Name: refined clarity-based tissue clearing for three-dimensional fibroblast organization in healthy and injured mouse hearts
Uploaded: 2021-05-16T14:00:00
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Les auteurs tiennent à remercier le CCHMC Confocal Imaging Core pour son aide et ses conseils dans le développement de ce modèle, ainsi que Matt Batie de Clinical Engineering pour la conception de toutes les pièces imprimées en 3D. Demetria Fischesser a bénéficié d’une subvention de formation des National Institutes of Health (NHLBI, T32 HL125204) et Jeffery D. Molkentin a été soutenu par le Howard Hughes Medical Institute.

Toutes les expériences impliquant des souris ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du Cincinnati Children’s Hospital Medical Center. L’établissement est également certifié AAALAC (American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care). Des souris ont été euthanasiées par luxation cervicale, et des souris subissant des procédures chirurgicales de survie ont été données le soulagement de douleur (voir ci-dessous). Toutes les méthodes utilisées pour la ...

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	<li>Nagaraju, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblast+phenotype+and+reversibility+of+fibrosis+in+patients+With+end-stage+heart+failure.">Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure.</a> Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).</li><li>Yoon, S., Eom, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+failure+with+preserved+ejection+fraction:+present+status+and+future+directions.">Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions.</a> Experimental and Molecular Medicine. 51 (12), 1-9 (2019).</li><li>Borlaug, B. A., Redfield, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diastolic+and+systolic+heart+failure+are+distinct+phenotypes+within+the+heart+failure+spectrum.">Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum.</a> Circulation. 123, 2006-2014 (2011).</li><li>Ivey, M. J., Tallquist, M. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+3D+cardiac+fibrotic+tissue+to+study+fibrotic+remodeling.">Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (11), 1601434 (2017).</li><li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+diverse+cardiac+cell+types+by+reprogramming+fibroblasts+with+cardiac+transcription+factors.">Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors.</a> Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).</li><li>Bruns, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+right+ventricular+fibroblast+secretome+drives+cardiomyocyte+dedifferentiation.">The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation.</a> PLoS One. 14 (8), 0220573 (2019).</li><li>Ski&#246;ldebrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+activation+of+human+cardiac+fibroblasts+leads+to+altered+calcium+signaling,+decreased+connexin+43+expression+and+increased+glutamate+secretion.">Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion.</a> Heliyon. 3 (10), 00406 (2017).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+pegasos+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method.</a> Cell Research. 28, 803-818 (2018).</li><li>Kolesov&#225;, H., &#268;apek, M., Radochov&#225;, B., Jan&#225;&#269;ek, J., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+tissue+clearing+methods+and+3D+imaging+techniques+for+visualization+of+GFP-expressing+mouse+embryos+and+embryonic+hearts.">Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).</li><li>Salamon, R. 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(157), (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+transparent+intact+cardiac+tissue+with+single-cell+resolution.">Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution.</a> Biomedical Optics Express. 9 (2), 423-436 (2018).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Yokoyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+sympathetic+hyperinnervation+and+denervation+after+myocardial+infarction+by+three-dimensional+assessment+of+the+cardiac+sympathetic+network+in+cleared+transparent+murine+hearts.">Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts.</a> PLoS One. 12 (7), 0182072 (2017).</li><li>Perbellini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-of-Acrylamide+SDS-based+Tissue+Clearing+(FASTClear)+for+three+dimensional+visualization+of+myocardial+tissue.">Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue.</a> Scientific Reports. 7, 5188 (2017).</li><li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling.">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li><li>Nehrhoff, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+in+CUBIC-cleared+mouse+heart+tissue:+going+deeper.">3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper.</a> Biomedical Optics Express. 7 (9), 3716-3720 (2016).</li><li>Yamamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+reporter+mouse+line+for+Cre-+and+FLP-dependent+lineage+analysis.">A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis.</a> Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).</li><li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+substances+to+laboratory+animals:+Routes+of+administration+and+factors+to+consider.">Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).</li><li>Means, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+1-phosphate+S1P2+and+S1P3+receptor-mediated+Akt+activation+protects+against+in+vivo+myocardial+ischemia-reperfusion+injury.">Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 292 (6), 2944-2951 (2007).</li><li>Michael, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+ischemia+and+reperfusion:+A+murine+model.">Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 269 (6), 2147-2154 (1995).</li><li>Ahn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+myocardial+infarcts+of+a+predictable+size+and+location+by+branch+pattern+probability-assisted+coronary+ligation+in+C57BL/6+mice.">Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice.</a> American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).</li><li>Patten, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+remodeling+in+a+mouse+model+of+myocardial+infarction.">Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 274 (5), 1812-1820 (1998).</li><li>Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+echocardiographic+assessment+of+left+ventricular+dimensions+and+function+after+myocardial+infarction+in+mice.">Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice.</a> Cardiovascular Research. 45 (2), 330-338 (2000).</li><li>Vagnozzi, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acute+immune+response+underlies+the+benefit+of+cardiac+stem+cell+therapy.">An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy.</a> Nature. 577, 405-409 (2020).</li><li>Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist+mechanics+of+the+left+ventricle.+Principles+and+application.">Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application.</a> Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 366-376 (2008).</li><li>Arts, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macroscopic+three-dimensional+motion+patterns+of+the+left+ventricle.">Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).</li><li>Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+muscle+actin-positive+cells+in+healing+human+myocardial+scars.">The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars.</a> American Journal of Pathology. 145 (4), 868-875 (1994).</li><li>Hashmi, S., Al-Salam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myocardial+infarction+and+myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+A+comparison.">Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison.</a> International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).</li></ol>

Cet article présente une méthode raffinée pour le dégagement de tissu qui tient compte de la visualisation des fibroblastes cardiaques in vivo, à la ligne de base et après des dommages, pour caractériser et mieux comprendre des fibroblastes dans le coeur de souris. Ce protocole amélioré répond aux limites des protocoles existants de nettoyage des tissus qui ont tenté d’identifier des types de cellules spécifiques dans le cœur adulte ou néonatal12,13,</s...

Bien que les cardiomyocytes comportent la plus grande fraction de volume dans le coeur, les fibroblastes cardiaques sont plus abondants et sont en critique impliqués en réglant les dispositifs structuraux et réparateurs de ligne de base de cet organe. Les fibroblastes cardiaques sont fortement mobiles, mécaniquement sensibles, et phénotypiquement s’étendant selon l’ampleur de leur activation. Les fibroblastes cardiaques sont nécessaires pour maintenir des niveaux normaux de matrice extracellulaire (ECM), et trop peu ou trop de production d’ECM par ces cellules peut conduire à la maladie1,2,3. Compte tenu de leur importance dans la maladie, les fibroblastes cardiaques sont devenus un sujet de recherche de plus en plus important pour identifier de nouvelles stratégies de traitement, en particulier en essayant de limiter la fibrose excessive4,5,6,7. En cas de blessure, les fibroblastes s’activent et se différencient en un type de cellule plus synthétique connu sous le nom de myofibroblaste, qui peut être prolifératif et sécrète un ECM abondant, ainsi que d’avoir une activité contractile qui aide à remodeler les ventricules.
Alors que les fibroblastes cardiaques ont été largement évalués pour leurs propriétés dans les cultures 2-D6,8,9,10,beaucoup moins est compris de leurs propriétés et dynamiques dans le cœur vivant 3-D, soit à la ligne de base ou avec la stimulation de la maladie. Ici, une méthode raffinée a été décrite pour effacer le tissu du cœur de souris adulte tout en maintenant la fluorescence des fibroblastes marqués avec un système de rapporteur génétique Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer. Au sein du cœur, Tcf21 est un marqueur relativement spécifique des fibroblastes quiescents4. Une fois que le tamoxifène est administré pour activer la protéine MerCreMer inductible, pratiquement tous les fibroblastes tranquilles exprimeront en permanence la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) du locus Rosa26, ce qui permet leur suivi in vivo.
De nombreux protocoles de nettoyage des tissus bien établis existent, dont certains ont été appliqués au cœur11,12,13,14,15,16,17. Cependant, de nombreux réactifs utilisés dans différents protocoles de nettoyage des tissus se sont avérés étancher les signaux de fluorescenceendogènes 18. De plus, le cœur adulte est difficile à effacer en raison des protéines abondantes contenant un groupe d’hèmes qui génèrent une autofluorescence19. Par conséquent, le but de ce protocole était de préserver la fluorescence de marqueur de fibroblaste avec l’inhibition simultanée de l’autofluorescence d’hème dans le coeur adulte blessé pour la visualisation 3D optimale in vivo12,13,14,16,17,20.
Les études précédentes tentant d’examiner le fibroblaste cardiaque in vivo ont employé des anticorps perfusés pour étiqueter ces cellules, bien que de telles études aient été limitées par la pénétration d’anticorps et la structure vasculaire cardiaque14,16,17,20. Bien que Salamon et al. aient montré un nettoyage tissulaire avec le maintien de la fluorescence neuronale topique dans le cœur néonatal, et que Nehrhoff et al. aient montré le maintien des cellules myéloïdes marquant la fluorescence, le maintien de la fluorescence endogène à travers toute la paroi ventriculaire n’a pas encore été démontré, y compris la visualisation des fibroblastes cardiaques adultes au départ ou après une blessure13,20. Ce protocole d’élimination des tissus affine un mélange de protocoles précédents basés sur la méthode CLARITY (imagerie rigide acrylamide-hybridée clairement échangée par les lipides/ hydrogel tissulaire compatible avec l’hybridation in situ) et le PEGASOS (système de solvant associé au polyéthylène glycol (PEG)). Ce protocole raffiné a permis un examen plus robuste des fibroblastes cardiaques dans le coeur de souris à la ligne de base et de la façon dont ils répondent à différents types de dommages. Le protocole est simple et reproductible et aidera à caractériser le comportement des fibroblastes cardiaques in vivo.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 braided silk</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K871H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-0 prolene</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8730H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiotensin II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9525-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial Tear Ointment</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>048272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D27802-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLUture topical tissue adhesive</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Start Analysis Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-osmotic pumps</td>
			<td>Alzet</td>
			<td>Model 1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements Analysis Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R HD upright microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal autoclaved chow</td>
			<td>Labdiet</td>
			<td>5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, 
			N&#39;-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide</td>
			<td>CosmoBio</td>
			<td>AXS-1002424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine Hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoinitiator</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>VA-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>Jax Stock No:012429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride solution</td>
			<td>Hospira, Inc.</td>
			<td>NDC 0409-4888-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen food</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>TD.130860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol, N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>122262-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoretic clearing chamber</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C30001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoretic clearing solution</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoresis tissue basket</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoresis tissue basket holder</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C12002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

refined clarity-based tissue clearing for three-dimensional fibroblast organization in healthy and injured mouse hearts

La maladie cardio-vasculaire est la cause la plus répandue de mortalité dans le monde entier et est souvent marquée par la fibrose cardiaque accrue qui peut mener à la rigidité ventriculaire accrue avec la fonction cardiaque changée. Cette augmentation de la fibrose ventriculaire cardiaque est due à l’activation des fibroblastes résidents, bien que la façon dont ces cellules fonctionnent dans le cœur à 3 dimensions (3D), à la ligne de base ou après l’activation, ne soit pas bien comprise. Pour examiner comment les fibroblastes contribuent aux maladies cardiaques et leur dynamique dans le cœur 3D, une méthode raffinée de nettoyage et d’imagerie des tissus basée sur CLARITY a été développée qui montre des fibroblastes cardiaques marqués par fluorescence dans tout le cœur de la souris. Les fibroblastes résidents des tissus ont été génétiquement marqués à l’aide de souris rapporteurs florescentes Rosa26-loxP-eGFP croisées avec le fibroblaste cardiaque exprimant la ligne knock-in Tcf21-MerCreMer. Cette technique a été employée pour observer la dynamique de localisation de fibroblaste dans tout le ventricule gauche adulte entier chez les souris saines et dans les modèles de souris fibrotiques de maladie cardiaque. Intéressant, dans un modèle de blessure, on a observé des modèles uniques des fibroblastes cardiaques dans le coeur blessé de souris qui a suivi des bandes des fibres enveloppées dans la direction contractile. Dans les modèles de dommages ischémiques, la mort de fibroblaste s’est produite, suivie du repeuplement de la zone frontière d’infarctus. Collectivement, cette technique de clarification des tissus cardiaques raffinée et ce système d’imagerie numérisé permettent la visualisation 3D des fibroblastes cardiaques dans le cœur sans les limitations de l’échec de pénétration des anticorps ou les problèmes précédents entourant la fluorescence perdue due au traitement des tissus.

Les fibroblastes cardiaques sont essentiels pour la fonction de base du coeur aussi bien que pour la réponse aux dommages cardiaques. Des tentatives précédentes de comprendre l’arrangement et la morphologie de ces cellules ont été conduites en grande partie dans des arrangements 2-D. Cependant, une technique raffinée de nettoyage des tissus cardiaques (Figure 2) et d’imagerie 3D a été publiée, ce qui permet la visualisation avancée et plus détaillée des fibroblastes cardiaque...

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Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

Une méthode raffinée de dégagement de tissu a été développée et appliquée au coeur adulte de souris. Cette méthode a été conçue pour effacer le tissu cardiaque dense et autofluorescent, tout en maintenant la fluorescence étiquetée de fibroblaste attribuée à une stratégie génétique de rapporteur.

Nettoyage des tissus à base de CLARTÉ raffiné pour l’organisation tridimensionnelle des fibroblastes dans les cœurs de souris sains et blessés

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

Ce nouveau protocole de nettoyage des tissus améliore la technologie existante pour permettre un regard in vivo plus précis sur des types de cellules spécifiques dans le cœur et leur comportement dans des conditions de blessure. Ce protocole est rapide et assez simple. Il permet le maintien de la fluorescence marca avec une interférence minimale de la fluorescence automatique des tissus de fond sans nécessiter de coloration cellulaire ou tissulaire.Commencez par utiliser un tampon de gaze imbibé d’éthanol à 70% pour nettoyer la surface ventrale de la souris expérimentale. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire une incision transversale de trois centimètres, environ trois mètres en dessous du processus xiphoïde et déglossez la souris de l’abdomen au processus xiphoïde pour séparer la peau du tissu de la paroi abdominale sous-jacente. Faire une incision transversale de deux centimètres dans le tissu de la paroi abdominale sous-cutanée, trois centimètres en dessous du processus xiphoïde et faire une coupe verticale de cette incision jusqu’à la ligne médiane à travers la cage thoracique.Épinglez la cage thoracique en arrière pour exposer le cœur. Et utilisez une seringue de 10 millilitres équipée d’une aiguille de calibre 27 pour injecter du PBS froid dans la veine cave supérieure et l’aorte. Lorsque tout le sang a été rincé du cœur, livrer 10 millilitres de froid 4% PFA dans la veine cave supérieure et l’aorte pour commencer le processus de fixation.Lorsque tout le fixateur a été flashé, excisez le cœur et utilisez un scalpel à lame droite pour séparer les oreillettes, le ventricule droit et le septum et le ventricule gauche. Placez le cœur dans un tube conique de 15 millilitres de froid 4% PFA pour une incubation de nuit à quatre degrés Celsius sur un nutator. Le lendemain matin, ajoutez une solution d’initiateur photo à 0,25% à une solution d’hydrogels fraîchement préparée et transférez le cœur dans l’hydrogel.Envelopper le tube conique dans du papier d’aluminium pour une incubation de nuit à quatre degrés Celsius sans perturbation physique. Le lendemain matin, réchauffez le tube dans un bain de perles de 37 degrés Celsius pendant 2,5 heures avant d’utiliser une pince pour transférer soigneusement le cœur dans un tube de 15 millilitres de PBS. Lavez le cœur trois fois en PBS pendant une heure par lavage à 37 degrés Celsius sur un nutator et transférez le cœur dans le panier d’une machine d’électrophorèse active.Fixez le couvercle en place et remplissez le réservoir de la chambre d’électrophorèse active avec une solution de nettoyage par électrophorèse. Une fois la chambre pleine, plongez le panier dans la solution et serrez le bouchon de la machine d’électrophorèse en place. Ensuite, faites fonctionner la machine d’électrophorèse à 1,5 a et 37 degrés Celsius pendant 1,5 heure.Après l’électrophorèse, vérifiez visuellement le cœur pour vous assurer qu’il ne reste aucun tissu opaque. Lavez le cœur dégagé trois fois dans un deux millilitres de 15 millilitres pendant une heure dans du PBS frais à 37 degrés Celsius par lavage sur un nutator. Avant d’immerger le cœur en agent décolorant pour réduire la fluorescence automatique de l’hème.Après 48 heures, lavez le cœur trois fois dans du PBS comme démontré et équilibrez le cœur dans un RIMS fraîchement préparé pendant 48 heures avant l’imagerie. Pour l’imagerie 3D du cœur dégagé, placez d’abord une fine couche de graisse sous vide sur le fond d’un réservoir inférieur imprimé en 3D, à la même hauteur que l’échantillon stratéisé. Remplissez le réservoir avec rims et utilisez une pointe de pipette pour enlever les bulles.Placez soigneusement le cœur dans le RIMS avec la paroi ventriculaire gauche vers le haut, en prenant soin qu’aucune bulle ne soit introduite dans la solution. Utilisez de la graisse sous vide pour fixer un glissement de couvercle en verre à la surface inférieure d’une pièce supérieure du réservoir imprimée en 3D et placez la glissière de couverture du réservoir supérieur sur les réservoirs inférieurs, en prenant soin d’éviter les bulles. Remplissez ensuite les réservoirs supérieurs avec du glycérol.Utilisez un microscope confocal pour imager les cœurs dégagés. La combinaison d’un nettoyage raffiné des tissus cardiaques avec l’imagerie 3D permet une visualisation détaillée avancée des fibroblastes cardiaques. En utilisant cette technique d’imagerie, on observe que les fibroblastes sont densément emballés et ont une morphologie fusiforme dans les cœurs non blessés.Après des dommages de ré-perfusion d’ischémie, une perte de fibroblastes cardiaques est vue dans la région ischémique pendant les trois premiers jours après des dommages. Aux jours sept et 14, les fibroblastes ont migré ou proliféré pour repeupler la région blessée de tissu. Au jour 28, la population de fibroblastes cardiaques entourant les zones blessées du cœur est à leur plus grande densité.Un jour et demi après des dommages d’infarctus du myocarde, peu de fibroblastes restent dans le ventricule gauche blessé. Au troisième jour cependant, les fibroblastes se dilatent et sont présents dans la majeure partie du ventricule gauche. Contrairement à la chirurgie ischémique, l’infusion de l’angiotensine deux et de la phénoléfrine sur plusieurs semaines n’a pas comme conséquence la perte de tissu cardiaque et l’amincissement de mur.Au lieu de cela, le fibroblaste s’alignent le long de l’axe du modèle droitier de contraction d’hélice comme vu en utilisant le raffiné au protocole de dégagement de tissu. En outre, après l’angiotensine deux et le traitement de phénolefrin, les fibroblastes semblent petits et arrondis par opposition à la forme d’axe observée dans les modèles de la réprofusion d’ischémie et des dommages d’infarctus du myocarde. Le nettoyage électrophorétique doit être effectué avec soin, en particulier lorsque vous travaillez avec des cœurs qui ont subi des protocoles de blessures.Ce protocole peut être employé pour évaluer comment les fibroblastes cardiaques réagissent aux dommages in vivo. Différents marqueurs fluorescents peuvent également être utilisés pour comprendre comment le cœur réagit aux blessures au niveau cellulaire.

Research

JoVE Journal

Medicine

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