Name: a reproducible intensive care unit-oriented endotoxin model in rats
Uploaded: 2021-02-20T15:00:00
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Los autores desean agradecer a Beatrice Beck-Schimmer (MD) y Erik Schadde (MD) por su examen crítico y su valiosa contribución para este manuscrito.

Todos los experimentos presentados en este protocolo fueron aprobados por las Autoridades Veterinarias del Cantón de Zúrich, Suiza (números de aprobación 134/2014 y ZH088/19). Además, todos los pasos realizados en este experimento estuvieron de acuerdo con las Directrices sobre Experimentos con Animales de la Academia Suiza de Ciencias Mediales (SAMS) y las Directrices de la Federación de Asociaciones Europeas de Ciencia de Animales de Laboratorio (FELASA).
1. Inducción de anestesia y mon...

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	<li>Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology+and+treatment+of+sepsis.">The pathophysiology and treatment of sepsis.</a> New England Journal of Medicine. 348 (2), 138-150 (2003).</li><li>Singer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Third+International+Consensus+Definitions+for+Sepsis+and+Septic+Shock+(Sepsis-3).">The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3).</a> Journal of the American Medical Association. 315 (8), 801-810 (2016).</li><li>Vincent, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+worldwide+burden+of+critical+illness:+the+intensive+care+over+nations+(ICON)+audit.">Assessment of the worldwide burden of critical illness: the intensive care over nations (ICON) audit.</a> Lancet Respiratory Medicine. 2 (5), 380-386 (2014).</li><li>Fleischmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Global+Incidence+and+Mortality+of+Hospital-treated+Sepsis.+Current+Estimates+and+Limitations.">Assessment of Global Incidence and Mortality of Hospital-treated Sepsis. Current Estimates and Limitations.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 259-272 (2016).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duration+of+hypotension+before+initiation+of+effective+antimicrobial+therapy+is+the+critical+determinant+of+survival+in+human+septic+shock.">Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock.</a> Critical Care Medicine. 34 (6), 1589-1596 (2006).</li><li>Gotts, J. E., Matthay, M. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+organ+dysfunction+syndrome+caused+by+endotoxin+in+the+rat:+attenuation+of+liver+dysfunction+by+inhibitors+of+nitric+oxide+synthase.">The multiple organ dysfunction syndrome caused by endotoxin in the rat: attenuation of liver dysfunction by inhibitors of nitric oxide synthase.</a> British Journal of Pharmacology. 116 (7), 2845-2851 (1995).</li><li>Osuchowski, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+quality+threshold+in+pre-clinical+sepsis+studies+(MQTiPSS):+an+international+expert+consensus+initiative+for+improvement+of+animal+modeling+in+sepsis.">Minimum quality threshold in pre-clinical sepsis studies (MQTiPSS): an international expert consensus initiative for improvement of animal modeling in sepsis.</a> Intensive Care Medicine Experimental. 6 (1), 26 (2018).</li><li>Fink, M. P., Heard, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+models+of+sepsis+and+septic+shock.">Laboratory models of sepsis and septic shock.</a> Journal of Surgical Research. 49 (2), 186-196 (1990).</li><li>Buras, J. A., Holzmann, B., Sitkovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+sepsis:+Setting+the+stage.">Animal models of sepsis: Setting the stage.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (10), 854-865 (2005).</li><li>Balls, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+principles+of+humane+experimental+technique:+timeless+insights+and+unheeded+warnings.">The principles of humane experimental technique: timeless insights and unheeded warnings.</a> Altex-Alternatives to Animal Experimentation. 27 (2), 144-148 (2010).</li></ol>

El protocolo descrito aquí permite un modelo de sepsis altamente reproducible, pero fácil de aprender, que se puede adaptar de acuerdo con la pregunta de investigación. Los datos esenciales in vivo que se refieren a la función de los órganos, como la frecuencia cardíaca, la presión arterial y la saturación de oxígeno arterial periférica, se pueden recopilar continuamente, y el muestreo de sangre se puede realizar repetidamente a lo largo del experimento. Además, se pueden instalar modificaciones con respecto a...

La sepsis y su forma más grave, el shock séptico, son síndromes en el terreno de una infección, lo que resulta en una reacción inflamatoria excesiva con la liberación de citoquinas, lo que lleva a cambios fisiológicos y bioquímicos con una defensa inmune suprimida y resultados fatales 1,2. Esta reacción inflamatoria desequilibrada resulta en disfunción orgánica e insuficiencia orgánica en varios órganos vitales como el pulmón, el riñón y el hígado. Con un 37%3, la sepsis es una de las razones más comunes para que un paciente sea ingresado en una unidad de cuidados intensivos (UCI). La mortalidad por sepsis oscila actualmente en torno al 20-30%4. El tratamiento antibiótico temprano y eficaz es de suma importancia5. La reanimación con líquidos y vasopresores debe instalarse temprano, aparte de eso, el tratamiento es puramente de apoyo6.
La sepsis se define como una infección comprobada o sospechada con bacterias, hongos, virus o parásitos, que se acompaña de disfunción orgánica. Los criterios de shock séptico se cumplen cuando un colapso cardiovascular adicional no responde solo al tratamiento con líquidos, y un nivel de lactato de más de 2 milimoles / litro está presente2. La insuficiencia orgánica relacionada con la sepsis puede ocurrir en cualquier órgano, pero es muy común en el sistema cardiovascular, el cerebro, el riñón, el hígado y el pulmón. La mayoría de los pacientes que sufren de sepsis requieren intubación endotraqueal para asegurar las vías respiratorias del paciente, para protegerse de la aspiración y para aplicar ventilación espiratoria final positiva con una alta fracción de oxígeno inspirado para prevenir o superar la hipoxia. Para tolerar un tubo traqueal y ventilación mecánica, los pacientes generalmente requieren sedación.
Las endotoxinas, como los lipopolisacáridos (LPS) como componente de la membrana de las bacterias gramnegativas inducen una fuerte reacción inflamatoria a través del receptor tipo toll (TLR) 47. La activación de una vía definida asegura una reacción inflamatoria estable. Las citoquinas como la proteína quimioatrayente de neutrófilos inducida por citoquinas 1 (CINC-1), la proteína quimioatrayente de monocitos 1 (MCP-1) y la interleucina 6 (IL-6) se conocen como factores pronósticos de gravedad y resultado en este modelo8. La aplicación intravenosa de LPS se ha utilizado con éxito para estudiar diversos aspectos de la sepsis en ratas 8,9.
El tratamiento de la sepsis sigue siendo un desafío, particularmente debido a la falta de modelos animales predictivos. Si la endotoxemia con activación de la inflamación sistémica es un modelo adecuado para el desarrollo de terapias farmacológicas es discutible. Sin embargo, con la conocida vía TLR 4 inducida por LPS se puede obtener un conocimiento importante.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-0 silk sutures</td>
			<td>Ethicon, Sommerville, NJ</td>
			<td>K833</td>
			<td>Standard surgical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 intravenous catheter</td>
			<td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>391349</td>
			<td>Standard anesthesia equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 LOOK black braided silk</td>
			<td>Surgical Specalities Corporation, Wyomissing, PA</td>
			<td>SP114</td>
			<td>Standard surgical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alaris Syringe Pump</td>
			<td>Bencton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Mundipharma, Basel, Switzerland</td>
			<td>7.68034E+12</td>
			<td>GTIN-number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved fine tips microforceps</td>
			<td>World precision instruments (WPI), Sarasota, FL</td>
			<td>504513</td>
			<td>Facilitates vascular preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tips microforceps</td>
			<td>World precision instruments (WPI), Sarasota, FL</td>
			<td>501976</td>
			<td>Tips need to be polished regularly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinity Delta XL Anesthesia monitoring</td>
			<td>Draeger, L&#252;beck, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, 250 mL bottles</td>
			<td>Attane, Piramal, Mumbai, India</td>
			<td>LDNI 22098</td>
			<td>Standard vet. equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Ketalar)</td>
			<td>Pfitzer, New York, NY</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS) from Escherichia coli, serotype 055:B5</td>
			<td>Sigma, Buchs, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-tips small</td>
			<td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>EH11.1</td>
			<td>Standard surgical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringerfundin</td>
			<td>Bbraun, Melsungen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tec-3 Isofluorane Vaporizer</td>
			<td>Ohmeda, GE-Healthcare, Chicago, IL</td>
			<td>not available anymore</td>
			<td>Standard vet. equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (Xylazin Streuli)</td>
			<td>Streuli AG, Uznach, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a reproducible intensive care unit-oriented endotoxin model in rats

La sepsis y el shock séptico siguen siendo la principal causa de muerte en las unidades de cuidados intensivos. A pesar de las mejoras significativas en el manejo de la sepsis, la mortalidad todavía oscila entre el 20 y el 30%. Se necesitan urgentemente nuevos enfoques de tratamiento para reducir la insuficiencia multiorgánica relacionada con la sepsis y la muerte. Los modelos animales robustos permiten uno o múltiples enfoques de tratamiento, así como probar su efecto sobre los parámetros fisiológicos y moleculares. En este artículo, se presenta un modelo animal simple.
En primer lugar, la anestesia general se induce en animales, ya sea con el uso de anestesia volátil o intraperitoneal. Después de la colocación de un catéter intravenoso (vena de la cola), la traqueostomía y la inserción de un catéter intraarterial (arteria de la cola), se inicia la ventilación mecánica. Se registran los valores basales de la presión arterial media, la saturación de oxígeno en sangre arterial y la frecuencia cardíaca.
La inyección de lipopolisacáridos (1 miligramo/kilogramo de peso corporal) disueltos en solución salina tamponada con fosfato induce una respuesta inflamatoria fuerte y reproducible a través del receptor tipo toll 4. Las correcciones de líquidos, así como la aplicación de norepinefrina se realizan en base a protocolos bien establecidos.
El modelo animal presentado en este artículo es fácil de aprender y está fuertemente orientado hacia el tratamiento clínico de la sepsis en una unidad de cuidados intensivos con sedación, ventilación mecánica, monitoreo continuo de la presión arterial y muestreo de sangre repetitivo. Además, el modelo es confiable, lo que permite datos reproducibles con un número limitado de animales de acuerdo con los principios 3R (reducir, reemplazar, refinar) de la investigación con animales. Si bien los experimentos con animales en la investigación de la sepsis no se pueden reemplazar fácilmente, las mediciones repetitivas permiten una reducción de los animales y mantener a los animales sépticos anestesiados disminuye el sufrimiento.

El sistema presentado permite la endotoxemia con animales hemodinámicamente estables como se informó anteriormente9. Mientras que la presión arterial media se mantiene estable en animales con y sin estimulación lpS LPS los animales tratados desarrollan características de sepsis como un exceso de base negativa y una fuerte reacción inflamatoria medida por citoquinas plasmáticas (6 horas después de la aplicación) como CINC-1 (867 ng / mL), MCP-1 (5027 ng / mL) e IL-6 (867 ng / mL)<sup class...

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A Reproducible Intensive Care Unit-Oriented Endotoxin Model in Rats

Aquí, presentamos un modelo de endotoxina reproducible orientado a la unidad de cuidados intensivos en ratas.

Un modelo de endotoxina reproducible orientado a la unidad de cuidados intensivos en ratas

Sepsis and septic shock remain the leading cause of death in intensive care units. Despite significant improvements in sepsis management, mortality still ...

Este protocolo es un modelo robusto y reproducible de endotoxemia en el que los parámetros fisiológicos y moleculares pueden ser evaluados repetidamente. Este enfoque puede ayudar a responder preguntas en la investigación de la sepsis. Si bien nuestro modelo no reemplaza los experimentos con animales, refina los modelos de sepsis a través de la sedación continua y reduce el número de animales a través de muestreos repetidos.Los principiantes pueden tener dificultades con la inserción de catéteres arteriales y venosos, pero solo se requiere una capacitación limitada para dominar estas técnicas. La visualización de toda la configuración experimental facilita a los investigadores configurar, o adaptar, sus modelos para imitar más de cerca una situación en la UCI. Comience transfiriendo el animal anestesiado a una estera calefactora.Manteniendo la temperatura corporal entre 36,5 y 37 grados centígrados. Asegúrese de que el animal esté respirando espontáneamente proporcionando oxígeno con un cono nasal. Confirmar el nivel de anestesia por la ausencia del reflejo de pellizco del dedo del pie antes de la instalación de la traqueostomía y los catéteres arteriales y venosos.Use un ungüento para proteger los ojos. Prepare instrumentos quirúrgicos estériles y catéteres junto con el monitoreo de la presión y la saturación de oxígeno para una oxigenación suficiente. Aplique un torniquete en la cola proximal de la rata para facilitar el acceso venoso y desinfecte la cola tres veces con alcohol.Introduzca un catéter intravenoso de calibre 26 en una de las dos venas laterales de la cola evitando la inyección de aire. Desatara el torniquete después de colocar el catéter intravenoso y fije el catéter intravenoso en su lugar con cinta adhesiva. Conecte las bombas de jeringa con llaves de paso de tres vías al acceso intravenoso para la aplicación continua de líquidos y medicamentos.Comience la traqueostomía afeitando el área anterior del cuello del animal y luego desinfecte la piel afeitada tres veces con solución de povidona yodada. Realice una incisión longitudinal de dos centímetros utilizando una hoja de bisturí número 10. Retraiga la piel con 2-0 suturas de seda.Luego preparó sin rodeos la laringe y la tráquea para abrirla con tijeras quirúrgicas. Inserte una cánula traqueal estéril en la tráquea, teniendo cuidado de no penetrar demasiado profundamente para evitar la ventilación unilateral. Fije la cánula en su lugar usando una sutura de seda 2-O y luego conecte la cánula a un ventilador para ventilación por presión o volumen controlado.Defina los protocolos de reemplazo de líquidos, los protocolos de aplicación del vasoconstrictor y los criterios de aborto antes de configurar el experimento. Desinfecte la cola de la rata tres veces con solución de povidona yodada y luego corte el círculo de la piel un centímetro longitudinalmente en el lado ventral con un bisturí, teniendo cuidado de no cortar demasiado profundamente para evitar una lesión de la arteria de la cola. Use un microscopio quirúrgico para exponer la arteria con cuidado.Corte la fascia que rodea la arteria con micro tijeras quirúrgicas. Luego ligar la parte distal de la arteria realizando sutura de seda proximal 6-0, pero no apriete la seda. Introduzca un catéter de calibre 26 en la arteria entre la sutura de seda distal y proximal, y luego apriete la sutura de seda proximal para fijar el catéter en su lugar.Conecte el catéter a un transductor de presión para proporcionar una medición continua de la presión arterial. Además, coloque una llave de paso de tres vías entre el catéter conectado al transductor de presión y el catéter de calibre 26 para la toma de muestras de sangre arterial. Después de que el animal ha alcanzado un estado estacionario, indujo sepsis inyectando LPS y recolectando muestras de sangre.Reemplace la pérdida de líquido de las muestras de sangre por la solución de Ringer en una proporción de uno a cuatro, evitando la inyección de aire en todo momento para evitar la embolia de aire. La presión arterial media se mantiene estable en animales con y sin estimulación lps. Los animales tratados con LPS desarrollan características de sepsis, como el exceso de base negativa.Los animales tratados con LPS también desarrollaron una fuerte reacción inflamatoria, que fue medida por citoquinas plasmáticas, como la proteína quimioatrayente-1, la proteína quimioatrayente de monocitos-1 y la interleucina-6. Al intentar este protocolo, recuerde predefinir los regímenes de líquidos y vasopresores, así como definir los criterios de terminación para obtener datos de investigación sólidos y reproducibles. Este protocolo se puede adaptar a otros modelos de sepsis.Por lo tanto, una pregunta de investigación se responde con el enfoque más adecuado y de acuerdo con los principios de reducir, refinar, reemplazar el bienestar animal.

Research

JoVE Journal

Medicine

Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

Cariotipo espectral para el Estudio de anomalías cromosómicas en humanos y ratones con la enfermedad renal poliquística

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being ...

Investigación

Medicina

A Murine Closed-chest Model of Myocardial Ischemia and Reperfusion

Un murino tórax cerrado modelo de isquemia y reperfusión miocárdica

Surgical trauma by thoracotomy in open-chest models of coronary ligation induces an immune response which modifies different mechanisms involved in ...

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome ARDS

Lavado inducida por agotamiento de surfactante en los cerdos como modelo del síndrome de distrés respiratorio agudo (SDRA)

Various animal models of lung injury exist to study the complex pathomechanisms of human acute respiratory distress syndrome (ARDS) and evaluate future ...

A Model of Cardiac Remodeling Through Constriction of the Abdominal Aorta in Rats

Un modelo de remodelamiento cardiaco A través de la constricción de la aorta abdominal en ratas

Heart failure is one of the leading causes of death worldwide. It is a complex clinical syndromethat includes fatigue, dyspnea, exercise intolerance, and ...

A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans

Un modelo para simular la hipoxia clínicamente relevantes en seres humanos

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to ...

Use of a Central Venous Line for Fluids, Drugs and Nutrient Administration in a Mouse Model of Critical Illness

El uso de una línea venosa central para fluidos, Drogas y Administración de nutrientes en un modelo de ratón de la enfermedad crítica

This protocol describes a centrally catheterized mouse model of prolonged critical illness. We combine the cecal ligation and puncture method to induce ...

Observational Study Protocol for Repeated Clinical Examination and Critical Care Ultrasonography Within the Simple Intensive Care Studies

Protocolo de estudio observacional para examen clínico repetido y crítico cuidado ecografía dentro de los estudios de la Simple unidad de cuidados intensivos

Longitudinal evaluations of critically ill patients by combinations of clinical examination, biochemical analysis and critical care ultrasonography (CCUS) ...

A Protocol to Set Up Needle-Free Connector with Positive Displacement on Central Venous Catheter in Intensive Care Unit

Protocolo para configurar un conector sin agujas con desplazamiento positivo en el catéter venoso central en la unidad de cuidados intensivos

Needle-free connectors were initially designed and promoted to avoid blood exposure for healthcare workers. Some recent data suggest that the latest ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Inducir lesión pulmonar aguda en ratones por instilación directa de lipopolisacárido intratraal

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Halogenated Agent Delivery in Porcine Model of Acute Respiratory Distress Syndrome via an Intensive Care Unit Type Device

Entrega de agente halogenado en modelo porcino de síndrome de dificultad respiratoria aguda a través de un dispositivo tipo unidad de cuidados intensivos

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