Name: location, dissection, and analysis of the murine stellate ganglion
Uploaded: 2020-12-22T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion at JoVE.com

De auteurs willen Hartwig Wieboldt bedanken voor zijn uitstekende technische bijstand en de UKE Microscopy Imaging Facility (Umif) van het Universitair Medisch Centrum Hamburg-Eppendorf voor het leveren van microscopen en ondersteuning. Dit onderzoek werd gefinancierd door het DZHK (Duits Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek) [FKZ 81Z4710141].

Alle procedures met betrekking tot dieren zijn goedgekeurd door het Comité voor verzorging en gebruik van dieren van de staat Hamburg (ORG870, 959) en het Noordrijn-Westfalense staatsagentschap voor natuur, milieu en consumentenbescherming (LANUV, 07/11) en voldoen aan de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de Nationale Instituten voor gezondheid (2011). Studies werden uitgevoerd met mannelijke en vrouwelijke (leeftijd 10-24 weken) C57BL/6 muizen (stamnummer 000664, Jackson Laboratories) en muizen...

Het begrip van cellulaire en moleculaire processen in neuronen en gliacellen van het sympathische zenuwstelsel die voorafgaan aan het begin van VA is van groot belang, omdat plotselinge hartstilstand wereldwijd de meest voorkomende doodsoorzaak blijft5. Daarom bieden we in het huidige manuscript een basisrepertoire van methoden om de murine SG – een murien element binnen dit netwerk – te identificeren en daaropvolgende analyses uit te voeren op RNA-, eiwit- en cellulair niveau.
<p class="j...

Het autonome hart zenuwstelsel is een strak gereguleerd evenwicht van sympathische, parasympathische en zintuiglijke componenten waarmee het hart zich kan aanpassen aan omgevingsveranderingen met de juiste fysiologische respons1,2. Verstoringen in dit evenwicht, bijvoorbeeld een toename van sympathische activiteit, zijn vastgesteld als een belangrijke drijfveer voor het ontstaan en het behoud van ventriculaire aritmieën (VA)3,4. Daarom is autonome modulatie, bereikt via farmacologische vermindering van sympathische activiteit met bètablokkers, al tientallen jaren een hoeksteen in de behandeling van patiënten met VA5,6. Maar ondanks farmacologische en kathetergebaseerde interventies lijdt een relevant aantal patiënten nog steeds aan terugkerende VA7.
Sympathische input voor het hart wordt meestal gemedieerd via neuronale cellichamen in de stellate ganglia (SG), bilaterale stervormige structuren van de sympathische keten, die informatie doorgeven via tal van intrathoracale zenuwen van de hersenstam naar het hart8,9,10. Zenuw ontkiemen uit de SG na letsel wordt geassocieerd met VA en plotselinge hartdood11,12, met de nadruk op de SG als een doelwit voor autonome modulatie13,14. Een vermindering van de sympathische input in het hart kan tijdelijk worden bereikt via percutane injectie van lokale anesthetica of permanent door gedeeltelijke verwijdering van de SG via video-ondersteunde thoracoscopie15,16. Cardiale sympathische denervatie biedt een optie voor patiënten met therapie-refractaire VA met veelbelovende resultaten14,16,17. We hebben van explanted SG van deze patiënten geleerd dat neuronale en neurochemische remodellering, neuro-ontsteking en gliaactivering kenmerken zijn van sympathische remodellering die autonome disfunctie kunnen bijdragen of verergeren18,19. Toch blijven de onderliggende cellulaire en moleculaire processen in deze neuronen tot op heden onduidelijk, bijvoorbeeld de rol van neuronale transdifferentiatie in een cholinerge fenotype20,21. Experimentele studies presenteren nieuwe benaderingen om VA te behandelen, bijvoorbeeld de vermindering van sympathische zenuwactiviteit via optogenetica22, maar diepgaande karakterisering van de SG ontbreekt nog steeds in veel hartpathologieën die hand in hand gaan met VA. Muismodellen die deze pathologieën nabootsen, maken het mogelijk neuronale remodellering te bestuderen die mogelijk voorafgaat aan het begin van aritmieën12,23. Deze kunnen worden aangevuld door verdere morfologische en functionele analyses voor autonome karakterisering van het hart en het zenuwstelsel. In dit protocol bieden we een basisrepertoire van methoden waarmee de murine SG kan worden ontleed en gekarakteriseerd om het begrip van VA te verbeteren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92097</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion Slides SuperFrost plus&#160; 25 x 75 x 1 mm</td>
			<td>R. Langenbrinck</td>
			<td>03-0060</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil.</td>
			<td>Serva</td>
			<td>11924.03</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti neurofilament</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AB5539</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Merck, KGA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti chicken IgY Alexa 647&#160;</td>
			<td>Merck, KGA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>AP194SA6</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti goat IgG Alexa 568&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11057</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit IgG Alexa 488&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying block 37-100 mm</td>
			<td>Whatman (Sigma Aldrich)</td>
			<td>WHA10310992&#160;</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %)</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>2212.5000</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt mounting medium</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>253681.0008</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G + DAPI</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti choline acetyltransferase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AP144P</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2 30% (w/w)</td>
			<td>Merck, KGA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml</td>
			<td>Rotexmedica</td>
			<td>PZN: 3862340</td>
			<td>Preparation SG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-capacity cDNA reverse transctiption kit</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>&#160;4368813</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (Forene)</td>
			<td>Abbott Laboratories</td>
			<td>2594.00.00</td>
			<td>Preparation SG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s hemalum solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09249.0500</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glasses 20x20 mm or smaller</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0101040</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 570 Reagent Pack</td>
			<td>Akoya Bioscience</td>
			<td>FP1488001KT</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>7691202</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline tablets</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912-014</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinzette Dumont SS Forceps</td>
			<td>FineScienceTools</td>
			<td>11203-25</td>
			<td>Preparation SG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>79306</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti tyrosine hydroxylase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Merck</td>
			<td>R0901-100ML</td>
			<td>RNA isolation (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2</td>
			<td>biotechne (ACD)</td>
			<td>323100</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Probe-Mm-S100b-C2</td>
			<td>biotechne (ACD)</td>
			<td>431738-C2</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Probe-Mm-Tubb3</td>
			<td>biotechne (ACD)</td>
			<td>423391</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel beads 7 mm&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>69990</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan black B</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0292.2</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan mastermix</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>4370074</td>
			<td>Gene Expression analysis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 10% solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93443-100ml</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-100ML</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wacom bamboo pen</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>CTL-460/K</td>
			<td>Cell size measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA10311647</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>W21404</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

location, dissection, and analysis of the murine stellate ganglion

Het autonome zenuwstelsel is een belangrijke aanjager van hartelektrofysiologie. Vooral de rol van zijn sympathische tak is een lopende kwestie van onderzoek in de pathofysiologie van ventriculaire aritmieën (VA). Neuronen in de stellate ganglia (SG)   – bilaterale stervormige structuren van de sympathische keten –   zijn een belangrijk onderdeel van de sympathische infrastructuur. De SG zijn een erkend doelwit voor behandeling via cardiale sympathische denervatie bij patiënten met therapierefractaire VA. Hoewel neuronale remodellering en gliaactivering in de SG zijn beschreven bij patiënten met VA, worden de onderliggende cellulaire en moleculaire processen die mogelijk voorafgaan aan het begin van aritmie slechts onvoldoende begrepen en moeten ze worden opgehelderd om autonome modulatie te verbeteren. Muismodellen stellen ons in staat om sympathische neuronale remodellering te bestuderen, maar identificatie van de murine SG is een uitdaging voor de onervaren onderzoeker. Zo ontbreken diepgaande cellulaire en moleculair biologische studies van de muriene SG voor veel voorkomende hartziekten. Hier beschrijven we een basisrepertoire voor het ontleden en bestuderen van de SG bij volwassen muizen voor analyses op RNA-niveau (RNA-isolatie voor genexpressieanalyses, in situ hybridisatie), eiwitniveau (immunofluorescente whole mount staining) en cellulair niveau (basismorfologie, celgroottemeting). We presenteren mogelijke oplossingen om uitdagingen in de bereidingstechniek te overwinnen en hoe we kleuring kunnen verbeteren door autofluorescentie te doven. Dit maakt de visualisatie van neuronen en gliacellen via gevestigde markers mogelijk om de celsamenstelling en remodelleringsprocessen te bepalen. De hier gepresenteerde methoden maken het mogelijk om de SG te karakteriseren om meer informatie te krijgen over autonome disfunctie bij muizen die vatbaar zijn voor VA en kunnen worden aangevuld met aanvullende technieken die neuronale en gliale componenten van het autonome zenuwstelsel in het hart onderzoeken.

Figuur 1 visualiseert hoe de SG te identificeren en te ontleden. Figuur 1A toont een schematische tekening van de locatie, terwijl figuur 1B het zicht in de thorax weergeeft na verwijdering van het hart-long-pakket. De linker en rechter longus colli spieren mediaal van de SG en de ribbenkast zijn belangrijke oriëntatiepunten voor oriëntatie. Dissectie wordt uitgevoerd langs de stippellijnen tussen spieren en de eerste rib. De SG e...

Watch this Scientific Journal Video about Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion at JoVE.com

Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion

Pathofysiologische veranderingen in het cardiale autonome zenuwstelsel, vooral in de sympathische tak, dragen bij aan het ontstaan en onderhoud van ventriculaire aritmieën. In dit protocol laten we zien hoe we murine stellate ganglia kunnen karakteriseren om het begrip van de onderliggende moleculaire en cellulaire processen te verbeteren.

Locatie, dissectie en analyse van het Murine Stellate Ganglion

The autonomic nervous system is a substantial driver of cardiac electrophysiology. Especially&#160;the role of its sympathetic branch is an ongoing matter ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Een methode voor Murine Islet Isolatie en subcapsulaire Niertransplantatie

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis

Dissectie van de Mens glasvocht Elementen voor proteoomanalyse

The vitreous is an optically clear, collagenous extracellular matrix that fills the inside of the eye and overlies the retina. 1,2 Abnormal interactions ...

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

Whole Vitreous Humor Dissection for Vitreodynamic Analysis

Hele glasvocht Dissection voor Vitreodynamic Analyse

The authors propose an effective technique to isolate whole, intact vitreous core and cortex from post mortem enucleated porcine eyes. While previous ...

Murine Prostate Micro-dissection and Surgical Castration

Murine Prostaat Micro-dissectie en chirurgische castratie

Mouse models are used extensively to study prostate cancer and other diseases. The mouse is an excellent model with which to study the prostate and has ...

Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling

Dissectie van de alvleesklier muis voor histologisch analyse en metabole profilering

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at ...

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

Dissectie en Explant cultuur van lymfkliertest Allantois voor de In Vitro analyse van allantoïs bijlage

The placenta is essential for the growth and development of mammalian embryos. For this reason, numerous genetic alterations and likely also environmental ...

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of &#946;-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

Kwantitatieve analyse van de Micro-CT van Aortopathy in een muismodel van β-aminopropionitrile-geïnduceerde aorta aneurysma en dissectie

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of ...

A Non-Invasive Method for Generating the Cyclic Loading-Induced Intra-Articular Cartilage Lesion Model of the Rat Knee

Een niet-invasieve methode voor het genereren van het cyclische belastingsgeïnduceerde intra-articulaire kraakbeenlaesiemodel van de rattenknie

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely ...

Robot-assisted Total Mesorectal Excision and Lateral Pelvic Lymph Node Dissection for Locally Advanced Middle-low Rectal Cancer

Robot-geassisteerde totale mesorectale excisie en laterale bekkenlymfeklierdissectie voor lokaal gevorderde midden-lage rectale kanker

Since their approval for clinical use, da Vinci surgical robots have shown great advantages in gastrointestinal surgical operations, especially in complex ...