Name: refined clarity-based tissue clearing for three-dimensional fibroblast organization in healthy and injured mouse hearts
Uploaded: 2021-05-16T14:00:00
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Die Autoren danken dem CCHMC Confocal Imaging Core für ihre Unterstützung und Anleitung bei der Entwicklung dieses Modells sowie Matt Batie von Clinical Engineering für das Design aller 3D-gedruckten Teile. Demetria Fischesser wurde durch ein Trainingsstipendium der National Institutes of Health (NHLBI, T32 HL125204) und Jeffery D. Molkentin durch das Howard Hughes Medical Institute unterstützt.

Alle Experimente mit Mäusen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Cincinnati Children's Hospital Medical Center genehmigt. Die Institution ist auch AAALAC (American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care) zertifiziert. Mäuse wurden durch zervikale Dislokation eingeschläfert, und Mäuse, die sich einer Überlebenschirurgie unterzogen, erhielten Schmerzlinderung (siehe unten). Alle Methoden zur Schmerzbehandlung und Euthanasie basieren auf Empfehlungen des Gremiums für Eutha...

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	<li>Nagaraju, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblast+phenotype+and+reversibility+of+fibrosis+in+patients+With+end-stage+heart+failure.">Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure.</a> Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).</li><li>Yoon, S., Eom, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+failure+with+preserved+ejection+fraction:+present+status+and+future+directions.">Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions.</a> Experimental and Molecular Medicine. 51 (12), 1-9 (2019).</li><li>Borlaug, B. A., Redfield, M. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+3D+cardiac+fibrotic+tissue+to+study+fibrotic+remodeling.">Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (11), 1601434 (2017).</li><li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+diverse+cardiac+cell+types+by+reprogramming+fibroblasts+with+cardiac+transcription+factors.">Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors.</a> Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).</li><li>Bruns, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+right+ventricular+fibroblast+secretome+drives+cardiomyocyte+dedifferentiation.">The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation.</a> PLoS One. 14 (8), 0220573 (2019).</li><li>Ski&#246;ldebrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+activation+of+human+cardiac+fibroblasts+leads+to+altered+calcium+signaling,+decreased+connexin+43+expression+and+increased+glutamate+secretion.">Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion.</a> Heliyon. 3 (10), 00406 (2017).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+pegasos+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method.</a> Cell Research. 28, 803-818 (2018).</li><li>Kolesov&#225;, H., &#268;apek, M., Radochov&#225;, B., Jan&#225;&#269;ek, J., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+tissue+clearing+methods+and+3D+imaging+techniques+for+visualization+of+GFP-expressing+mouse+embryos+and+embryonic+hearts.">Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).</li><li>Salamon, R. 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(157), (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+transparent+intact+cardiac+tissue+with+single-cell+resolution.">Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution.</a> Biomedical Optics Express. 9 (2), 423-436 (2018).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Yokoyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+sympathetic+hyperinnervation+and+denervation+after+myocardial+infarction+by+three-dimensional+assessment+of+the+cardiac+sympathetic+network+in+cleared+transparent+murine+hearts.">Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts.</a> PLoS One. 12 (7), 0182072 (2017).</li><li>Perbellini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-of-Acrylamide+SDS-based+Tissue+Clearing+(FASTClear)+for+three+dimensional+visualization+of+myocardial+tissue.">Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue.</a> Scientific Reports. 7, 5188 (2017).</li><li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+1-phosphate+S1P2+and+S1P3+receptor-mediated+Akt+activation+protects+against+in+vivo+myocardial+ischemia-reperfusion+injury.">Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 292 (6), 2944-2951 (2007).</li><li>Michael, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+ischemia+and+reperfusion:+A+murine+model.">Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 269 (6), 2147-2154 (1995).</li><li>Ahn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+myocardial+infarcts+of+a+predictable+size+and+location+by+branch+pattern+probability-assisted+coronary+ligation+in+C57BL/6+mice.">Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice.</a> American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).</li><li>Patten, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+remodeling+in+a+mouse+model+of+myocardial+infarction.">Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 274 (5), 1812-1820 (1998).</li><li>Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+echocardiographic+assessment+of+left+ventricular+dimensions+and+function+after+myocardial+infarction+in+mice.">Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice.</a> Cardiovascular Research. 45 (2), 330-338 (2000).</li><li>Vagnozzi, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acute+immune+response+underlies+the+benefit+of+cardiac+stem+cell+therapy.">An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy.</a> Nature. 577, 405-409 (2020).</li><li>Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist+mechanics+of+the+left+ventricle.+Principles+and+application.">Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application.</a> Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 366-376 (2008).</li><li>Arts, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macroscopic+three-dimensional+motion+patterns+of+the+left+ventricle.">Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).</li><li>Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. 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Dieser Artikel stellt eine verfeinerte Methode zur Gewebereinigung vor, die die Visualisierung von Herzfibroblasten in vivo sowohl zu Studienbeginn als auch nach Verletzungen ermöglicht, um Fibroblasten im Mausherz zu charakterisieren und besser zu verstehen. Dieses erweiterte Protokoll adressiert Einschränkungen in bestehenden Gewebereinigungsprotokollen, die versucht haben, bestimmte Zelltypen im erwachsenen oder neonatalen Herzen zu identifizieren12,13,...

Obwohl Kardiomyozyten die größte Volumenfraktion im Herzen ausmachen, sind Herzfibroblasten reichlich vorhanden und entscheidend an der Regulierung der strukturellen und reparativen Grundmerkmale dieses Organs beteiligt. Herzfibroblasten sind sehr mobil, mechanisch ansprechend und phänotypisch abhängig vom Ausmaß ihrer Aktivierung. Herzfibroblasten sind notwendig, um normale Spiegel der extrazellulären Matrix (ECM) aufrechtzuerhalten, und zu wenig oder zu viel ECM-Produktion durch diese Zellen kann zu Krankheiten führen1,2,3. Angesichts ihrer Bedeutung bei Krankheiten sind Herzfibroblasten zu einem immer wichtigeren Untersuchungsthema geworden, um neue Behandlungsstrategien zu identifizieren, insbesondere bei dem Versuch, übermäßige Fibrose zu begrenzen4,5,6,7. Nach einer Verletzung aktivieren und differenzieren sich Fibroblasten in einen synthetischeren Zelltyp, der als Myofibroblast bekannt ist, der proliferativ sein und reichlich ECM absondern kann, sowie eine kontraktile Aktivität aufwies, die hilft, die Ventrikel umzugestalten.
Während herzfibroblasten in 2-D-Kulturen 6,8 ,9,10umfassend auf ihre Eigenschaften und Dynamiken im3D-lebendenHerzen untersucht wurden, wird viel weniger über ihre Eigenschaften und Dynamik im 3D-lebenden Herzen verstanden, entweder zu Beginn oder bei Krankheitsstimulation. Hier wurde eine verfeinerte Methode beschrieben, um das erwachsene Mausherz zu klären und gleichzeitig die Fluoreszenz von Fibroblasten aufrechtzuerhalten, die mit einem Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer-Genreportersystem markiert sind. Innerhalb des Herzens ist Tcf21 ein relativ spezifischer Marker für ruhendierende Fibroblasten4. Nachdem Tamoxifen verabreicht wurde, um das induzierbare MerCreMer-Protein zu aktivieren, exprimieren im Wesentlichen alle ruhend ruhenden Fibroblasten dauerhaft ein verbessertes grün fluoreszierendes Protein (eGFP) aus dem Rosa26-Locus, was ihre Verfolgung in vivo ermöglicht.
Es gibt zahlreiche gut etablierte Gewebereinigungsprotokolle, von denen einige auf das Herz11 , 12,13,14,15,16,17angewendet wurden . Es wurde jedoch festgestellt, dass viele der Reagenzien, die in verschiedenen Gewebereinigungsprotokollen verwendet werden, endogene Fluoreszenzsignale abschrecken18. Darüber hinaus ist das erwachsene Herz aufgrund der reichlich vorhandenen Hämgruppen-haltigen Proteine, die Autofluoreszenz erzeugen, schwer zu klären19. Daher war das Ziel dieses Protokolls, die Fibroblastenmarkerfluoreszenz mit der gleichzeitigen Hemmung der Häm-Autofluoreszenz im verletzten erwachsenen Herzen für eine optimale 3D-Visualisierung in vivo12,13,14,16,17,20zu erhalten.
Frühere Studien, die versuchten, den kardialen Fibroblasten in vivo zu untersuchen, verwendeten perfundierte Antikörper, um diese Zellen zu kennzeichnen, obwohl solche Studien durch Antikörperpenetration und kardiale Gefäßstruktur begrenzt waren14,16,17,20. Obwohl Salamon et al. eine Gewebereinigung mit Aufrechterhaltung der topischen neuronalen Fluoreszenz im neonatalen Herzen gezeigt haben und Nehrhoff et al. gezeigt haben, dass die Fluoreszenzmarkierung myeloischer Zellen erhalten bleibt, wurde die Aufrechterhaltung der endogenen Fluoreszenz durch die gesamte ventrikuläre Wand noch nicht nachgewiesen, einschließlich der Visualisierung von adulten Herzfibroblasten zu Beginn oder nach Verletzung13,20. Dieses Gewebereinigungsprotokoll verfeinert eine Mischung früherer Protokolle, die auf der CLARITY-Methode (klares lipidgetauschtes Acrylamid-hybridisiertes starres Imaging/Immunostaining/In-situ-Hybridisierungs-kompatibles Gewebehydrogel) und PEGASOS (Polyethylenglykol (PEG)-assoziiertes Lösungsmittelsystem) basieren. Dieses verfeinerte Protokoll ermöglichte eine robustere Untersuchung von Herzfibroblasten im Mausherz zu Studienbeginn und wie sie auf verschiedene Arten von Verletzungen reagieren. Das Protokoll ist einfach und reproduzierbar und wird dazu beitragen, das Verhalten von Herzfibroblasten in vivo zu charakterisieren.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 braided silk</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K871H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-0 prolene</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8730H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiotensin II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9525-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial Tear Ointment</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>048272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D27802-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLUture topical tissue adhesive</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Start Analysis Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-osmotic pumps</td>
			<td>Alzet</td>
			<td>Model 1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements Analysis Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R HD upright microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal autoclaved chow</td>
			<td>Labdiet</td>
			<td>5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, 
			N&#39;-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide</td>
			<td>CosmoBio</td>
			<td>AXS-1002424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine Hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoinitiator</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>VA-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>Jax Stock No:012429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride solution</td>
			<td>Hospira, Inc.</td>
			<td>NDC 0409-4888-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen food</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>TD.130860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol, N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>122262-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoretic clearing chamber</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C30001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoretic clearing solution</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoresis tissue basket</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoresis tissue basket holder</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C12002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

refined clarity-based tissue clearing for three-dimensional fibroblast organization in healthy and injured mouse hearts

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit die häufigste Todesursache und sind oft durch erhöhte Herzfibrose gekennzeichnet, die zu einer erhöhten ventrikulären Steifigkeit mit veränderter Herzfunktion führen kann. Dieser Anstieg der herzventrikulären Fibrose ist auf die Aktivierung von ansässigen Fibroblasten zurückzuführen, obwohl nicht gut verstanden ist, wie diese Zellen innerhalb des 3-dimensionalen (3-D) Herzens, zu Beginn oder nach der Aktivierung funktionieren. Um zu untersuchen, wie Fibroblasten zu Herzerkrankungen und ihrer Dynamik im 3D-Herzen beitragen, wurde eine verfeinerte CLARITY-basierte Gewebereinigungs- und Bildgebungsmethode entwickelt, die fluoreszierend markierte Herzfibroblasten im gesamten Mausherz zeigt. Geweberesidente Fibroblasten wurden genetisch mit Rosa26-loxP-eGFP floreszierenden Reportermäusen markiert, die mit der kardialen Fibroblasten-exprimierenden Tcf21-MerCreMer-Knock-in-Linie gekreuzt wurden. Diese Technik wurde verwendet, um die Fibroblastenlokalisierungsdynamik im gesamten linken Ventrikel des Erwachsenen bei gesunden Mäusen und in fibrotischen Mausmodellen für Herzerkrankungen zu beobachten. Interessanterweise wurden in einem Verletzungsmodell einzigartige Muster von Herzfibroblasten im verletzten Mausherz beobachtet, die Bändern von umwickelten Fasern in kontraktiler Richtung folgten. In ischämischen Verletzungsmodellen trat der Fibroblastentod auf, gefolgt von einer Wiederbesiedlung aus der Infarktgrenzzone. Zusammen ermöglicht diese verfeinerte Kardgewebeklärtechnik und das digitalisierte Bildgebungssystem eine 3D-Visualisierung von Herzfibroblasten im Herzen ohne die Einschränkungen von Antikörperpenetrationsversagen oder früheren Problemen im Zusammenhang mit verlorener Fluoreszenz aufgrund von Gewebeverarbeitung.

Herzfibroblasten sind sowohl für die Ausgangsfunktion des Herzens als auch für die Reaktion auf Herzverletzungen unerlässlich. Frühere Versuche, die Anordnung und Morphologie dieser Zellen zu verstehen, wurden größtenteils in 2D-Umgebungen durchgeführt. Es wurde jedoch eine verfeinerte Herzgewebereinigung (Abbildung 2) und 3D-Bildgebungstechnik veröffentlicht, die eine fortgeschrittene, detailliertere Visualisierung von Herzfibroblasten ermöglicht. Bei dieser bildgebenden Technik wu...

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Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

Eine verfeinerte Methode der Gewebereinigung wurde entwickelt und auf das erwachsene Mausherz angewendet. Diese Methode wurde entwickelt, um dichtes, autofluoreszierendes Herzgewebe zu beseitigen und gleichzeitig die markierte Fibroblastenfluoreszenz aufrechtzuerhalten, die einer genetischen Reporterstrategie zugeschrieben wird.

Verfeinerte CLARITY-basierte Gewebereinigung für die dreidimensionale Fibroblastenorganisation in gesunden und verletzten Mäuseherzen

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

Dieses neuartige Gewebereinigungsprotokoll verbessert die bestehende Technologie, um eine genauere In-vivo-Untersuchung bestimmter Zelltypen im Herzen und ihres Verhaltens unter Verletzungsbedingungen zu ermöglichen. Dieses Protokoll ist schnell und ziemlich einfach. Es ermöglicht die Aufrechterhaltung der Marca-Fluoreszenz mit minimaler Interferenz durch die automatische Hintergrundfluoreszenz des Hintergrundgewebes, ohne dass eine Zell- oder Gewebefärbung erforderlich ist.Beginnen Sie mit der Verwendung eines mit 70% Ethanol getränkten Mullpads, um die ventrale Oberfläche der experimentellen Maus zu reinigen. Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um einen drei Zentimeter großen Querschnitt zu machen, etwa drei Meter unter dem Xiphoid-Prozess, und deglove die Maus vom Bauch zum Xiphoid-Prozess, um die Haut vom darunter liegenden Bauchwandgewebe zu trennen. Machen Sie einen zwei Zentimeter großen Querschnitt in das subkutane Bauchwandgewebe, drei Zentimeter unter dem Xiphoid-Prozess und machen Sie einen vertikalen Schnitt von diesem Schnitt bis zur Mittellinie durch den Brustkorb.Stecken Sie den Brustkorb zurück, um das Herz freizulegen. Und verwenden Sie eine 10-Milliliter-Spritze, die mit einer 27-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um kaltes PBS in die obere Hohlvene und Aorta zu injizieren. Wenn das gesamte Blut aus dem Herzen gespült wurde, geben Sie 10 Milliliter kalte 4% PFA in die obere Hohlvene und Aorta, um den Fixierungsprozess zu beginnen.Wenn das gesamte Fixiermittel geflasht wurde, schneiden Sie das Herz heraus und verwenden Sie ein gerades Klingenskalpell, um die Vorhöfe, den rechten Ventrikel und das Septum sowie den linken Ventrikel zu trennen. Legen Sie das Herz in ein 15-Milliliter-Konikusrohr mit kaltem 4% PFA für eine Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Nutator. Am nächsten Morgen eine 0,25% ige Photoinitiatorlösung zu einer frisch zubereiteten Hydrogellösung hinzufügen und das Herz auf das Hydrogel übertragen.Wickeln Sie das konische Rohr in Folie für eine Nächtlichekubation bei vier Grad Celsius ohne körperliche Störung. Am nächsten Morgen erwärmen Sie die Tube in einem 37 Grad Celsius Perlenbad für 2,5 Stunden, bevor Sie das Herz mit einer Zinnen vorsichtig in eine 15-Milliliter-Tube PBS überführen. Waschen Sie das Herz dreimal in PBS für eine Stunde pro Wäsche bei 37 Grad Celsius auf einem Nutator und übertragen Sie das Herz in den Korb einer aktiven Elektrophoresemaschine.Befestige den Deckel an Ort und Stelle und fülle den aktiven Elektrophoresekammerbehälter mit Elektrophorese-Clearing-Lösung. Sobald die Kammer voll ist, tauchen Sie den Korb in die Lösung und ziehen Sie die Kappe der Elektrophoresemaschine fest. Dann lassen Sie die Elektrophoresemaschine bei 1,5 Ampere und 37 Grad Celsius für 1,5 Stunden laufen.Überprüfen Sie nach der Elektrophorese das Herz visuell, um sicherzustellen, dass kein undurchsichtiges Gewebe zurückbleicht. Waschen Sie das gereinigte Herz dreimal in einem 15-Milliliter-Zweifachen für eine Stunde in frischem PBS bei 37 Grad Celsius pro Waschgang auf einem Nutator. Vor dem Eintauchen des Herzens in ein Entfärbungsmittel, um die automatische Hämfluoreszenz zu reduzieren.Waschen Sie das Herz nach 48 Stunden dreimal in PBS, wie gezeigt, und gleichen Sie das Herz in frisch zubereiteten RIMS für 48 Stunden vor der Bildgebung aus. Für die 3D-Bildgebung des gereinigten Herzens legen Sie zunächst eine dünne Schicht Vakuumfett auf den Boden eines 3D-gedruckten Bodenreservoirs, die gleiche Höhe wie die abgebildete Probe. Füllen Sie den Behälter mit RIMS und verwenden Sie eine Pipettenspitze, um Blasen zu entfernen.Legen Sie das Herz vorsichtig mit der linksventrikulären Wand nach oben in die RIMS und achten Sie darauf, dass keine Blasen in die Lösung eingeführt werden. Verwenden Sie Vakuumfett, um einen Glasabdeckungsschlupf an der Unterseite eines 3D-gedruckten oberen Reservoirstücks zu befestigen, und legen Sie die oberen Reservoirabdeckungen auf die unteren Reservoirs, wobei Sie darauf achten, Blasen zu vermeiden. Dann füllen Sie die oberen Reservoirs mit Glycerin.Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop, um die gereinigten Herzen abbilden. Die Kombination von verfeinerter Kardgewebereinigung mit 3D-Bildgebung ermöglicht eine erweiterte detaillierte Visualisierung von Herzfibroblasten. Mit dieser bildgebenden Technik wird beobachtet, dass Fibroblasten dicht gepackt sind und eine spindelförmige Morphologie in unverletzten Herzen aufweisen.Nach einer Ischämie-Reperfusionsverletzung wird in den ersten drei Tagen nach der Verletzung ein Verlust von Herzfibroblasten in der ischämischen Region beobachtet. Am siebten und 14. Tag sind Fibroblasten migriert oder vermehrt, um den verletzten Gewebebereich wieder zu besiedigen. Am Tag 28 ist die Kardibroblastenpopulation, die die verletzten Bereiche des Herzens umgibt, am dichtesten.Eineinhalb Tage nach einer Myokardinfarktverletzung verbleiben nur wenige Fibroblasten im verletzten linken Ventrikel. Am dritten Tag dehnen sich die Fibroblasten jedoch aus und sind im größten Teil des linken Ventrikels vorhanden. Im Gegensatz zur ischämischen Chirurgie führt die Infusion von Angiotensin zwei und Phenolefrin über mehrere Wochen nicht zu Herzgewebeverlust und Wandausdünnung.Stattdessen richten sich die Fibroblasten entlang der Achse des rechtshändigen Helixkontraktionsmusters aus, wie es bei der Verwendung des verfeinerten Gewebereinigungsprotokolls zu sehen ist. Darüber hinaus erscheinen die Fibroblasten nach angiotensin zwei und Phenolefrin-Behandlung klein und abgerundet im Gegensatz zu der Spindelform, die in Modellen der Ischämie-Reprofusion und Myokardinfarktverletzung beobachtet wurde. Die elektrophoretische Reinigung muss sorgfältig durchgeführt werden, insbesondere bei der Arbeit mit Herzen, die Verletzungsprotokolle durchlaufen haben.Dieses Protokoll kann verwendet werden, um zu beurteilen, wie Herzfibroblasten auf Verletzungen in vivo reagieren. Verschiedene fluoreszierende Marker können auch verwendet werden, um zu verstehen, wie das Herz auf Verletzungen auf zellulärer Ebene reagiert.

Research

JoVE Journal

Medicine

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

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Heterotypische Dreidimensionale<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellierung von Stromal-Epithelial Interaktionen beim Eierstockkrebs Initiation und Progression

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Forschung

Medizin

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Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

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Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

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