Name: refined clarity-based tissue clearing for three-dimensional fibroblast organization in healthy and injured mouse hearts
Uploaded: 2021-05-16T14:00:00
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著者らは、CCHMC共焦点イメージングコアが、このモデルの開発における支援と指導を認め、臨床工学のマット・ベイティがすべての3Dプリント部品の設計を行うことを認めたいと考えています。デメトリア・フィシェッサーは国立衛生研究所(NHLBI、T32 HL125204)からの訓練助成金によって支えられ、ジェフリー・D・モルケンティンはハワード・ヒューズ医学研究所の支援を受けました。

マウスを含むすべての実験は、シンシナティ小児病院医療センターの施設動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。機関はまた、AAALAC (米国ラボラトリーアニマルケア認定協会) 認定されています.マウスは頸部脱臼を介して安楽死させ、生存手術を受けているマウスには痛みの軽減が与えられた(下記参照)。疼痛管理および安楽死のために使用されるすべての方法は、米国獣医医?...

<ol>
	<li>Nagaraju, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblast+phenotype+and+reversibility+of+fibrosis+in+patients+With+end-stage+heart+failure.">Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure.</a> Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).</li><li>Yoon, S., Eom, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+failure+with+preserved+ejection+fraction:+present+status+and+future+directions.">Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions.</a> Experimental and Molecular Medicine. 51 (12), 1-9 (2019).</li><li>Borlaug, B. A., Redfield, M. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+1-phosphate+S1P2+and+S1P3+receptor-mediated+Akt+activation+protects+against+in+vivo+myocardial+ischemia-reperfusion+injury.">Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 292 (6), 2944-2951 (2007).</li><li>Michael, L. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+remodeling+in+a+mouse+model+of+myocardial+infarction.">Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 274 (5), 1812-1820 (1998).</li><li>Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+echocardiographic+assessment+of+left+ventricular+dimensions+and+function+after+myocardial+infarction+in+mice.">Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice.</a> Cardiovascular Research. 45 (2), 330-338 (2000).</li><li>Vagnozzi, R. 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Principles and application.</a> Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 366-376 (2008).</li><li>Arts, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macroscopic+three-dimensional+motion+patterns+of+the+left+ventricle.">Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).</li><li>Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. 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この記事では、ベースラインと次の傷害の両方で生体内の心臓線維芽細胞を視覚化し、マウス心臓の線維芽細胞を特徴付け、よりよく理解することを可能にする組織クリアリングのための洗練された方法を提示する。この強化されたプロトコルは、成人または新生児心臓12、13、14、16、17、20の特定の細胞タイプを同定しよ?...

心筋細胞は心臓の最大の体積分率を含むが、心臓線維芽細胞はより豊富であり、この器官のベースライン構造および修復特徴の調節に重大に関与する。心臓線維芽細胞は、移動性が高く、機械的に応答性が高く、その活性化の程度に応じて典型的に範囲が広がっています。心臓線維芽細胞は、細胞外マトリックス(ECM)の正常なレベルを維持するために必要であり、これらの細胞によるあまりにも少ないまたは多すぎるECM産生は、疾患1、2、3につながる可能性がある。心臓病における彼らの重要性を考えると、心臓線維芽細胞は、特に過剰な線維症4、5、6、7を制限しようとする新しい治療戦略を特定するための調査のますます重要なトピックとなっている。傷害時に、線維芽細胞は活性化し、筋線維芽細胞として知られているより合成細胞タイプに分化し、増殖し、豊富なECMを分泌し、心室を改造するのに役立つ収縮活性を有する。
心臓線維芽細胞は、2次元培養6、8、9、10においてその特性について広範囲に評価されてきたが、ベースラインまたは疾患刺激で、3次元の生きている心臓におけるその特性およびダイナミクスについてはるかに少なく理解されている。ここで、細胞の線維芽細胞の蛍光を維持しつつ、成人マウス心臓を組織クリアする精製方法が記載されている。心臓の中で、Tcf21は静止線維芽細胞4の比較的特異的なマーカーである。タモキシフェンが誘導可能なMerCreMerタンパク質を活性化するために与えられた後、本質的にすべての静止線維芽細胞は永久に生体内での追跡を可能にするRosa26遺伝子座から強化された緑色蛍光タンパク質(eGFP)を発現するであろう。
多数の確立された組織クリアプロトコルが存在し、そのうちのいくつかは心臓11、12、13、14、15、16、17に適用されている。しかし、異なる組織クリアプロトコルで使用される試薬の多くは、内因性蛍光信号18をクエンチすることが発見されている。さらに、成人心臓は、自己蛍光19を生成する豊富なヘム群含有タンパク質のためにクリアすることが困難である。したがって、このプロトコルの目標は、ビボ12、13、14、16、17、20における最適な3D可視化のために、負傷した成人心臓におけるヘム自己蛍光の同時阻害と共に線維芽細胞マーカー蛍光を維持することであった。
インビボで心臓線維芽細胞を調べようとする以前の研究は、これらの細胞を標識するために浸透抗体を採用したが、そのような研究は抗体の浸透および心血管構造14、16、17、20によって制限された。サラモンらは、新生児心臓における局所神経蛍光の維持と組織のクリアを示しているが、Nehrhoffらは骨髄細胞をマーキングする蛍光の維持を示しているが、心室壁全体を通る内因性蛍光の維持は、ベースラインまたは傷害後の成人心臓線維芽細胞の視覚化を含めて、まだ実証されていない。この組織クリアリングプロトコルは、CLARITY法(透明脂質交換アクリルアミドハイブリダイドリジジッドイメージング/イムノステイン/イン・シチュハイブリダイゼーション適合組織ヒドロゲル)およびPEGASOS(ポリエチレングリコール(PEG)関連溶媒システム)に基づいて、以前のプロトコルの混合物を精製します。この洗練されたプロトコルは、ベースラインでマウス心臓の心臓線維芽細胞のより堅牢な検査を可能にし、それらが異なるタイプの傷害にどのように反応するかの。プロトコルは簡単で再現可能であり、生体内の心臓線維芽細胞の挙動を特徴付けるのに役立ちます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 braided silk</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K871H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-0 prolene</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8730H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiotensin II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9525-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial Tear Ointment</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>048272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D27802-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLUture topical tissue adhesive</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Start Analysis Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-osmotic pumps</td>
			<td>Alzet</td>
			<td>Model 1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements Analysis Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R HD upright microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal autoclaved chow</td>
			<td>Labdiet</td>
			<td>5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, 
			N&#39;-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide</td>
			<td>CosmoBio</td>
			<td>AXS-1002424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine Hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoinitiator</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>VA-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>Jax Stock No:012429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride solution</td>
			<td>Hospira, Inc.</td>
			<td>NDC 0409-4888-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen food</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>TD.130860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol, N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>122262-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoretic clearing chamber</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C30001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoretic clearing solution</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoresis tissue basket</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoresis tissue basket holder</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C12002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

refined clarity-based tissue clearing for three-dimensional fibroblast organization in healthy and injured mouse hearts

心血管疾患は、世界中で最も一般的な死亡率の原因であり、しばしば心臓機能の変化と心室の剛性の増加につながる可能性がある高められた心臓線維症によってマークされています。心室線維症のこの増加は、常駐線維芽細胞の活性化によるもので、これらの細胞が3次元(3-D)心臓内でどのように動作するかは、ベースラインまたは活性化後に、よく理解されていない。線維芽細胞が3D心臓における心臓病とそのダイナミクスにどのように寄与するかを調べるために、マウス心臓全体の蛍光標識心臓線維芽細胞を示す洗練されたCLARITYベースの組織クリアリングおよびイメージング法が開発されました。組織常駐線維芽細胞は、Tcf21-MerCreMerノックインラインを発現する心臓線維芽細胞と交差するRosa26-loxP-eGFPフローレストレポーターマウスを使用して遺伝的に標識した。この技術は、健康なマウスおよび心臓病の線維化マウスモデルにおける成人左心室全体にわたる線維芽細胞局在化ダイナミクスを観察するために使用された。興味深いことに、1つの傷害モデルでは、収縮方向に包まれた繊維のバンドに続く損傷したマウス心臓で心臓線維芽細胞のユニークなパターンが観察された。虚血性傷害モデルでは、線維芽細胞死が起こり、続いて梗塞境界領域からの再集団化が起こった。総称して、この精製された心臓組織の明確化技術およびデジタル化された画像化システムは、抗体の侵入の失敗または組織処理による失われた蛍光を取り巻く以前の問題の制限なしに心臓の心臓線維芽細胞を3D視覚化することを可能にする。

心臓線維芽細胞は、心臓のベースライン機能および心臓損傷への応答に不可欠です。これらの細胞の配置と形態を理解するための以前の試みは、主に2D設定で行われてきました。しかし、洗練された心臓組織クリアリング(図2)および3Dイメージング技術が発表されており、心臓線維芽細胞の高度で詳細な視覚化が可能です。このイメージング技術により、線維芽細胞は密...

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Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

組織のクリアの精製方法が開発され、成体マウスの心臓に適用された。この方法は、遺伝的レポーター戦略に起因する標識された線維芽細胞蛍光を維持しながら、緻密な自己蛍光心臓組織をクリアするように設計された。

健康で負傷したマウス心臓における三次元線維芽細胞組織のための精製されたCLARITYベースの組織クリアリング

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

この新しい組織クリアリングプロトコルは、既存の技術を改善し、より正確なin vivoで心臓内の特定の細胞タイプと傷害条件下でのそれらの行動を見ることができるようにする。このプロトコルは、迅速かつかなり簡単です。細胞または組織染色を必要とせずに、バックグラウンド組織自動蛍光からの干渉を最小限に抑え、マルカ蛍光の維持を可能にする。実験マウスの腹側表面を洗浄するために70%エタノール浸漬ガーゼパッドを使用して開始します。手術用ハサミを使用して、xiphoidプロセスの約3メートル下に約3メートル下の3センチメートルの横切り切開を行い、マウスを腹部からxiphoidプロセスにデグローブして、下層の腹壁組織から皮膚を分離する。皮下腹壁組織で2センチメートルの横切り切開を行い、xiphoidプロセスより3センチメートル下に、リブケージを通して正中線の上にこの切開から垂直カットを行います。胸を後ろに固定して心臓を露出します。そして、優れた静脈と大オルタに冷たいPBSを注入するために27ゲージ針を装備した10ミリリットルの注射器を使用してください。すべての血液が心臓から洗い流されたら、10ミリリットルの冷たい4%PFAを上の大静脈と大オルタに送り込み、固定プロセスを開始する。固定剤のすべてが点滅したら、心臓を切除し、まっすぐなブレードメスを使用して心房、右心室、中隔および左心室を分離します。心臓を冷たい4%PFAの15ミリリットルの円錐形チューブに入れ、ヌテットターで摂氏4度で一晩インキュベーションします。翌朝、0.25%の写真のイニシエーター溶液を作りたてのヒドロゲル溶液に加え、心臓をハイドロゲルに移します。物理的な乱れなしに摂氏4度で一晩インキュベーションのためにホイルで円錐管を包みます。翌朝、37度のビードバスで2.5時間チューブを温め、鉗子を使用して心臓をPBSの15ミリリットルチューブに慎重に移します。PBSで3回、1回、1回、1回、37度で1回、ヌテエーターで心臓を洗浄し、心臓をアクティブな電気泳動機のバスケットに移します。蓋を所定の位置に固定し、アクティブな電気泳動チャンバの貯蔵所に電気泳動クリア液を充填します。チャンバーがいっぱいになったら、溶液中のバスケットを沈め、電気泳動機のキャップを所定の位置に締め付けます。その後、1.5アンペアと摂氏37度で1.5時間電気泳動機を実行します。電気泳動後、心臓を視覚的に調べて、不透明な組織が残らないようにします。クリアした心臓を15ミリリットル2回、1回、新鮮なPBSで1回、ヌテット器で洗浄1回37度で洗浄します。ヘムオート蛍光を低減させる脱色剤に心臓を沈める前に。48時間後、示されているようにPBSで心臓を3回洗浄し、イメージング前に48時間、作りたてのRIMSで心臓を平衡化します。クリアされた心臓の3Dイメージングの場合、まず、3Dプリントされた底部の底部に真空グリースの薄い層を配置し、画像化されるサンプルと同じ高さ。RIMS でリザーバを充填し、すべての気泡を除去するピペットチップを使用します。慎重に左心室壁を上に向けてRIMSに心臓を置き、溶液に泡が導入されていないのに注意してください。真空グリースを使用して、3Dプリントされたトップリザーバーピースの底面にガラスカバースリップを取り付け、上部のリザーバカバースリップを底の貯水池に下ろし、気泡を避けるように注意してください。その後、グリセロールで上部の貯水池を充填します。共焦点顕微鏡を使用して、クリアされた心臓を画像化します。3D画像と洗練された心臓組織のクリアリングを組み合わせることで、心臓線維芽細胞の高度な詳細な可視化が可能になります。このイメージング技術を用いて、線維芽細胞は密に詰め込まれ、傷つけていない心臓に紡錘状の形態を有することが観察される。虚血再灌流傷害後、傷害後最初の3日間は虚血領域で心臓線維芽細胞の喪失が見られる。7日目と14日目までに、線維芽細胞は、負傷した組織領域を再建するために移動または増殖した。28日目までに、心臓の負傷した領域を取り巻く心臓線維芽細胞集団は最大の密度にある。心筋梗塞損傷の1日半後、負傷した左心室内に残っている線維芽細胞はほとんど残っていません。しかし、3日目までに線維芽細胞は膨張し、左心室のほとんどに存在する。虚血性手術とは対照的に、数週間にわたってアンジオテンシン2とフェノールフリンの注入は、心臓組織の喪失および壁の薄化をもたらさない。代わりに、線維芽細胞は、組織クリアリングプロトコルに精製されたを使用する場合に見られるように、右手のらせん収縮パターンの軸に沿って整列する。また、アンジオテンシン2とフェノールフリン治療後、虚血再プロフュージョンおよび心筋梗塞損傷のモデルで観察される紡錘形状とは対照的に、線維芽細胞は小さく丸みを帯び現れる。電気泳動クリアは、特に損傷プロトコルを受けた心臓で作業する場合は慎重に行う必要があります。このプロトコルは、心臓線維芽細胞が生体内の傷害にどのように反応するかを評価するために使用することができる。異なる蛍光マーカーは、心臓が細胞レベルでの傷害にどのように反応するかを理解するためにも使用できます。

Research

JoVE Journal

Medicine

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