Name: refined clarity-based tissue clearing for three-dimensional fibroblast organization in healthy and injured mouse hearts
Uploaded: 2021-05-16T14:00:00
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A los autores les gustaría reconocer al CCHMC Confocal Imaging Core por su asistencia y orientación en el desarrollo de este modelo, así como a Matt Batie de Clinical Engineering por el diseño de todas las piezas impresas en 3D. Demetria Fischesser fue apoyada por una beca de capacitación de los Institutos Nacionales de Salud , (NHLBI, T32 HL125204) y Jeffery D. Molkentin fue apoyado por el Instituto Médico Howard Hughes.

Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Cincinnati Children's Hospital Medical Center. La institución también cuenta con la certificación AAALAC (American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care). Los ratones fueron eutanasiados a través de la dislocación cervical, y los ratones sometidos a procedimientos quirúrgicos de supervivencia recibieron alivio del dolor (ver más abajo). Todos los métodos utilizados para el ...

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	<li>Nagaraju, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblast+phenotype+and+reversibility+of+fibrosis+in+patients+With+end-stage+heart+failure.">Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure.</a> Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).</li><li>Yoon, S., Eom, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+failure+with+preserved+ejection+fraction:+present+status+and+future+directions.">Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions.</a> Experimental and Molecular Medicine. 51 (12), 1-9 (2019).</li><li>Borlaug, B. A., Redfield, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diastolic+and+systolic+heart+failure+are+distinct+phenotypes+within+the+heart+failure+spectrum.">Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum.</a> Circulation. 123, 2006-2014 (2011).</li><li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+cardiac+fibroblast.">Defining the cardiac fibroblast.</a> Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+fibroblast+differentiated+states+underlie+scar+formation+in+the+infarcted+mouse+heart.">Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (5), 2127-2143 (2018).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Sadeghi, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+3D+cardiac+fibrotic+tissue+to+study+fibrotic+remodeling.">Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (11), 1601434 (2017).</li><li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+diverse+cardiac+cell+types+by+reprogramming+fibroblasts+with+cardiac+transcription+factors.">Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors.</a> Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).</li><li>Bruns, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+right+ventricular+fibroblast+secretome+drives+cardiomyocyte+dedifferentiation.">The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation.</a> PLoS One. 14 (8), 0220573 (2019).</li><li>Ski&#246;ldebrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+activation+of+human+cardiac+fibroblasts+leads+to+altered+calcium+signaling,+decreased+connexin+43+expression+and+increased+glutamate+secretion.">Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion.</a> Heliyon. 3 (10), 00406 (2017).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+pegasos+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method.</a> Cell Research. 28, 803-818 (2018).</li><li>Kolesov&#225;, H., &#268;apek, M., Radochov&#225;, B., Jan&#225;&#269;ek, J., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+tissue+clearing+methods+and+3D+imaging+techniques+for+visualization+of+GFP-expressing+mouse+embryos+and+embryonic+hearts.">Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).</li><li>Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+cardiac+injury+response+of+targeted+cell+populations+via+cleared+heart+three-dimensional+imaging.">Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+transparent+intact+cardiac+tissue+with+single-cell+resolution.">Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution.</a> Biomedical Optics Express. 9 (2), 423-436 (2018).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Yokoyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+sympathetic+hyperinnervation+and+denervation+after+myocardial+infarction+by+three-dimensional+assessment+of+the+cardiac+sympathetic+network+in+cleared+transparent+murine+hearts.">Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts.</a> PLoS One. 12 (7), 0182072 (2017).</li><li>Perbellini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-of-Acrylamide+SDS-based+Tissue+Clearing+(FASTClear)+for+three+dimensional+visualization+of+myocardial+tissue.">Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue.</a> Scientific Reports. 7, 5188 (2017).</li><li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling.">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li><li>Nehrhoff, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+in+CUBIC-cleared+mouse+heart+tissue:+going+deeper.">3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper.</a> Biomedical Optics Express. 7 (9), 3716-3720 (2016).</li><li>Yamamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+reporter+mouse+line+for+Cre-+and+FLP-dependent+lineage+analysis.">A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis.</a> Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).</li><li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+substances+to+laboratory+animals:+Routes+of+administration+and+factors+to+consider.">Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).</li><li>Means, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+1-phosphate+S1P2+and+S1P3+receptor-mediated+Akt+activation+protects+against+in+vivo+myocardial+ischemia-reperfusion+injury.">Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 292 (6), 2944-2951 (2007).</li><li>Michael, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+ischemia+and+reperfusion:+A+murine+model.">Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 269 (6), 2147-2154 (1995).</li><li>Ahn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+myocardial+infarcts+of+a+predictable+size+and+location+by+branch+pattern+probability-assisted+coronary+ligation+in+C57BL/6+mice.">Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice.</a> American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).</li><li>Patten, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+remodeling+in+a+mouse+model+of+myocardial+infarction.">Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 274 (5), 1812-1820 (1998).</li><li>Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+echocardiographic+assessment+of+left+ventricular+dimensions+and+function+after+myocardial+infarction+in+mice.">Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice.</a> Cardiovascular Research. 45 (2), 330-338 (2000).</li><li>Vagnozzi, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acute+immune+response+underlies+the+benefit+of+cardiac+stem+cell+therapy.">An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy.</a> Nature. 577, 405-409 (2020).</li><li>Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist+mechanics+of+the+left+ventricle.+Principles+and+application.">Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application.</a> Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 366-376 (2008).</li><li>Arts, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macroscopic+three-dimensional+motion+patterns+of+the+left+ventricle.">Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).</li><li>Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+muscle+actin-positive+cells+in+healing+human+myocardial+scars.">The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars.</a> American Journal of Pathology. 145 (4), 868-875 (1994).</li><li>Hashmi, S., Al-Salam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myocardial+infarction+and+myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+A+comparison.">Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison.</a> International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).</li></ol>

Este artículo presenta un método refinado para el claro del tejido que permita la visualización de fibroblastos cardiacos in vivo, en la línea de fondo y lesión siguiente, para caracterizar y para entender mejor los fibroblastos en el corazón del ratón. Este protocolo mejorado aborda las limitaciones en los protocolos de limpieza de tejidos existentes que han intentado identificar tipos específicos de células en el corazón adulto o neonatal12,13,</...

Aunque los cardiomyocytes comprendan la fracción de volumen más grande del corazón, los fibroblastos cardiacos son más abundantes y están implicados críticamente en la regulación de las características estructurales y reparadoras de la línea de fondo de este órgano. Los fibroblastos cardiacos son altamente móviles, mecánicamente responsivos, y fenotípicamente que se extienden dependiendo del grado de su activación. Los fibroblastos cardíacos son necesarios para mantener los niveles normales de matriz extracelular (MEC), y muy poca o demasiada producción de MEC por estas células puede conducir a la enfermedad1,2,3. Dada su importancia en la enfermedad, los fibroblastos cardíacos se han convertido en un tema de investigación cada vez más importante hacia la identificación de nuevas estrategias de tratamiento, especialmente en el intento de limitar la fibrosis excesiva4,5,6,7. Tras la lesión, los fibroblastos se activan y se diferencian en un tipo de célula más sintética conocida como miofibroblasto, que puede ser proliferativa y secretar abundante ECM, así como tener actividad contráctil que ayuda a remodelar los ventrículos.
Mientras que los fibroblastos cardiacos se han evaluado extensivamente para sus propiedades en las culturas 2-D6,8,9,10,mucho menos se entiende de sus propiedades y dinámica en el corazón vivo 3-D, en la línea de fondo o con el estímulo de la enfermedad. Aquí, un método refinado se ha descrito para despejar el tejido del corazón adulto del ratón mientras que mantiene la fluorescencia de fibroblastos etiquetados con un sistema genético del reportero de Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer. Dentro del corazón, Tcf21 es un marcador relativamente específico de fibroblastos quietos4. Después de que el tamoxifeno se administra para activar la proteína MerCreMer inducible, esencialmente todos los fibroblastos quietos expresarán permanentemente la proteína fluorescente verde mejorada (eGFP) del locus Rosa26, lo que permite su seguimiento in vivo.
Existen numerosos protocolos de limpieza de tejidos bien establecidos, algunos de los cuales se han aplicado alcorazón 11,12,13,14,15,16,17. Sin embargo, se ha encontrado que muchos de los reactivos utilizados en diferentes protocolos de limpieza de tejidos apagan las señales endógenas de fluorescencia18. Además, el corazón adulto es difícil de despejar debido a las abundantes proteínas que contienen el grupo heme que generan autofluorescencia19. Por lo tanto, la meta de este protocolo era preservar fluorescencia del marcador del fibroblasto con la inhibición simultánea del autofluorescence del heme en el corazón adulto dañado para la visualización óptima 3-D in vivo12,13,14,16,17,20.
Estudios previos que intentaban examinar el fibroblasto cardíaco in vivo emplearon anticuerpos perfundidos para etiquetar estas células, aunque tales estudios estuvieron limitados por la penetración de anticuerpos y la estructura vascular cardíaca14,16,17,20. Aunque Salamon et al. han demostrado un claro tisular con mantenimiento de la fluorescencia neuronal tópica en el corazón neonatal, y Nehrhoff et al. han demostrado mantenimiento de las células mieloides que marcan la fluorescencia, aún no se ha demostrado el mantenimiento de la fluorescencia endógena a través de toda la pared ventricular, incluida la visualización de fibroblastos cardíacos adultos al inicio o después de una lesión13,20. Este protocolo de limpieza de tejidos refina una mezcla de protocolos anteriores basados en el método CLARITY (hidrgel tisular rígido de acrilamida hibridada por lípidos claros) y PEGASOS (polietilenglicol (PEG)-sistema de disolvente asociado). Este protocolo refinado permitió una examinación más robusta de fibroblastos cardiacos en el corazón del ratón en la línea de fondo y de cómo responden a diversos tipos de lesión. El protocolo es sencillo y reproducible y ayudará a caracterizar el comportamiento de los fibroblastos cardíacos in vivo.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 braided silk</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K871H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-0 prolene</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8730H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiotensin II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9525-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial Tear Ointment</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>048272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D27802-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLUture topical tissue adhesive</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Start Analysis Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-osmotic pumps</td>
			<td>Alzet</td>
			<td>Model 1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements Analysis Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R HD upright microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal autoclaved chow</td>
			<td>Labdiet</td>
			<td>5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, 
			N&#39;-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide</td>
			<td>CosmoBio</td>
			<td>AXS-1002424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine Hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoinitiator</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>VA-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>Jax Stock No:012429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride solution</td>
			<td>Hospira, Inc.</td>
			<td>NDC 0409-4888-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen food</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>TD.130860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol, N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>122262-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoretic clearing chamber</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C30001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoretic clearing solution</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoresis tissue basket</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoresis tissue basket holder</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C12002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

refined clarity-based tissue clearing for three-dimensional fibroblast organization in healthy and injured mouse hearts

La enfermedad cardiovascular es la causa más frecuente de mortalidad en todo el mundo y a menudo se caracteriza por una fibrosis cardíaca aumentada que puede conducir a un aumento de la rigidez ventricular con una función cardíaca alterada. Este aumento en fibrosis ventricular cardiaca es debido a la activación de fibroblastos residentes, aunque cómo estas células funcionan dentro del corazón de 3 dimensiones (3-D), en la línea de fondo o después de la activación, no se entienda bien. Para examinar cómo los fibroblastos contribuyen a la enfermedad cardíaca y su dinámica en el corazón 3-D, un método refinado del claro y de la proyección de imagen CLARIDAD-basado del tejido fue desarrollado que muestra los fibroblastos cardiacos fluorescente etiquetados dentro del corazón entero del ratón. Los fibroblastos residentes del tejido fueron etiquetados genético usando los ratones florescentes del reportero de Rosa26-loxP-eGFP cruzados con el fibroblasto cardiaco que expresaba la línea knock-in de Tcf21-MerCreMer. Esta técnica fue utilizada para observar dinámica de la localización del fibroblasto a través del ventrículo izquierdo adulto entero en ratones sanos y en modelos fibróticos del ratón de la enfermedad cardíaca. Interesante, en un modelo de lesión, los patrones únicos de fibroblastos cardiacos fueron observados en el corazón dañado del ratón que siguió las vendas de fibras envueltas en la dirección contráctil. En modelos isquémicos de lesión, ocurrió la muerte del fibroblasto, seguida por la repoblación de la zona fronteriza del infarto. Colectivamente, esta técnica de clarificación de tejido cardíaco refinado y sistema de imágenes digitalizado permite la visualización en 3-D de fibroblastos cardíacos en el corazón sin las limitaciones de la falla de penetración de anticuerpos o problemas anteriores que rodean la fluorescencia perdida debido al procesamiento de tejidos.

Los fibroblastos cardiacos son esenciales para la función de la línea de fondo del corazón así como para la respuesta a lesión cardiaca. Las tentativas anteriores de entender el arreglo y la morfología de estas células se han conducido en gran parte en ajustes 2-D. Sin embargo, se ha publicado una técnica de limpieza de tejido cardíaco refinada(Figura 2)y de imagen 3-D, que permite la visualización avanzada y más detallada de los fibroblastos cardíacos. Con esta técnica de image...

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Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

Un método refinado de claro del tejido fue desarrollado y aplicado al corazón adulto del ratón. Este método fue diseñado para despejar el tejido cardiaco denso, autofluorescente, mientras que mantiene la fluorescencia etiquetada del fibroblasto atribuida a una estrategia genética del reportero.

Refinado CLARIDAD Basada En La Limpieza De Tejidos Para La Organización De Fibroblastos TridimensionalEs En Corazones De Ratón Sanos Y Lesionados

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

Este nuevo protocolo de limpieza de tejidos mejora la tecnología existente para permitir una mirada in vivo más precisa a tipos específicos de células en el corazón y su comportamiento en condiciones de lesión. Este protocolo es rápido y bastante simple. Permite el mantenimiento de la fluorescencia de la marca con interferencia mínima de la fluorescencia automática del tejido del fondo sin requerir la coloración de la célula o del tejido.Comience usando una gasa empapada de etanol al 70% para limpiar la superficie ventral del ratón experimental. Use tijeras quirúrgicas para hacer una incisión transversal de tres centímetros, aproximadamente tres metros por debajo del proceso xifoides y desglove el ratón desde el abdomen hasta el proceso xifoides para separar la piel del tejido subyacente de la pared abdominal. Haga una incisión transversal de dos centímetros en el tejido subcutáneo de la pared abdominal, tres centímetros por debajo del proceso xifoideo y haga un corte vertical de esta incisión hasta la línea media a través de la caja torácica.Fije la caja torácica de nuevo para exponer el corazón. Y use una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja calibre 27 para inyectar PBS frío en la vena cava superior y la aorta. Cuando toda la sangre se haya enjuagado del corazón, entregue 10 mililitros de frío al 4% de PFA en la vena cava superior y la aorta para comenzar el proceso de fijación.Cuando todo el fijador ha sido destellado, extirpar el corazón y utilizar un bisturí de hoja recta para separar las aurículas, ventrículo derecho y tabique y ventrículo izquierdo. Coloque el corazón en un tubo cónico de 15 mililitros de frío 4% PFA para una incubación nocturna a cuatro grados centígrados en un nutator. A la mañana siguiente, agregue una solución de iniciador fotográfico al 0.25% a una solución de hidrogeles recién preparada y transfiera el corazón al gel hidro.Envuelva el tubo cónico en papel de aluminio para una incubación nocturna a cuatro grados centígrados sin molestias físicas. A la mañana siguiente, caliente el tubo en un baño de cuentas de 37 grados celsius durante 2,5 horas antes de usar las fuerzas para transferir cuidadosamente el corazón a un tubo de PBS de 15 mililitros. Lave el corazón tres veces en PBS durante una hora por lavado a 37 grados centígrados en un nutator y transfiera el corazón a la cesta de una máquina de electroforesis activa.Asegure la tapa en su lugar y llene el depósito de la cámara de electroforesis activa con una solución de limpieza de electroforesis. Una vez que la cámara esté llena, sumerja la cesta en la solución y apriete la tapa de la máquina de electroforesis en su lugar. Luego ejecute la máquina de electroforesis a 1.5 amperios y 37 grados celsius durante 1.5 horas.Después de la electroforesis, revise visualmente el corazón para asegurarse de que no quede tejido opaco. Lave el corazón despejado tres veces en un dos de 15 mililitros durante una hora en PBS fresco a 37 grados centígrados por lavado en un nutator. Antes de sumergir el corazón en agente decolorante para reducir la fluorescencia automática del heme.Después de 48 horas, lave el corazón tres veces en PBS como se ha demostrado y equilibre el corazón en RIMS recién preparado durante 48 horas antes de la toma de imágenes. Para obtener imágenes en 3D del corazón despejado, primero, coloque una capa delgada de grasa de vacío en la parte inferior de un depósito inferior impreso en 3D, la misma altura que la muestra que se está fotografiando. Llene el depósito con RIMS y use una punta de pipeta para eliminar cualquier burbuja.Coloque cuidadosamente el corazón en las LLANTAS con la pared ventricular izquierda hacia arriba, cuidando de que no se introduzcan burbujas en la solución. Use grasa de vacío para unir un resbalón de cubierta de vidrio a la superficie inferior de una pieza de depósito superior impresa en 3D y coloque las cubiertas del depósito superior en los depósitos inferiores, teniendo cuidado de evitar burbujas. Luego llene los depósitos superiores con glicerol.Use un microscopio confocal para tomar imágenes de los corazones despejados. La combinación de la limpieza refinada del tejido cardiaco con proyección de imagen 3D permite una visualización detallada avanzada de fibroblastos cardiacos. Usando esta técnica de proyección de imagen, los fibroblastos se observan para ser embalados denso y para tener una morfología spindled en corazones ilesos.Después de lesión de la reperfusión de la isquemia, una pérdida de fibroblastos cardiacos se considera en la región isquémica por los primeros tres días después de lesión. Para los días siete y 14, los fibroblastos han migrado o proliferado para repoblar el área de tejido lesionado. Para el día 28, la población de fibroblastos cardíacos que rodea las áreas lesionadas del corazón está en su mayor densidad.Un día y medio después de lesión del infarto del miocardio, pocos fibroblastos permanecen dentro del ventrículo izquierdo dañado. Sin embargo, para el tercer día, los fibroblastos se expanden y están presentes en la mayor parte del ventrículo izquierdo. En contraste con la cirugía isquémica, la infusión de la angiotensina dos y del phenolefrin durante varias semanas no da lugar a pérdida cardiaca del tejido y a la reducción de la pared.En lugar, el fibroblasto alinea a lo largo del eje del patrón derecho de la contracción de la hélice según lo visto al usar refinado al protocolo del claro del tejido. Además, después de la angiotensina dos y el tratamiento con fenolefrina, los fibroblastos aparecen pequeños y redondeados en comparación con la forma del huso observada en los modelos de reprofusión de isquemia y lesión por infarto de miocardio. El claro electroforético debe realizarse con cuidado, especialmente cuando se trabaja con corazones que se han sometido a protocolos de lesiones.Este protocolo se puede utilizar para evaluar cómo reaccionan los fibroblastos cardiacos a lesión in vivo. También se pueden utilizar diferentes marcadores fluorescentes para entender cómo responde el corazón a las lesiones a nivel celular.

Research

JoVE Journal

Medicine

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

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Investigación

Medicina

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