Name: refined clarity-based tissue clearing for three-dimensional fibroblast organization in healthy and injured mouse hearts
Uploaded: 2021-05-16T14:00:00
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Gli autori vorrebbero riconoscere il CCHMC Confocal Imaging Core per la loro assistenza e guida nello sviluppo di questo modello, nonché Matt Batie di Clinical Engineering per la progettazione di tutte le parti stampate in 3D. Demetria Fischesser è stata sostenuta da una borsa di formazione del National Institutes of Health (NHLBI, T32 HL125204) e Jeffery D. Molkentin è stata sostenuta dall'Howard Hughes Medical Institute.

Tutti gli esperimenti che coinvolgono topi sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Cincinnati Children's Hospital Medical Center. L'istituto è anche certificato AAALAC (American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care). I topi sono stati eutanasiati tramite lussazione cervicale e ai topi sottoposti a procedure chirurgiche di sopravvivenza è stato somministrato sollievo dal dolore (vedi sotto). Tutti i metodi utilizzati per la gestione del dolore e l'eutanasia si...

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	<li>Nagaraju, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblast+phenotype+and+reversibility+of+fibrosis+in+patients+With+end-stage+heart+failure.">Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure.</a> Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).</li><li>Yoon, S., Eom, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+failure+with+preserved+ejection+fraction:+present+status+and+future+directions.">Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions.</a> Experimental and Molecular Medicine. 51 (12), 1-9 (2019).</li><li>Borlaug, B. A., Redfield, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diastolic+and+systolic+heart+failure+are+distinct+phenotypes+within+the+heart+failure+spectrum.">Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum.</a> Circulation. 123, 2006-2014 (2011).</li><li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+cardiac+fibroblast.">Defining the cardiac fibroblast.</a> Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+fibroblast+differentiated+states+underlie+scar+formation+in+the+infarcted+mouse+heart.">Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (5), 2127-2143 (2018).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Sadeghi, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+3D+cardiac+fibrotic+tissue+to+study+fibrotic+remodeling.">Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (11), 1601434 (2017).</li><li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+diverse+cardiac+cell+types+by+reprogramming+fibroblasts+with+cardiac+transcription+factors.">Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors.</a> Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).</li><li>Bruns, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+right+ventricular+fibroblast+secretome+drives+cardiomyocyte+dedifferentiation.">The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation.</a> PLoS One. 14 (8), 0220573 (2019).</li><li>Ski&#246;ldebrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+activation+of+human+cardiac+fibroblasts+leads+to+altered+calcium+signaling,+decreased+connexin+43+expression+and+increased+glutamate+secretion.">Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion.</a> Heliyon. 3 (10), 00406 (2017).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+pegasos+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method.</a> Cell Research. 28, 803-818 (2018).</li><li>Kolesov&#225;, H., &#268;apek, M., Radochov&#225;, B., Jan&#225;&#269;ek, J., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+tissue+clearing+methods+and+3D+imaging+techniques+for+visualization+of+GFP-expressing+mouse+embryos+and+embryonic+hearts.">Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).</li><li>Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+cardiac+injury+response+of+targeted+cell+populations+via+cleared+heart+three-dimensional+imaging.">Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+transparent+intact+cardiac+tissue+with+single-cell+resolution.">Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution.</a> Biomedical Optics Express. 9 (2), 423-436 (2018).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Yokoyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+sympathetic+hyperinnervation+and+denervation+after+myocardial+infarction+by+three-dimensional+assessment+of+the+cardiac+sympathetic+network+in+cleared+transparent+murine+hearts.">Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts.</a> PLoS One. 12 (7), 0182072 (2017).</li><li>Perbellini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-of-Acrylamide+SDS-based+Tissue+Clearing+(FASTClear)+for+three+dimensional+visualization+of+myocardial+tissue.">Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue.</a> Scientific Reports. 7, 5188 (2017).</li><li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling.">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li><li>Nehrhoff, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+in+CUBIC-cleared+mouse+heart+tissue:+going+deeper.">3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper.</a> Biomedical Optics Express. 7 (9), 3716-3720 (2016).</li><li>Yamamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+reporter+mouse+line+for+Cre-+and+FLP-dependent+lineage+analysis.">A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis.</a> Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).</li><li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+substances+to+laboratory+animals:+Routes+of+administration+and+factors+to+consider.">Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).</li><li>Means, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+1-phosphate+S1P2+and+S1P3+receptor-mediated+Akt+activation+protects+against+in+vivo+myocardial+ischemia-reperfusion+injury.">Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 292 (6), 2944-2951 (2007).</li><li>Michael, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+ischemia+and+reperfusion:+A+murine+model.">Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 269 (6), 2147-2154 (1995).</li><li>Ahn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+myocardial+infarcts+of+a+predictable+size+and+location+by+branch+pattern+probability-assisted+coronary+ligation+in+C57BL/6+mice.">Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice.</a> American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).</li><li>Patten, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+remodeling+in+a+mouse+model+of+myocardial+infarction.">Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 274 (5), 1812-1820 (1998).</li><li>Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+echocardiographic+assessment+of+left+ventricular+dimensions+and+function+after+myocardial+infarction+in+mice.">Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice.</a> Cardiovascular Research. 45 (2), 330-338 (2000).</li><li>Vagnozzi, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acute+immune+response+underlies+the+benefit+of+cardiac+stem+cell+therapy.">An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy.</a> Nature. 577, 405-409 (2020).</li><li>Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist+mechanics+of+the+left+ventricle.+Principles+and+application.">Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application.</a> Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 366-376 (2008).</li><li>Arts, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macroscopic+three-dimensional+motion+patterns+of+the+left+ventricle.">Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).</li><li>Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+muscle+actin-positive+cells+in+healing+human+myocardial+scars.">The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars.</a> American Journal of Pathology. 145 (4), 868-875 (1994).</li><li>Hashmi, S., Al-Salam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myocardial+infarction+and+myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+A+comparison.">Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison.</a> International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).</li></ol>

Questo articolo presenta un metodo raffinato per la pulizia dei tessuti che consente la visualizzazione di fibroblasti cardiaci in vivo, sia al basale che a seguito di lesioni, per caratterizzare e comprendere meglio i fibroblasti nel cuore del topo. Questo protocollo avanzato affronta le limitazioni nei protocolli di compensazione dei tessuti esistenti che hanno tentato di identificare tipi di cellule specifiche nel cuore adulto o neonatale12,13,<sup ...

Sebbene i cardiomiociti costificheranno la più grande frazione di volume nel cuore, i fibroblasti cardiaci sono più abbondanti e sono coinvolti criticamente nella regolazione delle caratteristiche strutturali e riparatrici di base di questo organo. I fibroblasti cardiaci sono altamente mobili, meccanicamente reattivi e fenotipicamente variano a seconda dell'entità della loro attivazione. I fibroblasti cardiaci sono necessari per mantenere i normali livelli di matrice extracellulare (ECM), e una produzione troppo piccola o troppo di ECM da parte di queste cellule puòportare alla malattia 1,2,3. Data la loro importanza nella malattia, i fibroblasti cardiaci sono diventati un argomento di indagine sempre più importante verso l'identificazione di nuove strategie di trattamento, specialmente nel tentativo di limitare l'eccessiva fibrosi4,5,6,7. Al momento della lesione, i fibroblasti si attivano e si differenziano in un tipo di cellula più sintetica noto come miofibroblasto, che può essere proliferativo e secernore abbondante ECM, oltre ad avere un'attività contrattile che aiuta a rimodellare i ventricoli.
Mentre i fibroblasti cardiaci sono stati ampiamente valutati per le loro proprietà nelle colture 2D6,8,9,10, molto meno si comprende le loro proprietà e dinamiche nel cuore vivente 3D, sia al basale che con la stimolazione della malattia. Qui, è stato descritto un metodo raffinato per liberare il cuore del topo adulto mantenendo la fluorescenza dei fibroblasti etichettati con un sistema di reporter genetico Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer. All'interno del cuore, Tcf21 è un marcatore relativamente specifico di fibroblasti quiescenti4. Dopo che il tamoxifene è stato somministrato per attivare la proteina MerCreMer induttiva, essenzialmente tutti i fibroblasti quiescenti esprimeranno permanentemente proteine fluorescenti verdi potenziate (eGFP) dal locus Rosa26, che consente il loro tracciamento in vivo.
Esistono numerosi protocolli di compensazione dei tessuti consolidati, alcuni dei quali sono stati applicati al cuore11,12,13,14,15,16,17. Tuttavia, molti dei reagenti utilizzati in diversi protocolli di compensazione dei tessuti sono stati trovati per spegnere i segnali di fluorescenza endogena18. Inoltre, il cuore adulto è difficile da cancellare a causa delle abbondanti proteine contenenti gruppo di eme che generano autofluorescenza19. Pertanto, l'obiettivo di questo protocollo era quello di preservare la fluorescenza marcatore fibroblasto con l'inibizione simultanea dell'autofluorescenza dell'eme nel cuore adulto ferito per una visualizzazione 3D ottimale in vivo12,13,14,16,17,20.
Studi precedenti che tentavano di esaminare il fibroblasto cardiaco in vivo impiegavano anticorpi perfusi per etichettare queste cellule, sebbene tali studi fossero limitati dalla penetrazione degli anticorpi e dalla strutturavascolare cardiaca 14,16,17,20. Sebbene Salamon et al. Questo protocollo di compensazione dei tessuti affina una miscela di protocolli precedenti basati sul metodo CLARITY (sistema solvente rigido ibrido con acrilammide (PEG) e PEGASOS (sistema solvente associato al polietilene glicole (PEG). Questo raffinato protocollo ha permesso un esame più robusto dei fibroblasti cardiaci nel cuore del topo al basale e di come rispondono a diversi tipi di lesioni. Il protocollo è semplice e riproducibile e aiuterà a caratterizzare il comportamento dei fibroblasti cardiaci in vivo.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 braided silk</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K871H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-0 prolene</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8730H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiotensin II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9525-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial Tear Ointment</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>048272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D27802-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLUture topical tissue adhesive</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Start Analysis Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-osmotic pumps</td>
			<td>Alzet</td>
			<td>Model 1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements Analysis Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R HD upright microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal autoclaved chow</td>
			<td>Labdiet</td>
			<td>5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, 
			N&#39;-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide</td>
			<td>CosmoBio</td>
			<td>AXS-1002424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine Hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoinitiator</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>VA-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>Jax Stock No:012429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride solution</td>
			<td>Hospira, Inc.</td>
			<td>NDC 0409-4888-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen food</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>TD.130860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol, N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>122262-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoretic clearing chamber</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C30001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoretic clearing solution</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoresis tissue basket</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoresis tissue basket holder</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C12002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

refined clarity-based tissue clearing for three-dimensional fibroblast organization in healthy and injured mouse hearts

Le malattie cardiovascolari sono la causa più diffusa di mortalità in tutto il mondo ed è spesso contrassegnata da una fibrosi cardiaca aumentata che può portare a una maggiore rigidità ventricolare con funzione cardiaca alterata. Questo aumento della fibrosi ventricolare cardiaca è dovuto all'attivazione di fibroblasti residenti, anche se il modo in cui queste cellule operano all'interno del cuore tridimensionale (3D), al basale o dopo l'attivazione, non è ben compreso. Per esaminare come i fibroblasti contribuiscono alle malattie cardiache e alle loro dinamiche nel cuore 3D, è stato sviluppato un raffinato metodo di pulizia e imaging dei tessuti basato su CLARITY che mostra fibroblasti cardiaci etichettati fluorescentmente all'interno dell'intero cuore del topo. I fibroblasti residenti nei tessuti sono stati geneticamente etichettati utilizzando topi reporter florescenti Rosa26-loxP-eGFP incrociati con il fibroblasto cardiaco che esprime la linea di knock-in Tcf21-MerCreMer. Questa tecnica è stata utilizzata per osservare la dinamica di localizzazione dei fibroblasti in tutto il ventricolo sinistro adulto nei topi sani e nei modelli fibrotici di topo di malattie cardiache. È interessante notare che, in un modello di lesione, sono stati osservati modelli unici di fibroblasti cardiaci nel cuore del topo ferito che seguiva bande di fibre avvolte nella direzione della contrattile. Nei modelli di lesioni ischemiche si è verificata la morte dei fibroblasti, seguita dal ripopolamento dalla zona di confine infarto. Collettivamente, questa raffinata tecnica di chiar chiaritura del tessuto cardiaco e il sistema di imaging digitalizzato consentono la visualizzazione 3D dei fibroblasti cardiaci nel cuore senza i limiti del fallimento della penetrazione degli anticorpi o problemi precedenti che circondano la fluorescenza persa a causa della lavorazione dei tessuti.

I fibroblasti cardiaci sono essenziali per la funzione basale del cuore e per la risposta a lesioni cardiache. Precedenti tentativi di comprendere la disposizione e la morfologia di queste cellule sono stati condotti in gran parte in ambienti 2D. Tuttavia, è stata pubblicata una raffinataschiaritura deitessuti cardiaci ( Figura 2 ) e una tecnica di imaging 3D, che consente una visualizzazione avanzata e più dettagliata dei fibroblasti cardiaci. Con questa tecnica di imaging, i fibroblasti ...

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Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

Un metodo raffinato di compensazione dei tessuti è stato sviluppato e applicato al cuore adulto del topo. Questo metodo è stato progettato per cancellare il tessuto cardiaco denso e autofluorescente, pur mantenendo la fluorescenza dei fibroblasti etichettata attribuita a una strategia genetica reporter.

Raffinata compensazione dei tessuti basata su CLARITY per l'organizzazione tridimensionale dei fibroblasti nei cuori di topo sani e feriti

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

Questo nuovo protocollo di compensazione dei tessuti migliora la tecnologia esistente per consentire uno sguardo in vivo più accurato su specifici tipi di cellule nel cuore e sul loro comportamento in condizioni di lesione. Questo protocollo è rapido e abbastanza semplice. Consente il mantenimento della fluorescenza marca con minima interferenza dall'autofluorescenza del tessuto di fondo senza richiedere colorazione cellulare o tissutale.Iniziare utilizzando una garza imbevuta di etanolo al 70% per pulire la superficie ventrale del mouse sperimentale. Usa le forbici chirurgiche per fare un'incisione trasversale di tre centimetri, circa tre metri sotto il processo xifoide e deglovare il topo dall'addome al processo xifoide per separare la pelle dal tessuto della parete addominale sottostante. Fai un'incisione trasversale di due centimetri nel tessuto della parete addominale sottocutanea, tre centimetri sotto il processo xifoide e fai un taglio verticale da questa incisione lungo la linea mediana attraverso la gabbia toracica.Schienare la gabbia toracica per esporre il cuore. E utilizzare una siringa da 10 millilitri dotata di un ago calibro 27 per iniettare PBS freddo nella vena cava e nell'aorta superiori. Quando tutto il sangue è stato lavato dal cuore, consegnare 10 millilitri di FREDDO 4%PFA nella vena cava superiore e nell'aorta per iniziare il processo di fissazione.Quando tutto il fissatore è stato lampeggiato, asportare il cuore e utilizzare un bisturi a lama dritta per separare gli atri, il ventricolo destro e il setto e il ventricolo sinistro. Mettere il cuore in un tubo conico da 15 millilitri di PFA freddo al 4% per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius su un nutator. La mattina seguente, aggiungere una soluzione di fotoaziatore allo 0,25% a una soluzione di idrogel preparata al momento e trasferire il cuore all'idrogel.Avvolgere il tubo conico in un foglio per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius senza disturbi fisici. La mattina successiva riscaldare il tubo in un bagno di perline di 37 gradi celsius per 2,5 ore prima di utilizzare le forcep per trasferire attentamente il cuore in un tubo da 15 millilitri di PBS. Lavare il cuore tre volte in PBS per un'ora per lavaggio a 37 gradi Celsius su un nutator e trasferire il cuore nel cestello di una macchina per elettroforesi attiva.Fissare il coperchio in posizione e riempire il serbatoio attivo della camera di elettroforesi con soluzione di compensazione dell'elettroforesi. Una volta che la camera è piena, immergere il cestello nella soluzione e stringere il tappo sulla macchina per l'elettroforesi in posizione. Quindi eseguire la macchina per elettroforesi a 1,5 ampere e 37 gradi celsius per 1,5 ore.Dopo l'elettroforesi, controllare visivamente il cuore per assicurarsi che non rimanga tessuto opaco. Lavare il cuore sgombrato tre volte in un due da 15 millilitri per un'ora in PBS fresco a 37 gradi celsius per lavaggio su un nutator. Prima di immergere il cuore in agente decolorante per ridurre la fluorescenza automatica dell'eme.Dopo 48 ore, lavare il cuore tre volte in PBS come dimostrato ed equilibrare il cuore in RIMS appena preparato per 48 ore prima dell'imaging. Per l'imaging 3D del cuore cancellato, posizionare innanzitutto un sottile strato di grasso sottovuoto sul fondo di un serbatoio inferiore stampato in 3D, la stessa altezza del campione che viene immaginato. Riempire il serbatoio con RIMS e utilizzare una punta di pipetta per rimuovere eventuali bolle.Posizionare con cura il cuore nel RIMS con la parete ventricolare sinistra rivolta verso l'alto, facendo attenzione che nessuna bolla sia introdotta nella soluzione. Utilizzare grasso sottovuoto per attaccare un coperchio di vetro alla superficie inferiore di un pezzo del serbatoio superiore stampato in 3D e posizionare il coperchio superiore del serbatoio verso il basso sui serbatoi inferiori, facendo attenzione a evitare bolle. Quindi riempire i serbatoi principali con glicerolo.Usa un microscopio confocale per immagini i cuori cancellati. La combinazione di una raffinata pulizia dei tessuti cardiaci con l'imaging 3D consente una visualizzazione dettagliata avanzata dei fibroblasti cardiaci. Utilizzando questa tecnica di imaging, i fibroblasti sono osservati essere densamente imballati e avere una morfologia spinosa nei cuori illesi.Dopo la lesione da riperfusione dell'ischemia, si vede una perdita di fibroblasti cardiaci nella regione ischemica per i primi tre giorni dopo l'infortunio. Al settimo e al 14° giorno, i fibroblasti sono migrati o proliferati per ripopolare l'area del tessuto ferito. Al giorno 28, la popolazione di fibroblasti cardiaci che circonda le aree ferite del cuore è alla loro massima densità.Un giorno e mezzo dopo la lesione da infarto del miocardio, pochi fibroblasti rimangono all'interno del ventricolo sinistro ferito. Al terzo giorno, tuttavia, i fibroblasti si espandono e sono presenti nella maggior parte del ventricolo sinistro. A differenza della chirurgia ischemica, l'infusione di angiotensina due e fenoefrina per diverse settimane non si traducono in perdita cardiaca del tessuto e assottigliamento delle pareti.Invece, i fibroblasti si allineano lungo l'asse del modello di contrazione dell'elica destrorsa come si vede quando si utilizza il protocollo raffinato per la compensazione dei tessuti. Inoltre, dopo il trattamento con angiotensina due e fenoefrina, i fibroblasti appaiono piccoli e arrotondati rispetto alla forma del mandrino osservata nei modelli di rifusione di ischemia e lesione da infarto del miocardio. La radura elettroforetica deve essere eseguita con attenzione soprattutto quando si lavora con cuori che hanno subito protocolli di lesione.Questo protocollo può essere utilizzato per valutare come i fibroblasti cardiaci reagiscono alle lesioni in vivo. Diversi marcatori fluorescenti possono anche essere utilizzati per capire come il cuore risponde alle lesioni a livello cellulare.

Research

JoVE Journal

Medicine

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