Name: refined clarity-based tissue clearing for three-dimensional fibroblast organization in healthy and injured mouse hearts
Uploaded: 2021-05-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts at JoVE.com

Författarna vill uppmärksamma CCHMC Confocal Imaging Core för deras hjälp och vägledning i utvecklingen av denna modell, liksom Matt Batie från Clinical Engineering för design av alla 3D-tryckta delar. Demetria Fischesser stöddes av ett utbildningsbidrag från National Institutes of Health, (NHLBI, T32 HL125204) och Jeffery D. Molkentin stöddes av Howard Hughes Medical Institute.

Alla experiment med möss godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Cincinnati Children's Hospital Medical Center. Institutionen är också AAALAC (American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care) certifierad. Möss avlivades via livmoderhalscancer förskjutning, och möss som genomgår överlevnad kirurgiska ingrepp fick smärtlindring (se nedan). Alla metoder som används för smärtlindring och dödshjälp bygger på rekommendationer från panelen för dödshjälp av Americ...

<ol>
	<li>Nagaraju, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblast+phenotype+and+reversibility+of+fibrosis+in+patients+With+end-stage+heart+failure.">Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure.</a> Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).</li><li>Yoon, S., Eom, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+failure+with+preserved+ejection+fraction:+present+status+and+future+directions.">Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions.</a> Experimental and Molecular Medicine. 51 (12), 1-9 (2019).</li><li>Borlaug, B. A., Redfield, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diastolic+and+systolic+heart+failure+are+distinct+phenotypes+within+the+heart+failure+spectrum.">Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum.</a> Circulation. 123, 2006-2014 (2011).</li><li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+cardiac+fibroblast.">Defining the cardiac fibroblast.</a> Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+fibroblast+differentiated+states+underlie+scar+formation+in+the+infarcted+mouse+heart.">Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (5), 2127-2143 (2018).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Sadeghi, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+3D+cardiac+fibrotic+tissue+to+study+fibrotic+remodeling.">Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (11), 1601434 (2017).</li><li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+diverse+cardiac+cell+types+by+reprogramming+fibroblasts+with+cardiac+transcription+factors.">Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors.</a> Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).</li><li>Bruns, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+right+ventricular+fibroblast+secretome+drives+cardiomyocyte+dedifferentiation.">The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation.</a> PLoS One. 14 (8), 0220573 (2019).</li><li>Ski&#246;ldebrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+activation+of+human+cardiac+fibroblasts+leads+to+altered+calcium+signaling,+decreased+connexin+43+expression+and+increased+glutamate+secretion.">Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion.</a> Heliyon. 3 (10), 00406 (2017).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+pegasos+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method.</a> Cell Research. 28, 803-818 (2018).</li><li>Kolesov&#225;, H., &#268;apek, M., Radochov&#225;, B., Jan&#225;&#269;ek, J., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+tissue+clearing+methods+and+3D+imaging+techniques+for+visualization+of+GFP-expressing+mouse+embryos+and+embryonic+hearts.">Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).</li><li>Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+cardiac+injury+response+of+targeted+cell+populations+via+cleared+heart+three-dimensional+imaging.">Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+transparent+intact+cardiac+tissue+with+single-cell+resolution.">Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution.</a> Biomedical Optics Express. 9 (2), 423-436 (2018).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Yokoyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+sympathetic+hyperinnervation+and+denervation+after+myocardial+infarction+by+three-dimensional+assessment+of+the+cardiac+sympathetic+network+in+cleared+transparent+murine+hearts.">Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts.</a> PLoS One. 12 (7), 0182072 (2017).</li><li>Perbellini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-of-Acrylamide+SDS-based+Tissue+Clearing+(FASTClear)+for+three+dimensional+visualization+of+myocardial+tissue.">Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue.</a> Scientific Reports. 7, 5188 (2017).</li><li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling.">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li><li>Nehrhoff, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+in+CUBIC-cleared+mouse+heart+tissue:+going+deeper.">3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper.</a> Biomedical Optics Express. 7 (9), 3716-3720 (2016).</li><li>Yamamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+reporter+mouse+line+for+Cre-+and+FLP-dependent+lineage+analysis.">A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis.</a> Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).</li><li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+substances+to+laboratory+animals:+Routes+of+administration+and+factors+to+consider.">Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).</li><li>Means, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+1-phosphate+S1P2+and+S1P3+receptor-mediated+Akt+activation+protects+against+in+vivo+myocardial+ischemia-reperfusion+injury.">Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 292 (6), 2944-2951 (2007).</li><li>Michael, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+ischemia+and+reperfusion:+A+murine+model.">Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 269 (6), 2147-2154 (1995).</li><li>Ahn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+myocardial+infarcts+of+a+predictable+size+and+location+by+branch+pattern+probability-assisted+coronary+ligation+in+C57BL/6+mice.">Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice.</a> American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).</li><li>Patten, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+remodeling+in+a+mouse+model+of+myocardial+infarction.">Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 274 (5), 1812-1820 (1998).</li><li>Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+echocardiographic+assessment+of+left+ventricular+dimensions+and+function+after+myocardial+infarction+in+mice.">Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice.</a> Cardiovascular Research. 45 (2), 330-338 (2000).</li><li>Vagnozzi, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acute+immune+response+underlies+the+benefit+of+cardiac+stem+cell+therapy.">An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy.</a> Nature. 577, 405-409 (2020).</li><li>Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist+mechanics+of+the+left+ventricle.+Principles+and+application.">Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application.</a> Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 366-376 (2008).</li><li>Arts, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macroscopic+three-dimensional+motion+patterns+of+the+left+ventricle.">Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).</li><li>Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+muscle+actin-positive+cells+in+healing+human+myocardial+scars.">The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars.</a> American Journal of Pathology. 145 (4), 868-875 (1994).</li><li>Hashmi, S., Al-Salam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myocardial+infarction+and+myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+A+comparison.">Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison.</a> International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).</li></ol>

Denna artikel presenterar en raffinerad metod för vävnad clearing som möjliggör visualisering av hjärt fibroblaster in vivo, både vid baslinjen och efter skada, att karakterisera och bättre förstå fibroblaster i mus hjärtat. Detta förbättrade protokoll behandlar begränsningar i befintliga vävnadsrensningsprotokoll som har försökt identifiera specifika celltyper i vuxen- eller neonatalhjärtat12,13,14,<...

Även om kardiomyocyter utgör den största volymfraktionen i hjärtat, är hjärtfibroblaster mer rikliga och är kritiskt involverade i regleringen av utgångsvärdet strukturella och reparativa funktioner i detta organ. Hjärtfibroblaster är mycket mobila, mekaniskt lyhörda och fenotypiskt olika beroende på omfattningen av deras aktivering. Hjärtfibroblaster är nödvändiga för att upprätthålla normala nivåer av extracellulär matris (ECM), och för lite eller för mycket ECM-produktion av dessa celler kan leda till sjukdom1,2,3. Med tanke på deras betydelse vid sjukdom har hjärtfibroblaster blivit ett allt viktigare ämne för undersökning för att identifiera nya behandlingsstrategier, särskilt för att försöka begränsa överdriven fibros4,5,6,7. Vid skada aktiverar och skiljer fibroblaster till en mer syntetisk celltyp som kallas myofibroblast, som kan vara proliferativ och utsöndra riklig ECM, samt ha kontraktil aktivitet som hjälper till att bygga om ventriklarna.
Medan hjärtfibroblaster har utvärderats utförligt för sina egenskaper i 2D-kulturer6,8,9,10, är mycket mindre förstås av deras egenskaper och dynamik i 3D-levande hjärtat, antingen vid baslinjen eller med sjukdomsstimulering. Här har en förfinad metod beskrivits för att rensa det vuxna mushjärtat samtidigt som fluorescensen av fibroblaster märkt med ett Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer genetisk reportersystem. Inom hjärtat är Tcf21 en relativt specifik markör för quiescent fibroblaster4. Efter tamoxifen ges för att aktivera det inducerbara MerCreMer proteinet, i huvudsak alla quiescent fibroblaster kommer permanent att uttrycka förbättrad grön fluorescerande protein (eGFP) från Rosa26 locus, vilket möjliggör deras spårning in vivo.
Många väletablerade vävnadsrensningsprotokoll finns, av vilka några har tillämpats på hjärtat11,12,13,14,15,16,17. Många av de reagenser som används i olika vävnadsrensningsprotokoll har dock visat sig släcka endogena fluorescenssignaler18. Dessutom är det vuxna hjärtat svårt att rensa på grund av rikliga heme gruppinnehållande proteiner som genererar autofluorescens19. Därför var målet med detta protokoll att bevara fibroblast markör fluorescens med samtidig hämning av heme autofluorescens i det skadade vuxna hjärtat för optimal 3D-visualisering in vivo12,13,14,16,17,20.
Tidigare studier som försökte undersöka hjärtfibroblast in vivo använde perfused antikroppar för att märka dessa celler, även om sådana studier begränsades av antikroppar penetration och hjärt vaskulär struktur14,16,17,20. Även om Salamon et al. har visat vävnad clearing med underhåll av aktuella neuronal fluorescens i neonatal hjärtat, och Nehrhoff et al. har visat underhåll av fluorescens märkning myeloiska celler, underhåll av endogena fluorescens genom hela Ventrikulärt väggen har ännu inte visats, inklusive visualisering av vuxna hjärt fibroblaster vid baslinjen eller efter skada13,20. Detta protokoll för vävnadsrensning förfinar en blandning av tidigare protokoll baserade på CLARITY-metoden (klar lipidväxlade akrylamidhybridiserade styva Imaging/immunostaining/in situ-hybridisering-kompatibla vävnad hydrogel) och PEGASOS (polyetylenglykol (PEG)-associerade lösningsmedel system). Detta förfinade protokoll tillät en mer robust undersökning av hjärtfibroblaster i mushjärtat vid baslinjen och hur de svarar på olika typer av skador. Protokollet är enkelt och reproducerbart och kommer att bidra till att karakterisera beteendet hos hjärtfibroblaster in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 braided silk</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K871H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-0 prolene</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8730H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiotensin II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9525-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial Tear Ointment</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>048272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D27802-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLUture topical tissue adhesive</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Start Analysis Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-osmotic pumps</td>
			<td>Alzet</td>
			<td>Model 1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements Analysis Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R HD upright microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal autoclaved chow</td>
			<td>Labdiet</td>
			<td>5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, 
			N&#39;-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide</td>
			<td>CosmoBio</td>
			<td>AXS-1002424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine Hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoinitiator</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>VA-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>Jax Stock No:012429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride solution</td>
			<td>Hospira, Inc.</td>
			<td>NDC 0409-4888-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen food</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>TD.130860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol, N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>122262-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoretic clearing chamber</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C30001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoretic clearing solution</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoresis tissue basket</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Clarity electrophoresis tissue basket holder</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>C12002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

refined clarity-based tissue clearing for three-dimensional fibroblast organization in healthy and injured mouse hearts

Hjärt-kärlsjukdom är den vanligaste dödsorsaken i världen och kännetecknas ofta av förhöjd hjärtfibros som kan leda till ökad ventrikulär styvhet med förändrad hjärtfunktion. Denna ökning av hjärt ventrikulär fibros beror på aktivering av bosatta fibroblaster, även om hur dessa celler fungerar inom det 3-dimensionella (3D) hjärtat, vid baslinjen eller efter aktivering, är inte väl förstådd. För att undersöka hur fibroblaster bidrar till hjärtsjukdomar och deras dynamik i 3D-hjärtat utvecklades en förfinad CLARITY-baserad vävnadsrensnings- och bildbehandlingsmetod som visar fluorescerande märkta hjärtfibroblaster i hela mushjärtat. Vävnad bosatta fibroblaster var genetiskt märkta med Rosa26-loxP-eGFP florescent reporter möss korsade med hjärt fibroblast uttrycker Tcf21-MerCreMer knock-in linje. Denna teknik användes för att observera fibroblast lokalisering dynamik i hela vuxna vänstra ventrikel i friska möss och i fibrotic mus modeller av hjärtsjukdomar. Intressant nog, i en skademodell, observerades unika mönster av hjärt fibroblaster i det skadade mushjärtat som följde band av inslagna fibrer i kontraktil riktning. I ischemiska skademodeller inträffade fibroblast död, följt av återpopulation från den infarkt gränszonen. Sammantaget möjliggör denna raffinerade hjärtvävnad klargörande teknik och digitaliserade bildframställning system 3D visualisering av hjärt fibroblaster i hjärtat utan begränsningar av antikroppar penetration misslyckande eller tidigare problem kring förlorade fluorescens på grund av vävnad bearbetning.

Hjärtfibroblaster är viktiga för hjärtats baslinjefunktion samt för svar på hjärtskada. Tidigare försök att förstå arrangemanget och morfologin av dessa celler har utförts till stor del i 2D-inställningar. En förfinad hjärtvävnadsrensning (figur 2) och 3D-bildteknik har dock publicerats, vilket möjliggör avancerad, mer detaljerad visualisering av hjärtfibroblaster. Med denna bildteknik konstaterades fibroblaster vara tätt packade och ha en spindled morfologi i oskadda hj?...

Watch this Scientific Journal Video about Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts at JoVE.com

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

En raffinerad metod för vävnad clearing utvecklades och tillämpas på den vuxna mus hjärtat. Denna metod utformades för att rensa tät, autofluorescerande hjärtvävnad, samtidigt som märkt fibroblast fluorescens tillskrivs en genetisk reporter strategi.

Förfinad KLARHET-baserad vävnadsrensning för tredimensionell fibroblastorganisation i friska och skadade mushjärtan

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

Detta nya vävnadsrensningsprotokoll förbättrar befintlig teknik för att möjliggöra en mer exakt in vivo-titt på specifika celltyper i hjärtat och deras beteende under skadeförhållanden. Detta protokoll är snabbt och ganska enkelt. Det möjliggör underhåll av marca fluorescens med minimal interferens från bakgrundsvävnad auto fluorescens utan att kräva cell- eller vävnadsfärgning.Börja med att använda en 70%etanol blötläggd gasväv för att rengöra den experimentella musens ventrala yta. Använd kirurgisk sax för att göra ett tre centimeter tvärgående snitt, ungefär tre meter under xiphoidprocessen och deglove musen från buken till xiphoidprocessen för att separera huden från den underliggande bukväggsvävnaden. Gör ett två centimeter tvärgående snitt i den subkutana bukväggsvävnaden, tre centimeter under xiphoidprocessen och gör ett vertikalt snitt från detta snitt upp i mittlinjen genom revbensburen.Fäst revbenskorgen igen för att exponera hjärtat. Och använd en 10-milliliter spruta utrustad med en 27 gauge nål för att injicera kall PBS i överlägsen vena cava och aorta. När allt blod har spolats från hjärtat, leverera 10 milliliter kall 4%PFA i överlägsen vena cava och aorta för att påbörja fixeringsprocessen.När alla fixativ har blinkats, punktskatt hjärtat och använd en rak bladskalpelel för att separera atria, höger ventrikel och septum och vänster ventrikel. Placera hjärtat i ett 15-milliliter koniskt rör med kallt 4%PFA för en inkubation över natten vid fyra grader celsius på en nötare. Nästa morgon, tillsätt en 0,25%fotoinitieringslösning till en nylagad hydrogellösning och överför hjärtat till vattengelen.Linda det koniska röret i folie för en inkubation över natten vid fyra grader celsius utan fysisk störning. Nästa morgon värm röret i ett 37 grader celsius pärlbad i 2,5 timmar innan du använder tång för att försiktigt överföra hjärtat till ett 15-milliliter rör pbs. Tvätta hjärtat tre gånger i PBS i en timme per tvätt vid 37 grader celsius på en mutter och överför hjärtat i korgen på en aktiv elektroforesmaskin.Fäst locket på plats och fyll den aktiva elektroforeskammarens reservoar med elektroforesrensningslösning. När kammaren är full, sänk ner korgen i lösningen och dra åt locket på elektroforesmaskinen på plats. Kör sedan elektroforesmaskinen på 1,5 ampere och 37 grader celsius i 1,5 timmar.Efter elektrofores, kontrollera hjärtats visuellt för att säkerställa att ingen ogenomskinlig vävnad finns kvar. Tvätta det rensade hjärtat tre gånger i en 15-milliliter två i en timme i färsk PBS vid 37 grader celsius per tvätt på en mutter. Innan du dränker hjärtat i avfärgningsmedel för att minska heme auto fluorescens.Efter 48 timmar, tvätta hjärtat tre gånger i PBS som visats och balansera hjärtat i nyberedda RIMS i 48 timmar före avbildning. För 3D-avbildning av det rensade hjärtat, placera först ett tunt lager vakuumfett på botten av en 3D-utskriven bottenbehållare, samma höjd som provet som avbildas. Fyll behållaren med RIMS och använd en pipettspets för att ta bort eventuella bubblor.Placera försiktigt hjärtat i RIMS med vänster ventrikulär vägg vänd uppåt, var försiktig så att inga bubblor förs in i lösningen. Använd vakuumfett för att fästa en glaskåpa på bottenytan på en 3D-tryckt övre reservoarbit och placera det övre reservoarlocket på de nedre behållarna, var noga med att undvika bubblor. Fyll sedan de övre reservoarerna med glycerol.Använd ett konfokalt mikroskop för att avbilda de rensade hjärtana. Kombinera raffinerad hjärt vävnad clearing med 3D imaging möjliggör en avancerad detaljerad visualisering av hjärt fibroblaster. Med hjälp av denna bildteknik observeras fibroblaster vara tätt packade och ha en spindled morfologi i oskadda hjärtan.Efter ischemi reperfusion skada, en förlust av hjärt fibroblaster ses i regionen ischemic under de första tre dagarna efter skada. Dag sju och 14 har fibroblaster migrerat eller förökat sig för att återbefolka det skadade vävnadsområdet. Dag 28 är hjärtfibroblastpopulationen som omger de skadade områdena i hjärtat som störst.En och en halv dag efter hjärtinfarkt skada, några fibroblaster återstår inom den skadade vänstra ventrikeln. Dag tre expanderar dock fibroblasterna och finns i de flesta av de vänstra ventriklarna. I motsats till ischemisk kirurgi, infusion av angiotensin två och fenolefrin under flera veckor resulterar inte i hjärtvävnad förlust och vägg gallring.Istället justerar fibroblasten längs axeln av högerhänta spiralkontraktionsmönster som ses när man använder det raffinerade till vävnadsrensningsprotokollet. Dessutom, efter angiotensin två och fenolefrin behandling, fibroblaster verkar små och avrundas i motsats till spindelformen som observerats i modeller av ischemi reprofusion och hjärtinfarkt skada. Den elektroforesiska röjningen måste utföras noggrant, särskilt när man arbetar med hjärtan som har genomgått skadeprotokoll.Detta protokoll kan användas för att bedöma hur hjärtfibroblaster reagerar på skada in vivo. Olika fluorescerande markörer kan också användas för att förstå hur hjärtat reagerar på skador på cellnivå.

Research

JoVE Journal

Medicine

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Heterotypisk Tredimensionell<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellering av Stromal-Epithelial interaktioner Under äggstockscancer Inledande och progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

En Tredimensionell Tissue Culture modell för att studera Primary humana benmärg och dess Maligniteter

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Tredimensionell Samodling modell för Tumör-stromal Interaktion

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Tredimensionell (3D) Tumör Spheroid invasionsanalys

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

Tredimensionell alginat-pärla Culture of Human hypofysadenom Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children

Oral Biofilm provtagning för mikrobiomet analys hos friska barn

Oral biofilm and its molecular analysis provide a basis for investigating various dental research and clinical questions. Knowledge of biofilm composition ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optisk clearing och avbildning av Immunolabeled njure vävnad

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

On-Site Sampling and Extraction of Brain Tumors for Metabolomics and Lipidomics Analysis

Provtagning på plats och utvinning av hjärntumörer för metabolomik och Lipidomics-analys

Despite the variety of tools available for cancer diagnosis and classification, methods that enable fast and simple characterization of tumors are still ...

Advanced Cardiac Rhythm Management by Applying Optogenetic Multi-Site Photostimulation in Murine Hearts

Avancerad hjärtrytmhantering genom att tillämpa optogenetisk fotostimulering på flera platser i murina hjärtan

Ventricular tachyarrhythmias are a major cause of mortality and morbidity worldwide. Electrical defibrillation using high-energy electric shocks is ...

Three-Dimensional Collagen Matrix Scaffold Implantation as a Liver Regeneration Strategy

Tredimensionell kollagenmatris byggnadsställning implantation som en leverregenereringsstrategi

Liver diseases are the leading cause of death worldwide. Excessive alcohol consumption, a high-fat diet, and hepatitis C virus infection promote fibrosis, ...