Name: refined clarity-based tissue clearing for three-dimensional fibroblast organization in healthy and injured mouse hearts
Uploaded: 2021-05-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts at JoVE.com

Forfatterne ønsker å anerkjenne CCHMC Confocal Imaging Core for deres hjelp og veiledning i utviklingen av denne modellen, samt Matt Batie fra Clinical Engineering for utformingen av alle 3D-trykte deler. Demetria Fischesser ble støttet av et opplæringsstipend fra National Institutes of Health, (NHLBI, T32 HL125204) og Jeffery D. Molkentin ble støttet av Howard Hughes Medical Institute.

Alle eksperimenter med mus ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Cincinnati Children's Hospital Medical Center. Institusjonen er også AAALAC (American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care) sertifisert. Mus ble euthanized via cervical dislocation, og mus som gjennomgår overlevelse kirurgiske prosedyrer ble gitt smertelindring (se nedenfor). Alle metoder som brukes for smertebehandling og eutanasi er basert på anbefalinger fra panelet om eutanasi fra American Veterina...

<ol>
	<li>Nagaraju, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblast+phenotype+and+reversibility+of+fibrosis+in+patients+With+end-stage+heart+failure.">Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure.</a> Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).</li><li>Yoon, S., Eom, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+failure+with+preserved+ejection+fraction:+present+status+and+future+directions.">Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions.</a> Experimental and Molecular Medicine. 51 (12), 1-9 (2019).</li><li>Borlaug, B. A., Redfield, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diastolic+and+systolic+heart+failure+are+distinct+phenotypes+within+the+heart+failure+spectrum.">Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum.</a> Circulation. 123, 2006-2014 (2011).</li><li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+cardiac+fibroblast.">Defining the cardiac fibroblast.</a> Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+fibroblast+differentiated+states+underlie+scar+formation+in+the+infarcted+mouse+heart.">Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (5), 2127-2143 (2018).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Sadeghi, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+3D+cardiac+fibrotic+tissue+to+study+fibrotic+remodeling.">Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (11), 1601434 (2017).</li><li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+diverse+cardiac+cell+types+by+reprogramming+fibroblasts+with+cardiac+transcription+factors.">Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors.</a> Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).</li><li>Bruns, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+right+ventricular+fibroblast+secretome+drives+cardiomyocyte+dedifferentiation.">The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation.</a> PLoS One. 14 (8), 0220573 (2019).</li><li>Ski&#246;ldebrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+activation+of+human+cardiac+fibroblasts+leads+to+altered+calcium+signaling,+decreased+connexin+43+expression+and+increased+glutamate+secretion.">Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion.</a> Heliyon. 3 (10), 00406 (2017).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+pegasos+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method.</a> Cell Research. 28, 803-818 (2018).</li><li>Kolesov&#225;, H., &#268;apek, M., Radochov&#225;, B., Jan&#225;&#269;ek, J., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+tissue+clearing+methods+and+3D+imaging+techniques+for+visualization+of+GFP-expressing+mouse+embryos+and+embryonic+hearts.">Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).</li><li>Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+cardiac+injury+response+of+targeted+cell+populations+via+cleared+heart+three-dimensional+imaging.">Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+transparent+intact+cardiac+tissue+with+single-cell+resolution.">Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution.</a> Biomedical Optics Express. 9 (2), 423-436 (2018).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Yokoyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+sympathetic+hyperinnervation+and+denervation+after+myocardial+infarction+by+three-dimensional+assessment+of+the+cardiac+sympathetic+network+in+cleared+transparent+murine+hearts.">Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts.</a> PLoS One. 12 (7), 0182072 (2017).</li><li>Perbellini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-of-Acrylamide+SDS-based+Tissue+Clearing+(FASTClear)+for+three+dimensional+visualization+of+myocardial+tissue.">Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue.</a> Scientific Reports. 7, 5188 (2017).</li><li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling.">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li><li>Nehrhoff, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+in+CUBIC-cleared+mouse+heart+tissue:+going+deeper.">3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper.</a> Biomedical Optics Express. 7 (9), 3716-3720 (2016).</li><li>Yamamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+reporter+mouse+line+for+Cre-+and+FLP-dependent+lineage+analysis.">A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis.</a> Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).</li><li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+substances+to+laboratory+animals:+Routes+of+administration+and+factors+to+consider.">Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).</li><li>Means, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+1-phosphate+S1P2+and+S1P3+receptor-mediated+Akt+activation+protects+against+in+vivo+myocardial+ischemia-reperfusion+injury.">Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 292 (6), 2944-2951 (2007).</li><li>Michael, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+ischemia+and+reperfusion:+A+murine+model.">Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 269 (6), 2147-2154 (1995).</li><li>Ahn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+myocardial+infarcts+of+a+predictable+size+and+location+by+branch+pattern+probability-assisted+coronary+ligation+in+C57BL/6+mice.">Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice.</a> American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).</li><li>Patten, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+remodeling+in+a+mouse+model+of+myocardial+infarction.">Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 274 (5), 1812-1820 (1998).</li><li>Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+echocardiographic+assessment+of+left+ventricular+dimensions+and+function+after+myocardial+infarction+in+mice.">Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice.</a> Cardiovascular Research. 45 (2), 330-338 (2000).</li><li>Vagnozzi, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acute+immune+response+underlies+the+benefit+of+cardiac+stem+cell+therapy.">An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy.</a> Nature. 577, 405-409 (2020).</li><li>Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist+mechanics+of+the+left+ventricle.+Principles+and+application.">Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application.</a> Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 366-376 (2008).</li><li>Arts, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macroscopic+three-dimensional+motion+patterns+of+the+left+ventricle.">Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).</li><li>Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+muscle+actin-positive+cells+in+healing+human+myocardial+scars.">The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars.</a> American Journal of Pathology. 145 (4), 868-875 (1994).</li><li>Hashmi, S., Al-Salam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myocardial+infarction+and+myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+A+comparison.">Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison.</a> International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).</li></ol>

Denne artikkelen presenterer en raffinert metode for vevsrydding som gjør det mulig å visualisere hjertefibroblaster in vivo, både ved baseline og etter skade, for å karakterisere og bedre forstå fibroblaster i musehjertet. Denne forbedrede protokollen tar for seg begrensninger i eksisterende vevsklareringsprotokoller som har forsøkt å identifisere bestemte celletyper i voksen- eller nyfødthjertet12,13,14,<sup...

Selv om kardiomyocytter utgjør den største volumfraksjonen i hjertet, er hjertefibroblaster mer rikelig og er kritisk involvert i å regulere de grunnleggende strukturelle og reparative egenskapene til dette organet. Hjertefibroblaster er svært mobile, mekanisk responsive og fenotypiske, avhengig av omfanget av aktiveringen. Hjertefibroblaster er nødvendige for å opprettholde normale nivåer av ekstracellulær matrise (ECM), og for lite eller for mye ECM-produksjon av disse cellene kan føre til sykdom1,2,3. Gitt deres betydning i sykdom, har hjertefibroblaster blitt et stadig viktigere tema for undersøkelse mot å identifisere nye behandlingsstrategier, spesielt i forsøk på å begrense overdreven fibrose4,5,6,7. Ved skade aktiverer og differensierer fibroblaster til en mer syntetisk celletype kjent som en myofibroblast, som kan være proliferativ og utskiller rikelig ECM, samt har kontraktil aktivitet som bidrar til å ombygge ventriklene.
Mens hjertefibroblaster har blitt grundig evaluert for sine egenskaper i 2D-kulturer6,8,9,10, er mye mindre forstått av deres egenskaper og dynamikk i 3D levende hjerte, enten ved baseline eller med sykdomstimulering. Her har en raffinert metode blitt beskrevet for å vev fjerne det voksne musehjertet mens du opprettholder fluorescensen til fibroblaster merket med et Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer genetisk reportersystem. I hjertet er Tcf21 en relativt spesifikk markør for passiv fibroblaster4. Etter at tamoxifen er gitt for å aktivere det induserbare MerCreMer-proteinet, vil i hovedsak alle quiescent fibroblaster permanent uttrykke forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP) fra Rosa26-locus, noe som gjør det mulig for deres sporing in vivo.
Det finnes mange veletablerte vevsryddingsprotokoller, hvorav noen er brukt på hjertet11,12,13,14,15,16,17. Imidlertid har mange av reagensene som brukes i forskjellige vevsryddingsprotokoller blitt funnet å slukke endogene fluorescenssignaler18. I tillegg er voksenhjertet vanskelig å fjerne på grunn av rikelig heme gruppeholdige proteiner som genererer autofluorescence19. Derfor var målet med denne protokollen å bevare fibroblastmarkørfluorescens med samtidig hemming av heme autofluorescence i det skadede voksne hjertet for optimal 3D-visualisering in vivo12,13,14,16,17,20.
Tidligere studier som forsøkte å undersøke hjertefibroblast in vivo brukte perfused antistoffer for å merke disse cellene, selv om slike studier var begrenset av antistoff penetrasjon og hjertevaskulær struktur14,16,17,20. Selv om Salamon et al. har vist vevsrydding med vedlikehold av aktuell nevronal fluorescens i neonatalhjertet, og Nehrhoff et al. har vist vedlikehold av fluorescens som markerer myeloide celler, er vedlikehold av endogen fluorescens gjennom hele ventrikkelveggen ennå ikke demonstrert, inkludert visualisering av voksne hjertefibroblaster ved baseline eller etter skade13,20. Denne vevsryddingsprotokollen foredler en blanding av tidligere protokoller basert på CLARITY-metoden (klar lipid-utvekslet akrylamid-hybridisert stiv imaging / immunostaining / in situ-hybridiseringskompatibel vevshydrgel) og PEGASOS (polyetylenglykol (PEG)-assosiert løsningsmiddelsystem). Denne raffinerte protokollen tillot en mer robust undersøkelse av hjertefibroblaster i musehjertet ved baseline og hvordan de reagerer på ulike typer skader. Protokollen er grei og reproduserbar og vil bidra til å karakterisere oppførselen til hjertefibroblaster in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 braided silk</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K871H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-0 prolene</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8730H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiotensin II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9525-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial Tear Ointment</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>048272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D27802-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLUture topical tissue adhesive</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Start Analysis Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-osmotic pumps</td>
			<td>Alzet</td>
			<td>Model 1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements Analysis Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R HD upright microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal autoclaved chow</td>
			<td>Labdiet</td>
			<td>5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, 
			N&#39;-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide</td>
			<td>CosmoBio</td>
			<td>AXS-1002424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine Hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoinitiator</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>VA-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>Jax Stock No:012429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride solution</td>
			<td>Hospira, Inc.</td>
			<td>NDC 0409-4888-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen food</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>TD.130860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol, N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>122262-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoretic clearing chamber</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C30001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoretic clearing solution</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoresis tissue basket</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoresis tissue basket holder</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C12002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

refined clarity-based tissue clearing for three-dimensional fibroblast organization in healthy and injured mouse hearts

Kardiovaskulær sykdom er den mest utbredte årsaken til dødelighet over hele verden og er ofte preget av økt hjertefibrose som kan føre til økt ventrikulær stivhet med endret hjertefunksjon. Denne økningen i hjerte ventrikulær fibrose skyldes aktivering av bosatte fibroblaster, selv om hvordan disse cellene opererer i det 3-dimensjonale (3D) hjertet, ved baseline eller etter aktivering, ikke er godt forstått. For å undersøke hvordan fibroblaster bidrar til hjertesykdom og deres dynamikk i 3D-hjertet, ble det utviklet en raffinert CLARITY-basert vevsryddings- og avbildningsmetode som viser fluorescerende merkede hjertefibroblaster i hele musehjertet. Vevsboende fibroblaster ble genetisk merket ved hjelp av Rosa26-loxP-eGFP florescent reporter mus krysset med hjertefibroblast som uttrykker Tcf21-MerCreMer knock-in linje. Denne teknikken ble brukt til å observere fibroblast lokaliseringsdynamikk gjennom hele voksen venstre ventrikel hos friske mus og i fibrotiske musemodeller av hjertesykdom. Interessant, i en skademodell, ble unike mønstre av hjertefibroblaster observert i det skadede musehjertet som fulgte bånd av innpakkede fibre i kontraktilretningen. I iskemiske skademodeller oppstod fibroblastdød, etterfulgt av repopulering fra den infarkte grensesonen. Samlet gir denne raffinerte hjertevevsklargjøringsteknikken og digitalisert bildebehandlingssystem mulighet for 3D-visualisering av hjertefibroblaster i hjertet uten begrensningene av antistoffinntrengningssvikt eller tidligere problemer rundt tapt fluorescens på grunn av vevsbehandling.

Hjertefibroblaster er avgjørende for hjertets basisfunksjon så vel som for respons på hjerteskade. Tidligere forsøk på å forstå ordningen og morfologien til disse cellene har i stor grad blitt utført i 2D-innstillinger. Imidlertid er det publisert en raffinert hjertevevsrydding (figur 2) og 3D-bildeteknikk, noe som muliggjør avansert, mer detaljert visualisering av hjertefibroblaster. Med denne bildeteknikken ble fibroblaster funnet å være tett pakket og har en spindelformet morfo...

Watch this Scientific Journal Video about Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts at JoVE.com

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

En raffinert metode for vevsrydding ble utviklet og brukt på det voksne musehjertet. Denne metoden ble designet for å fjerne tett, autofluorescerende hjertevev, samtidig som den opprettholder merket fibroblastfluorescens tilskrevet en genetisk reporterstrategi.

Raffinert CLARITY-basert vevsrydding for tredimensjonal fibroblastorganisasjon i sunne og skadde musehjerter

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

Denne nye vevsryddingsprotokollen forbedrer eksisterende teknologi for å muliggjøre et mer nøyaktig in vivo-blikk på spesifikke celletyper i hjertet og deres oppførsel under skadeforhold. Denne protokollen er rask og ganske enkel. Det tillater vedlikehold av marca fluorescens med minimal interferens fra bakgrunnsvev automatisk fluorescens uten å kreve celle- eller vevsfarging.Begynn med å bruke en 70% etanol gjennomvåt gasbindpute for å rengjøre den ventrale overflaten av den eksperimentelle musen. Bruk kirurgisk saks for å lage et tre centimeter tverrsnitt, omtrent tre meter under xiphoid-prosessen og deglove musen fra magen til xiphoid-prosessen for å skille huden fra det underliggende bukveggvevet. Lag et to centimeter tverrsnitt i det subkutane bukveggvevet, tre centimeter under xiphoid-prosessen og gjør et vertikalt kutt fra dette snittet opp midtlinjen gjennom ribbeburet.Fest ribbeinburet tilbake for å eksponere hjertet. Og bruk en 10 milliliter sprøyte utstyrt med en 27 gauge nål for å injisere kald PBS i den overlegne vena cava og aorta. Når alt blodet har blitt spylt fra hjertet, lever 10 milliliter kaldt 4% PFA inn i den overlegne vena cava og aorta for å starte fikseringsprosessen.Når alle fixative har blitt blinket, sluke hjertet og bruke en rett blad skalpell for å skille atria, høyre ventrikel og septum og venstre ventrikel. Plasser hjertet i et 15 milliliter konisk rør med kaldt 4% PFA for en overnatting inkubasjon ved fire grader celsius på en mutter. Neste morgen legger du til en 0,25% fotoinitiatorløsning til en nylaget hydrogelløsning og overfører hjertet til hydrogelen.Pakk det koniske røret i folie for en overnatting inkubasjon ved fire grader celsius uten fysisk forstyrrelse. Neste morgen varme røret i en 37 grader celsius perle bad i 2,5 timer før du bruker tang for å forsiktig overføre hjertet til en 15 milliliter rør av PBS. Vask hjertet tre ganger i PBS i en time per vask ved 37 grader celsius på en mutter og overfør hjertet inn i kurven til en aktiv elektroforesemaskin.Fest lokket og fyll det aktive elektroforesekammerbeholderen med elektroforeseryddingsløsning. Når kammeret er fullt, senk kurven ned i løsningen og stram hetten på elektroforesemaskinen på plass. Kjør deretter elektroforesemaskinen på 1,5 ampere og 37 grader celsius i 1,5 timer.Etter elektroforese, kontroller hjertets visuelt for å sikre at ingen ugjennomsiktig vev forblir. Vask det ryddede hjertet tre ganger i en 15 milliliter to i en time i fersk PBS ved 37 grader celsius per vask på en mutter. Før du nedsenker hjertet i decolorizing agent for å redusere heme auto fluorescens.Etter 48 timer, vask hjertet tre ganger i PBS som demonstrert og likevekt hjertet i nylagde RIMS i 48 timer før avbildning. For 3D-avbildning av det ryddede hjertet, plasser først et tynt lag med vakuumfett på bunnen av et 3D-trykt bunnreservoar, samme høyde som prøven som blir avbildet. Fyll reservoaret med RIMS og bruk en pipettespiss for å fjerne eventuelle bobler.Plasser forsiktig hjertet i RIMS med venstre ventrikkelvegg vendt opp, og pass på at ingen bobler blir introdusert i løsningen. Bruk vakuumfett til å feste en glassdekselslipp til bunnoverflaten på et 3D-trykt toppreservoarstykke og plasser de øverste reservoardekslene ned på bunnreservoarene, og pass på at du unngår bobler. Fyll deretter de øverste reservoarene med glyserol.Bruk et konfokalt mikroskop for å avbilde de ryddede hjertene. Kombinere raffinert hjertevevsrydding med 3D-avbildning gir en avansert detaljert visualisering av hjertefibroblaster. Ved hjelp av denne bildeteknikken observeres fibroblaster å være tett pakket og å ha en spindelformet morfologi i uskadede hjerter.Etter iskemi reperfusjonsskade ses tap av hjertefibroblaster i iskemisk region de første tre dagene etter skade. På dag syv og 14 har fibroblaster migrert eller spredt seg for å fylle opp det skadede vevsområdet. Ved dag 28 er hjertefibroblastpopulasjonen rundt de skadede områdene i hjertet i sin største tetthet.Halvannen dag etter hjerteinfarktskaden er det få fibroblaster igjen i den skadde venstre ventrikelen. På dag tre ekspanderer imidlertid fibroblaster og er til stede i det meste av venstre ventrikel. I motsetning til iskemisk kirurgi resulterer infusjon av angiotensin to og fenolefrin over flere uker ikke i hjertevevstap og veggfortynning.I stedet justerer fibroblastet langs aksen til det høyre håndhekseksjonsmønsteret sett når du bruker den raffinerte vevsryddingsprotokollen. I tillegg, etter angiotensin to og fenolefrinbehandling, virker fibroblaster små og avrundede i motsetning til spindelformen som observeres i modeller av iskemi reprofusjon og hjerteinfarktskade. Den elektroforetiske ryddingen må utføres nøye, spesielt når du arbeider med hjerter som har gjennomgått skadeprotokoller.Denne protokollen kan brukes til å vurdere hvordan hjertefibroblaster reagerer på skade in vivo. Ulike fluorescerende markører kan også brukes til å forstå hvordan hjertet reagerer på skade på cellenivå.

Research

JoVE Journal

Medicine

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Heterotypic Tredimensjonal<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellering av stromal-Epiteliale interaksjoner Ovarian Cancer initiering og progresjon

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

En Tredimensjonal Tissue Culture modell for å studere Primær Menneskelig Bone Marrow og dets Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Tredimensjonal Co-kultur Modell for Tumor-stromal Interaksjon

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Tredimensjonale (3D) Tumor Spheroid invasjonen analysen

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

Tredimensjonal Alginat-perle Culture of Human hypofyseadenom Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children

Muntlig Biofilm prøvetaking for Microbiome analyse i friske barn

Oral biofilm and its molecular analysis provide a basis for investigating various dental research and clinical questions. Knowledge of biofilm composition ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optisk clearing og Imaging av Immunolabeled nyre tissue

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

On-Site Sampling and Extraction of Brain Tumors for Metabolomics and Lipidomics Analysis

Prøvetaking og ekstraksjon av hjernesvulster for metabolomikk og lipidomikkanalyse

Despite the variety of tools available for cancer diagnosis and classification, methods that enable fast and simple characterization of tumors are still ...

Advanced Cardiac Rhythm Management by Applying Optogenetic Multi-Site Photostimulation in Murine Hearts

Avansert hjerterytmehåndtering ved å bruke optogenetisk multi-site fotostimulering i murine hjerter

Ventricular tachyarrhythmias are a major cause of mortality and morbidity worldwide. Electrical defibrillation using high-energy electric shocks is ...

Three-Dimensional Collagen Matrix Scaffold Implantation as a Liver Regeneration Strategy

Tredimensjonal kollagen matrise stillas implantasjon som en lever regenerering strategi

Liver diseases are the leading cause of death worldwide. Excessive alcohol consumption, a high-fat diet, and hepatitis C virus infection promote fibrosis, ...