Name: location, dissection, and analysis of the murine stellate ganglion
Uploaded: 2020-12-22T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Hartwig Wieboldt for hans fremragende tekniske bistand, og UKE Microscopy Imaging Facility (Umif) fra University Medical Center Hamburg-Eppendorf for at levere mikroskoper og støtte. Denne forskning blev finansieret af DZHK (Det Tyske Center for Hjerte-kar-forskning) [FKZ 81Z4710141].

Alle dyreforsøg blev godkendt af Animal Care and Use Committee of the State of Hamburg (ORG870, 959) og Det Nordrhein-Westfalske Statslige Agentur for Natur-, Miljø- og Forbrugerbeskyttelse (LANUV, 07/11) og er i overensstemmelse med National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (2011). Der blev udført undersøgelser med mus af hannen og kvinden (i alderen 10-24 uger) C57BL/6 mus (bestandsnummer 000664, Jackson Laboratories) og mus homozygogous (db/db) eller heterozygogous (db/het; c...

Forståelsen af cellulære og molekylære processer i neuroner og gliaceller i det sympatiske nervesystem, der går forud for starten af VA, er af stor interesse, da pludseligt hjertestop forbliver den mest almindelige dødsårsag på verdensplan5. Derfor leverer vi i det nuværende manuskript et grundlæggende repertoire af metoder til at identificere murine SG – et murinelement i dette netværk – og udføre efterfølgende analyser på RNA, protein og cellulært niveau.
<p class="jove_con...

Det hjerte autonome nervesystem er en stramt reguleret ligevægt af sympatiske, parasympatiske og sensoriske komponenter, der gør det muligt for hjertet at tilpasse sig miljømæssige ændringer med den passende fysiologiskereaktion 1,2. Forstyrrelser i denne ligevægt, for eksempel en stigning i sympatisk aktivitet, er blevet etableret som en vigtig drivkraft for debut samt vedligeholdelse af ventrikulær arytmier (VA)3,4. Derfor har autonom graduering, opnået via farmakologisk reduktion af sympatisk aktivitet med betablokkere, været en hjørnesten i behandlingen af patienter med VA i årtier5,6. Men på trods af farmakologiske og kateterbaserede interventioner lider et relevant antal patienter stadig af tilbagevendende VA7.
Sympatisk input til hjertet er for det meste medieret via neuronale cellelegemer i stjernernes ganglier (SG), bilaterale stjerneformede strukturer i den sympatiske kæde, som videresender information via adskillige intrathoracic nerver fra hjernestammen til hjertet8,9,10. Nerve spiring fra SG efter skade er forbundet med VA og pludselig hjertedød11,12, understreger SG som et mål for autonom graduering13,14. En reduktion af sympatisk input til hjertet kan opnås midlertidigt via perkutan injektion af lokalbedøvelse eller permanent ved delvis fjernelse af SG via videoassisteret thoracoskopi15,16. Hjerte sympatisk denervation præsenterer en mulighed for patienter med terapi-ildfast VA med lovende resultater14,16,17. Vi har lært af explanted SG af disse patienter, at neuronal og neurokemisk remodeling, neuro-inflammation og glial aktivering er kendetegnende for sympatisk remodeling, der kan bidrage eller forværre autonom dysfunktion18,19. Stadig forbliver de underliggende cellulære og molekylære processer i disse neuroner uklare til dato, for eksempel rollen som neuronal transdifferentiation til en cholinrgic phenotype20,21. Eksperimentelle undersøgelser præsenterer nye tilgange til behandling af VA, for eksempel, reduktion af sympatisk nerveaktivitet via optogenetics22, men dybdegående karakterisering af SG mangler stadig i mange hjertepatologier, der går i hånd med VA. Musemodeller, der efterligner disse patologier, gør det muligt at studere neuronal remodeling, der potentielt går forud for starten af arytmier12,23. Disse kan suppleres med yderligere morfologiske og funktionelle analyser for autonom karakterisering af hjertet og nervesystemet. I denne protokol leverer vi et grundlæggende repertoire af metoder, der gør det muligt at dissekere og karakterisere murine SG for at forbedre forståelsen af VA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92097</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion Slides SuperFrost plus&#160; 25 x 75 x 1 mm</td>
			<td>R. Langenbrinck</td>
			<td>03-0060</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil.</td>
			<td>Serva</td>
			<td>11924.03</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti neurofilament</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AB5539</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Merck, KGA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti chicken IgY Alexa 647&#160;</td>
			<td>Merck, KGA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>AP194SA6</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti goat IgG Alexa 568&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11057</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit IgG Alexa 488&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying block 37-100 mm</td>
			<td>Whatman (Sigma Aldrich)</td>
			<td>WHA10310992&#160;</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %)</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>2212.5000</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt mounting medium</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>253681.0008</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G + DAPI</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti choline acetyltransferase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AP144P</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2 30% (w/w)</td>
			<td>Merck, KGA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml</td>
			<td>Rotexmedica</td>
			<td>PZN: 3862340</td>
			<td>Preparation SG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-capacity cDNA reverse transctiption kit</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>&#160;4368813</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (Forene)</td>
			<td>Abbott Laboratories</td>
			<td>2594.00.00</td>
			<td>Preparation SG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s hemalum solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09249.0500</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glasses 20x20 mm or smaller</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0101040</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 570 Reagent Pack</td>
			<td>Akoya Bioscience</td>
			<td>FP1488001KT</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>7691202</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline tablets</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912-014</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinzette Dumont SS Forceps</td>
			<td>FineScienceTools</td>
			<td>11203-25</td>
			<td>Preparation SG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>79306</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti tyrosine hydroxylase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Merck</td>
			<td>R0901-100ML</td>
			<td>RNA isolation (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2</td>
			<td>biotechne (ACD)</td>
			<td>323100</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Probe-Mm-S100b-C2</td>
			<td>biotechne (ACD)</td>
			<td>431738-C2</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Probe-Mm-Tubb3</td>
			<td>biotechne (ACD)</td>
			<td>423391</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel beads 7 mm&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>69990</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan black B</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0292.2</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan mastermix</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>4370074</td>
			<td>Gene Expression analysis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 10% solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93443-100ml</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-100ML</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wacom bamboo pen</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>CTL-460/K</td>
			<td>Cell size measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA10311647</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>W21404</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

location, dissection, and analysis of the murine stellate ganglion

Det autonome nervesystem er en væsentlig drivkraft for hjerteelektrofysiologi. Især den rolle, som dens sympatiske gren er et igangværende spørgsmål om undersøgelse i patofysiologi af ventrikulær arytmier (VA). Neuroner i stjernernes ganglier (SG)   - bilaterale stjerneformede strukturer i den sympatiske kæde -   er en vigtig del af den sympatiske infrastruktur. SG er et anerkendt mål for behandling via hjerte sympatisk denervation hos patienter med terapi-ildfast VA. Mens neuronal remodeling og glial aktivering i SG er blevet beskrevet hos patienter med VA, de underliggende cellulære og molekylære processer, der potentielt går forud for starten af arytmi er kun utilstrækkeligt forstået og bør belyses for at forbedre autonom graduering. Musemodeller giver os mulighed for at studere sympatisk neuronal remodeling, men identifikation af murine SG er udfordrende for den uerfarne efterforsker. Således mangler dybdegående cellulære og molekylære biologiske undersøgelser af murine SG for mange almindelige hjertesygdomme. Her beskriver vi et grundlæggende repertoire til dissekering og undersøgelse af SG'et hos voksne mus til analyser på RNA-niveau (RNA-isolation til genekspressionsanalyser, in situ-hybridisering), proteinniveau (immunfluorescent helmonterings farvning) og cellulært niveau (grundlæggende morfologi, cellestørrelsesmåling). Vi præsenterer potentielle løsninger til at overvinde udfordringer i forberedelsesteknikken, og hvordan man kan forbedre farvningen via slukning af autofluorescens. Dette giver mulighed for visualisering af neuroner såvel som gliaceller via etablerede markører for at bestemme cellesammensætning og remodelingsprocesser. De metoder, der præsenteres her, gør det muligt at karakterisere SG for at få yderligere oplysninger om autonom dysfunktion hos mus, der er tilbøjelige til VA og kan suppleres med yderligere teknikker, der undersøger neuronale og gliakomponenter i det autonome nervesystem i hjertet.

Figur 1 visualiserer, hvordan man identificerer og dissekerer SG. Figur 1A viser en skematisk tegning af placeringen, mens Figur 1B præsenterer udsigten ind i brystkassen efter fjernelse af hjerte-lunge-pakken. Den venstre og højre longus colli muskler mediale fra SG og brystkassen er vigtige vartegn for orientering. Dissektion udføres langs de spredte linjer mellem musklerne og det første ribben. SG og den sympatiske kæde bliv...

Watch this Scientific Journal Video about Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion at JoVE.com

Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion

Patofysiologiske ændringer i hjerte-autonome nervesystem, især i dets sympatiske gren, bidrager til debut og vedligeholdelse af ventrikulære arytmier. I denne protokol viser vi, hvordan man karakteriserer murine stellate ganglier for at forbedre forståelsen af de underliggende molekylære og cellulære processer.

Placering, dissektion og analyse af Murine Stellate Ganglion

The autonomic nervous system is a substantial driver of cardiac electrophysiology. Especially&#160;the role of its sympathetic branch is an ongoing matter ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis

The vitreous is an optically clear, collagenous extracellular matrix that fills the inside of the eye and overlies the retina. 1,2 Abnormal interactions ...

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

Whole Vitreous Humor Dissection for Vitreodynamic Analysis

Whole Corpus vitreum Dissektion for Vitreodynamic Analysis

The authors propose an effective technique to isolate whole, intact vitreous core and cortex from post mortem enucleated porcine eyes. While previous ...

Murine Prostate Micro-dissection and Surgical Castration

Murint Prostata Micro-dissektion og kirurgisk kastration

Mouse models are used extensively to study prostate cancer and other diseases. The mouse is an excellent model with which to study the prostate and has ...

Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling

Dissektion af musen bugspytkirtlen for histologiske analyse og metabolisk profilering

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at ...

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

Dissektion og eksplantat kultur af Murine Allantois til In Vitro -analyse af allantois vedhæftet fil

The placenta is essential for the growth and development of mammalian embryos. For this reason, numerous genetic alterations and likely also environmental ...

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of &#946;-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

Kvantitative mikro-CT-analyse af Aortopathy i en musemodel af β-aminopropionitrile-induceret aorta aneurisme og dissektion

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of ...

A Non-Invasive Method for Generating the Cyclic Loading-Induced Intra-Articular Cartilage Lesion Model of the Rat Knee

En ikke-invasiv metode til generering af den cykliske belastningsinducerede intraartikulære brusklæsionsmodel af rotteknæet

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely ...

Robot-assisted Total Mesorectal Excision and Lateral Pelvic Lymph Node Dissection for Locally Advanced Middle-low Rectal Cancer

Robot-assisteret Total Mesorectal Excision og Lateral Bækken lymfeknude Dissektion for lokalt avanceret mellemlav endetarmskræft

Since their approval for clinical use, da Vinci surgical robots have shown great advantages in gastrointestinal surgical operations, especially in complex ...