel te observeren bij gezonde muizen en bij fibrotische muismodellen van hartaandoeningen. Interessant is dat in één verwondingsmodel unieke patronen van hartfibroblasten werden waargenomen in het gewonde muizenhart dat banden van verpakte vezels in de contractiele richting volgde. In ischemische letselmodellen trad fibroblastdood op, gevolgd door herbevolking uit het grensgebied van het infarct. Gezamenlijk maakt deze verfijnde hartweefselverhelderingstechniek en gedigitaliseerd beeldvormingssysteem 3D-visualisatie van hartfibrose in het hart mogelijk zonder de beperkingen van antilichaampenetratiefalen of eerdere problemen rond verloren fluorescentie als gevolg van weefselverwerking.

Hartfibrose is essentieel voor de uitgangsfunctie van het hart en voor de respons op hartletsel. Eerdere pogingen om de rangschikking en morfologie van deze cellen te begrijpen, zijn grotendeels uitgevoerd in 2D-instellingen. Er is echter een verfijnde hartweefselopheldering (figuur 2) en 3D-beeldvormingstechniek gepubliceerd, die de geavanceerde, meer gedetailleerde visualisatie van hartfibrose mogelijk maakt. Met deze beeldvormingstechniek bleken fibroblasten dicht opeengepakt te zijn en e...

Watch this Scientific Journal Video about Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts at JoVE.com

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

Een verfijnde methode van weefselopruiming werd ontwikkeld en toegepast op het volwassen muizenhart. Deze methode is ontworpen om dicht, autofluorescent hartweefsel te zuiveren, met behoud van gelabelde fibroblastfluorescentie toegeschreven aan een genetische reporterstrategie.

Verfijnde op HELDERHEID gebaseerde weefselopruiming voor driedimensionale fibroblastorganisatie in gezonde en gewonde muizenharten

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

Dit nieuwe weefselontruimingsprotocol verbetert de bestaande technologie om een nauwkeurigere in vivo blik te geven op specifieke celtypen in het hart en hun gedrag onder verwondingsomstandigheden. Dit protocol is snel en vrij eenvoudig. Het maakt het mogelijk om marca fluorescentie te handhaven met minimale interferentie van autofluorescentie van achtergrondweefsel zonder cel- of weefselkleuring te vereisen.Begin met het gebruik van een 70% ethanol gedrenkt gaasje om het ventrale oppervlak van de experimentele muis te reinigen. Gebruik een chirurgische schaar om een transversale incisie van drie centimeter te maken, ongeveer drie meter onder het xiphoid-proces en de muis van de buik naar het xiphoid-proces te degloveeren om de huid van het onderliggende buikwandweefsel te scheiden. Maak een transversale incisie van twee centimeter in het onderhuidse buikwandweefsel, drie centimeter onder het xiphoid-proces en maak een verticale snede van deze incisie in de middellijn door de ribbenkast.Speld de ribbenkast terug om het hart bloot te leggen. En gebruik een spuit van 10 milliliter uitgerust met een 27 gauge naald om koude PBS in de superieure vena cava en aorta te injecteren. Wanneer al het bloed uit het hart is gespoeld, levert u 10 milliliter koude 4% PFA in de superieure vena cava en aorta om het fixatieproces te starten.Wanneer al het fixatief is geflitst, verwijdert u het hart en gebruikt u een rechte scalpel om de atria, rechterventrikel en septum en linkerventrikel te scheiden. Plaats het hart in een conische buis van 15 milliliter koude 4%PFA voor een nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius op een nutator. Voeg de volgende ochtend een 0,25% foto-initiatoroplossing toe aan een vers bereide hydrogels-oplossing en breng het hart over naar de hydrogel.Wikkel de conische buis in folie voor een nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius zonder fysieke verstoring. Verwarm de volgende ochtend de buis in een kraalbad van 37 graden Celsius gedurende 2,5 uur voordat u een tang gebruikt om het hart voorzichtig over te brengen in een buis van 15 milliliter PBS. Was het hart driemaal in PBS gedurende één uur per wasbeurt op 37 graden celsius op een nutator en breng het hart over in de mand van een actieve elektroforesemachine.Zet het deksel vast en vul het actieve elektroforesekamerreservoir met elektroforeseopruimingsoplossing. Zodra de kamer vol is, dompelt u de mand onder in de oplossing en draait u de dop op de elektroforesemachine vast. Laat de elektroforesemachine vervolgens 1,5 uur draaien op 1,5 ampère en 37 graden Celsius.Controleer na elektroforese het visueel van het hart om er zeker van te zijn dat er geen ondoorzichtig weefsel achter blijft. Was het ontruimde hart driemaal in een 15 milliliter twee gedurende een uur in verse PBS op 37 graden celsius per wasbeurt op een nutator. Voordat u het hart onderdompelt in een ontkleuringsmiddel om de autofluorescentie van heem te verminderen.Was het hart na 48 uur driemaal in PBS zoals aangetoond en equilibreert het hart in vers bereide RIM's gedurende 48 uur voorafgaand aan de beeldvorming. Voor 3D-beeldvorming van het ontruimde hart plaatst u eerst een dunne laag vacuümvet op de bodem van een 3D-geprint bodemreservoir, op dezelfde hoogte als het monster dat wordt afgebeeld. Vul het reservoir met RIMS en gebruik een pipettip om eventuele bubbels te verwijderen.Plaats het hart voorzichtig in de RIMS met de linker ventriculaire wand naar boven gericht, zorg ervoor dat er geen bubbels in de oplossing worden geïntroduceerd. Gebruik vacuümvet om een glazen afdekstrip aan het onderoppervlak van een 3D-geprint bovenreservoirstuk te bevestigen en plaats de deksels van het bovenste reservoir op de onderste reservoirs, waarbij u ervoor zorgt dat er geen bellen ontstaan. Vul vervolgens de bovenste reservoirs met glycerol.Gebruik een confocale microscoop om de gewiste harten in beeld te krijgen. De combinatie van verfijnde hartweefselontruiming met 3D-beeldvorming maakt een geavanceerde gedetailleerde visualisatie van hartfibroseblasten mogelijk. Met behulp van deze beeldvormingstechniek worden fibroblasten waargenomen die dicht opeengepakt zijn en een spindelmorfologie hebben in niet-gewonde harten.Na ischemie reperfusie letsel, een verlies van cardiale fibroblasten wordt gezien in de ischemische regio voor de eerste drie dagen na letsel. Op dag zeven en 14 zijn fibroblasten gemigreerd of verspreid om het gewonde weefselgebied opnieuw te bevolken. Tegen dag 28 is de populatie van hartfibrose rond de gewonde gebieden van het hart op hun grootste dichtheid.Anderhalve dag na myocardinfarctletsel blijven er weinig fibroblasten achter in de gewonde linkerventrikel. Op dag drie zetten de fibroblasten echter uit en zijn ze aanwezig in het grootste deel van de linkerventrikel. In tegenstelling tot ischemische chirurgie leidt infusie van angiotensine twee en fenolefrine gedurende meerdere weken niet tot hartweefselverlies en wandverdunning.In plaats daarvan lijnt de fibroblast uit langs de as van het rechtshandige helixcontractiepatroon, zoals te zien is bij het gebruik van het protocol voor het ophelderen van geraffineerde naar weefsel. Bovendien lijken de fibroblasten na behandeling met angiotensine twee en fenolefrine klein en afgerond in tegenstelling tot de spindelvorm die wordt waargenomen bij modellen van ischemie-reprofusie en myocardinfarctletsel. De elektroforetische clearing moet zorgvuldig worden uitgevoerd, vooral bij het werken met harten die letselprotocollen hebben ondergaan.Dit protocol kan worden gebruikt om te beoordelen hoe hartfibrose in vivo reageert op letsel. Verschillende fluorescerende markers kunnen ook worden gebruikt om te begrijpen hoe het hart reageert op letsel op cellulair niveau.

Research

JoVE Journal

Medicine

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Heterotypische Driedimensionale<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellering van Stroma-epitheliale interacties tijdens eierstokkanker initiatie en progressie

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Een Drie-dimensionale Tissue Culture Model om te studeren Primary humaan beenmerg en zijn Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Driedimensionale Co-cultuur Model voor Tumor-stromale Interactie

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Driedimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

Driedimensionale alginaat-bead cultuur van de mens hypofyseadenoom Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children

Mondelinge Biofilm bemonstering voor analyse van de Microbiome bij gezonde kinderen

Oral biofilm and its molecular analysis provide a basis for investigating various dental research and clinical questions. Knowledge of biofilm composition ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optische clearing en beeldvorming van Immunolabeled nierweefsel

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

On-Site Sampling and Extraction of Brain Tumors for Metabolomics and Lipidomics Analysis

On-Site bemonstering en extractie van hersentumoren voor metabolomics en lipidomics analyse

Despite the variety of tools available for cancer diagnosis and classification, methods that enable fast and simple characterization of tumors are still ...

Advanced Cardiac Rhythm Management by Applying Optogenetic Multi-Site Photostimulation in Murine Hearts

Geavanceerd hartritmebeheer door toepassing van optogenetische multi-site fotostimulatie in muizenharten

Ventricular tachyarrhythmias are a major cause of mortality and morbidity worldwide. Electrical defibrillation using high-energy electric shocks is ...

Three-Dimensional Collagen Matrix Scaffold Implantation as a Liver Regeneration Strategy

Driedimensionale collageenmatrixsteigerimplantatie als leverregeneratiestrategie

Liver diseases are the leading cause of death worldwide. Excessive alcohol consumption, a high-fat diet, and hepatitis C virus infection promote fibrosis, ...