Name: refined clarity-based tissue clearing for three-dimensional fibroblast organization in healthy and injured mouse hearts
Uploaded: 2021-05-16T14:00:00
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Os autores gostariam de reconhecer o CCHMC Confocal Imaging Core por sua assistência e orientação no desenvolvimento deste modelo, bem como Matt Batie da Clinical Engineering para o projeto de todas as peças impressas em 3D. Demetria Fischesser foi apoiada por uma bolsa de treinamento dos Institutos Nacionais de Saúde, (NHLBI, T32 HL125204) e Jeffery D. Molkentin foi apoiado pelo Howard Hughes Medical Institute.

Todos os experimentos envolvendo camundongos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Centro Médico Hospitalar Infantil de Cincinnati. A instituição também é certificada pela AAALAC (Associação Americana de Acreditação de Cuidados Com Animais laboratoriais). Os camundongos foram eutanizados por luxação cervical, e os camundongos submetidos a procedimentos cirúrgicos de sobrevivência receberam alívio da dor (veja abaixo). Todos os métodos utilizados para o tratament...

<ol>
	<li>Nagaraju, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblast+phenotype+and+reversibility+of+fibrosis+in+patients+With+end-stage+heart+failure.">Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure.</a> Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).</li><li>Yoon, S., Eom, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+failure+with+preserved+ejection+fraction:+present+status+and+future+directions.">Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions.</a> Experimental and Molecular Medicine. 51 (12), 1-9 (2019).</li><li>Borlaug, B. A., Redfield, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diastolic+and+systolic+heart+failure+are+distinct+phenotypes+within+the+heart+failure+spectrum.">Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum.</a> Circulation. 123, 2006-2014 (2011).</li><li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+cardiac+fibroblast.">Defining the cardiac fibroblast.</a> Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+fibroblast+differentiated+states+underlie+scar+formation+in+the+infarcted+mouse+heart.">Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (5), 2127-2143 (2018).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Sadeghi, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+3D+cardiac+fibrotic+tissue+to+study+fibrotic+remodeling.">Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (11), 1601434 (2017).</li><li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+diverse+cardiac+cell+types+by+reprogramming+fibroblasts+with+cardiac+transcription+factors.">Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors.</a> Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).</li><li>Bruns, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+right+ventricular+fibroblast+secretome+drives+cardiomyocyte+dedifferentiation.">The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation.</a> PLoS One. 14 (8), 0220573 (2019).</li><li>Ski&#246;ldebrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+activation+of+human+cardiac+fibroblasts+leads+to+altered+calcium+signaling,+decreased+connexin+43+expression+and+increased+glutamate+secretion.">Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion.</a> Heliyon. 3 (10), 00406 (2017).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+pegasos+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method.</a> Cell Research. 28, 803-818 (2018).</li><li>Kolesov&#225;, H., &#268;apek, M., Radochov&#225;, B., Jan&#225;&#269;ek, J., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+tissue+clearing+methods+and+3D+imaging+techniques+for+visualization+of+GFP-expressing+mouse+embryos+and+embryonic+hearts.">Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).</li><li>Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+cardiac+injury+response+of+targeted+cell+populations+via+cleared+heart+three-dimensional+imaging.">Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+transparent+intact+cardiac+tissue+with+single-cell+resolution.">Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution.</a> Biomedical Optics Express. 9 (2), 423-436 (2018).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Yokoyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+sympathetic+hyperinnervation+and+denervation+after+myocardial+infarction+by+three-dimensional+assessment+of+the+cardiac+sympathetic+network+in+cleared+transparent+murine+hearts.">Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts.</a> PLoS One. 12 (7), 0182072 (2017).</li><li>Perbellini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-of-Acrylamide+SDS-based+Tissue+Clearing+(FASTClear)+for+three+dimensional+visualization+of+myocardial+tissue.">Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue.</a> Scientific Reports. 7, 5188 (2017).</li><li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling.">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li><li>Nehrhoff, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+in+CUBIC-cleared+mouse+heart+tissue:+going+deeper.">3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper.</a> Biomedical Optics Express. 7 (9), 3716-3720 (2016).</li><li>Yamamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+reporter+mouse+line+for+Cre-+and+FLP-dependent+lineage+analysis.">A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis.</a> Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).</li><li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+substances+to+laboratory+animals:+Routes+of+administration+and+factors+to+consider.">Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).</li><li>Means, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+1-phosphate+S1P2+and+S1P3+receptor-mediated+Akt+activation+protects+against+in+vivo+myocardial+ischemia-reperfusion+injury.">Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 292 (6), 2944-2951 (2007).</li><li>Michael, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+ischemia+and+reperfusion:+A+murine+model.">Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 269 (6), 2147-2154 (1995).</li><li>Ahn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+myocardial+infarcts+of+a+predictable+size+and+location+by+branch+pattern+probability-assisted+coronary+ligation+in+C57BL/6+mice.">Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice.</a> American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).</li><li>Patten, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+remodeling+in+a+mouse+model+of+myocardial+infarction.">Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 274 (5), 1812-1820 (1998).</li><li>Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+echocardiographic+assessment+of+left+ventricular+dimensions+and+function+after+myocardial+infarction+in+mice.">Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice.</a> Cardiovascular Research. 45 (2), 330-338 (2000).</li><li>Vagnozzi, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acute+immune+response+underlies+the+benefit+of+cardiac+stem+cell+therapy.">An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy.</a> Nature. 577, 405-409 (2020).</li><li>Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist+mechanics+of+the+left+ventricle.+Principles+and+application.">Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application.</a> Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 366-376 (2008).</li><li>Arts, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macroscopic+three-dimensional+motion+patterns+of+the+left+ventricle.">Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).</li><li>Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+muscle+actin-positive+cells+in+healing+human+myocardial+scars.">The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars.</a> American Journal of Pathology. 145 (4), 868-875 (1994).</li><li>Hashmi, S., Al-Salam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myocardial+infarction+and+myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+A+comparison.">Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison.</a> International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).</li></ol>

Este artigo apresenta um método refinado de limpeza tecidual que permite a visualização de fibroblastos cardíacos in vivo, tanto na linha de base quanto na lesão seguinte, para caracterizar e entender melhor os fibroblastos no coração do camundongo. Este protocolo aprimorado aborda limitações nos protocolos de limpeza de tecidos existentes que tentaram identificar tipos de células específicas no coração adulto ou neonatal12,13,<sup class="...

Embora os cardiomiócitos compõem a maior fração de volume do coração, os fibroblastos cardíacos são mais abundantes e estão criticamente envolvidos na regulação das características estruturais e reparadoras da linha de base deste órgão. Os fibroblastos cardíacos são altamente móveis, mecanicamente responsivos e fenotipicamente variando dependendo da extensão de sua ativação. Os fibroblastos cardíacos são necessários para manter os níveis normais de matriz extracelular (ECM), e a produção muito pequena ou muito de ECM por essas células pode levar à doença1,2,3. Dada a sua importância na doença, os fibroblastos cardíacos tornaram-se um tema de investigação cada vez mais importante para identificar novas estratégias de tratamento, especialmente na tentativa de limitar a fibrose excessiva4,5,6,7. Após a lesão, os fibroblastos ativam e diferenciam-se em um tipo de célula mais sintética conhecida como myofibroblast, que pode ser proliferativa e segregar eCM abundante, bem como ter atividade contraível que ajuda a remodelar os ventrículos.
Enquanto os fibroblastos cardíacos têm sido amplamente avaliados por suas propriedades nas culturas 2D6,8,9,10, muito menos se entende de suas propriedades e dinâmicas no coração vivo 3D, seja na linha de base ou com estimulação da doença. Aqui, um método refinado foi descrito para limpar o coração do camundongo adulto, mantendo a fluorescência de fibroblastos rotulados com um sistema de repórter genético Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer. Dentro do coração, Tcf21 é um marcador relativamente específico de fibroblastos quiescentes4. Depois que o tamoxifen é dado para ativar a proteína MerCreMer indutível, essencialmente todos os fibroblastos quiescentes expressarão permanentemente proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP) do lócus Rosa26, o que permite seu rastreamento in vivo.
Existem inúmeros protocolos de limpeza tecidual bem estabelecidos, alguns dos quais foram aplicados ao coração11,12,13,14,15,16,17. No entanto, muitos dos reagentes usados em diferentes protocolos de limpeza de tecidos foram encontrados para saciar sinais de fluorescência endógena18. Além disso, o coração adulto é difícil de limpar devido às abundantes proteínas contendo grupo de heme que geram autofluorescência19. Portanto, o objetivo deste protocolo foi preservar a fluorescência do marcador fibroblasto com a inibição simultânea da autofluorescência de heme no coração adulto ferido para visualização 3D ideal in vivo12,13,14,16,17,20.
Estudos anteriores que tentavam examinar o fibroblasto cardíaco in vivo empregavam anticorpos perfumados para rotular essas células, embora tais estudos tenham sido limitados pela penetração de anticorpos e estrutura vascular cardíaca14,16,17,20. Embora Salamon et al. tenham mostrado clareamento tecidual com manutenção de fluorescência neuronal tópica no coração neonatal, e Nehrhoff et al. mostraram manutenção da fluorescência marcando células mielóides, a manutenção da fluorescência endógena por toda a parede ventricular ainda não foi demonstrada, incluindo a visualização de fibroblastos cardíacos adultos na linha de base ou após lesão13,20. Este protocolo de limpeza tecidual refina uma mistura de protocolos anteriores com base no método CLARITY (sistema de solvente rígido híbridoizado por lipídida-lipídida (PEG) e sistema solvente associado ao PEGASOS (sistema solvente associado ao FIL). Este protocolo refinado permitiu um exame mais robusto de fibroblastos cardíacos no coração do camundongo na linha de base e de como eles respondem a diferentes tipos de lesões. O protocolo é simples e reproduzível e ajudará a caracterizar o comportamento dos fibroblastos cardíacos in vivo.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 braided silk</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K871H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-0 prolene</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8730H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiotensin II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9525-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial Tear Ointment</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>048272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D27802-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLUture topical tissue adhesive</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Start Analysis Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-osmotic pumps</td>
			<td>Alzet</td>
			<td>Model 1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements Analysis Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R HD upright microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal autoclaved chow</td>
			<td>Labdiet</td>
			<td>5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, 
			N&#39;-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide</td>
			<td>CosmoBio</td>
			<td>AXS-1002424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine Hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoinitiator</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>VA-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>Jax Stock No:012429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride solution</td>
			<td>Hospira, Inc.</td>
			<td>NDC 0409-4888-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen food</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>TD.130860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol, N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>122262-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoretic clearing chamber</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C30001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoretic clearing solution</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoresis tissue basket</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoresis tissue basket holder</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C12002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

refined clarity-based tissue clearing for three-dimensional fibroblast organization in healthy and injured mouse hearts

A doença cardiovascular é a causa mais prevalente de mortalidade em todo o mundo e é frequentemente marcada pelo aumento da fibrose cardíaca que pode levar ao aumento da rigidez ventricular com função cardíaca alterada. Esse aumento da fibrose ventricular cardíaca deve-se à ativação de fibroblastos residentes, embora a forma como essas células operam dentro do coração tridimensional (3D), na linha de base ou após a ativação, não seja bem compreendida. Para examinar como os fibroblastos contribuem para doenças cardíacas e sua dinâmica no coração 3D, foi desenvolvido um refinado método de limpeza e imagem de tecido baseado em CLARITY que mostra fibroblastos cardíacos fluorescentes rotulados dentro de todo o coração do camundongo. Os fibroblastos residentes em tecidos foram geneticamente rotulados usando ratos repórteres florescentes Rosa26-loxP-eGFP cruzados com o fibroblasto cardíaco expressando linha de knock-in Tcf21-MerCreMer. Esta técnica foi utilizada para observar a dinâmica de localização do fibroblasto em todo o ventrículo esquerdo adulto em camundongos saudáveis e em modelos de camundongos fibrosos de doenças cardíacas. Curiosamente, em um modelo de lesão, foram observados padrões únicos de fibroblastos cardíacos no coração do rato ferido que se seguiu a faixas de fibras embrulhadas na direção contraltil. Nos modelos de lesão isquêmica, ocorreu a morte do fibroblasto, seguida de repopulação da zona de fronteira infarto. Coletivamente, esta técnica de esclarecimento de tecido cardíaco refinado e sistema de imagem digitalizada permite a visualização 3D de fibroblastos cardíacos no coração sem as limitações da falha de penetração de anticorpos ou questões anteriores em torno da fluorescência perdida devido ao processamento tecidual.

Os fibroblastos cardíacos são essenciais para a função de base do coração, bem como para a resposta à lesão cardíaca. Tentativas anteriores de entender o arranjo e a morfologia dessas células foram conduzidas em grande parte em configurações 2D. No entanto, foi publicada uma técnica de limpeza de tecido cardíaco refinado(Figura 2) e 3D, que permite a visualização avançada e mais detalhada de fibroblastos cardíacos. Com esta técnica de imagem, os fibroblastos foram encontra...

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Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

Um método refinado de limpeza tecidual foi desenvolvido e aplicado ao coração do rato adulto. Este método foi projetado para limpar tecido cardíaco denso e autofluorescente, mantendo a fluorescência do fibroblasto rotulada atribuída a uma estratégia de repórter genético.

Clareza refinada baseada em clareza para organização de fibroblasto tridimensional em corações de rato saudáveis e feridos

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

Este novo protocolo de limpeza de tecidos melhora a tecnologia existente para permitir um olhar in vivo mais preciso para tipos de células específicas no coração e seu comportamento em condições de lesão. Este protocolo é rápido e bastante simples. Permite a manutenção da fluorescência marca com interferência mínima da fluorescência automática do tecido de fundo sem exigir coloração celular ou tecido.Comece usando uma gaze de 70% de etanol para limpar a superfície ventral do mouse experimental. Use uma tesoura cirúrgica para fazer uma incisão transversal de três centímetros, aproximadamente três metros abaixo do processo xifoide e deglove o rato do abdômen para o processo xifoide para separar a pele do tecido da parede abdominal subjacente. Faça uma incisão transversal de dois centímetros no tecido subcutâneo da parede abdominal, três centímetros abaixo do processo xifoide e faça um corte vertical dessa incisão até a linha média através da caixa torácica.Fixe a caixa torácica de volta para expor o coração. E use uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha calibre 27 para injetar PBS frio na veia cava superior e aorta. Quando todo o sangue tiver sido lavado do coração, entregue 10 mililitros de 4% de PFA frio na veia cava superior e aorta para iniciar o processo de fixação.Quando todo o fixador tiver piscado, extirpar o coração e usar um bisturi de lâmina reta para separar o atria, o ventrículo direito e o septo e o ventrículo esquerdo. Coloque o coração em um tubo cônico de 15 mililitros de 4%PFA frio para uma incubação durante a noite a quatro graus celsius em um nutador. Na manhã seguinte, adicione uma solução de iniciador fotográfico de 0,25% a uma solução de hidrogéis recém-preparada e transfira o coração para o gel hidráulico.Enrole o tubo cônico em papel alumínio para uma incubação durante a noite a quatro graus celsius sem perturbação física. Na manhã seguinte, aqueça o tubo em um banho de contas de 37 graus celsius por 2,5 horas antes de usar fórceps para transferir cuidadosamente o coração para um tubo de 15 mililitros de PBS. Lave o coração três vezes em PBS por uma hora por lavagem a 37 graus celsius em um nutador e transfira o coração para a cesta de uma máquina ativa de eletroforese.Fixe a tampa no lugar e encha o reservatório ativo da câmara de eletroforese com solução de limpeza de eletroforese. Uma vez que a câmara esteja cheia, submergir a cesta na solução e apertar a tampa da máquina de eletroforese no lugar. Em seguida, execute a máquina de eletroforese a 1,5 amperes e 37 graus celsius por 1,5 horas.Após a eletroforese, verifique o visual do coração para garantir que nenhum tecido opaco permaneça. Lave o coração limpo três vezes em um 15-mililitro dois por uma hora em PBS fresco a 37 graus celsius por lavagem em um nutador. Antes de submergir o coração em agente descolorante para reduzir a fluorescência automática de heme.Após 48 horas, lave o coração três vezes em PBS como demonstrado e equilibre o coração em RIMS recém-preparados por 48 horas antes da imagem. Para imagens 3D do coração limpo, primeiro, coloque uma fina camada de graxa de vácuo na parte inferior de um reservatório de fundo impresso em 3D, a mesma altura da amostra que está sendo imageada. Encha o reservatório com RIMS e use uma ponta de pipeta para remover quaisquer bolhas.Coloque cuidadosamente o coração nas RIMS com a parede ventricular esquerda voltada para cima, cuidando para que nenhuma bolha seja introduzida na solução. Use graxa de vácuo para anexar um deslizamento de tampa de vidro à superfície inferior de uma peça de reservatório impressa em 3D e coloque as tampas do reservatório superior para baixo nos reservatórios inferiores, tomando cuidado para evitar bolhas. Em seguida, encha os reservatórios superiores com glicerol.Use um microscópio confocal para imaginar os corações limpos. A combinação de limpeza de tecido cardíaco refinado com imagem 3D permite uma visualização detalhada avançada de fibroblastos cardíacos. Usando esta técnica de imagem, os fibroblastos são observados como densamente embalados e com uma morfologia espinhosa em corações ilesos.Após lesão de reperfusão de isquemia, a perda de fibroblastos cardíacos é vista na região isquêmica nos primeiros três dias após a lesão. Nos dias 7 e 14, os fibroblastos migraram ou proliferaram para repovoar a área do tecido ferido. Até o dia 28, a população de fibroblasto cardíaco em torno das áreas feridas do coração está em sua maior densidade.Um dia e meio após a lesão no infarto do miocárdio, poucos fibroblastos permanecem dentro do ventrículo esquerdo ferido. No terceiro dia, porém, os fibroblastos se expandem e estão presentes na maior parte do ventrículo esquerdo. Em contraste com a cirurgia isquêmica, a infusão de angiotensina dois e fenolefrin ao longo de várias semanas não resulta em perda de tecido cardíaco e afinamento da parede.Em vez disso, o fibroblasto se alinha ao longo do eixo do padrão de contração da hélice destro, como visto ao usar o refinado para o protocolo de limpeza tecidual. Além disso, após o tratamento de angiotensina dois e fenozolfrino, os fibroblastos parecem pequenos e arredondados em oposição à forma de fuso observada em modelos de reprofusão isquemia e lesão por infarto do miocárdio. A clareira eletroforética precisa ser realizada cuidadosamente especialmente quando se trabalha com corações que passaram por protocolos de lesão.Este protocolo pode ser usado para avaliar como os fibroblastos cardíacos reagem à lesão in vivo. Diferentes marcadores fluorescentes também podem ser usados para entender como o coração responde à lesão no nível celular.

Research

JoVE Journal

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