Name: location, dissection, and analysis of the murine stellate ganglion
Uploaded: 2020-12-22T14:45:00
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著者らは、ハートウィグ・ヴィーボルトの優れた技術支援と、ハンブルク・エッペンドルフ大学医療センターのUKE顕微鏡イメージング施設(Umif)に、顕微鏡とサポートを提供してくれたことに感謝したいと考えています。この研究は、DZHK(ドイツ心臓血管研究センター)[FKZ 81Z4710141]によって資金提供されました。

動物に関するすべての手順は、ハンブルク州動物管理使用委員会(ORG870、959)およびノルトライン・ヴェストファーレン州自然環境消費者保護庁(LANUV、07/11)によって承認され、国立衛生研究所の動物のケアと使用ガイド(2011)に準拠しました。研究は、糖尿病自発的突然変異(Lepr db;;)の男性と女性(10-24週齢)C57BL/6マウス(ストック数000664、ジャクソン研究所)およびマウスホモ接合体(db/db)またはヘテ?...

突然の心停止が世界的に最も一般的な死因であり続けるため、VAの発症に先立つ交感神経系のニューロンおよびグリア細胞における細胞および分子プロセスの理解は高い関心を持つ。そこで、現在の原稿では、このネットワーク内のマウスエレメントであるマウスSGを同定し、RNA、タンパク質、細胞レベルでのその後の分析を行う方法の基本的なレパートリーを提供していま...

心臓自律神経系は、交感神経、副交感神経、感覚成分の緊密に調整された平衡であり、心臓が適切な生理学的応答を有する環境変化に適応することを可能にする1,2。この平衡における障害は、例えば、交感神経活動の増加、心室性不整脈(VA)3、4の維持と同様に発症の重要な促進要因として確立されている。従って、自律的変調は、β遮断薬による交感神経活性の薬理学的減少を通じて達成され、数十年5、6年のVA患者の治療の基礎となっている。しかし、薬理学的およびカテーテルベースの介入にもかかわらず、関連する数の患者はまだ再発VA7に苦しんでいる。
心臓への交感神経入力は、主に星状神経節(SG)の神経細胞体を介して媒介され、交感神経鎖の両側の星形構造は、脳幹から心臓8、9、10に多数の胸腔内神経を介して情報を中継する。傷害後にSGから発芽した神経はVAと突然心死11、12に関連し、自律変調13、14の標的としてSGを強調する。心臓への交感神経入力の減少は、局所麻酔薬の経皮的注入を介して一時的に、またはビデオ支援胸腔鏡15、16を介してSGの部分的除去によって永久に達成することができる。心臓交感神経脱用は、有望な結果を有する治療難治性VA患者のためのオプションを提示する14,16,17.我々は、神経および神経化学的リモデリング、神経炎症およびグリア活性化が自律神経機能障害18、18を寄与または悪化させる可能性のある交感神経リモデリングの特徴であることを、これらの患者の植え付けられたSGから学んだ。それでも、これらのニューロンにおける基礎となる細胞および分子プロセスは、現在まで不明瞭なままであり、例えば、コリン作動性表現型20,21へのニューロントランス分化の役割。実験研究は、VAを治療するための新しいアプローチを提示し、例えば、光遺伝学22を介した交感神経活性の減少であるが、SGの詳細な特徴付けは、VAと手をつないで行く多くの心臓病理に依然として欠けている。これらの病理を模倣するマウスモデルは、潜在的に不整脈12、23の発症に先行する神経リモデリングを研究することを可能にする。これらは、心臓および神経系の自律神経特性解析のための更なる形態学的および機能的分析によって完了することができる。本プロトコルでは、VAの理解を深めるためにマウスSGを解剖し特徴付けできる方法の基本的なレパートリーを提供する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92097</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion Slides SuperFrost plus&#160; 25 x 75 x 1 mm</td>
			<td>R. Langenbrinck</td>
			<td>03-0060</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil.</td>
			<td>Serva</td>
			<td>11924.03</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti neurofilament</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AB5539</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Merck, KGA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti chicken IgY Alexa 647&#160;</td>
			<td>Merck, KGA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>AP194SA6</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti goat IgG Alexa 568&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11057</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit IgG Alexa 488&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying block 37-100 mm</td>
			<td>Whatman (Sigma Aldrich)</td>
			<td>WHA10310992&#160;</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %)</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>2212.5000</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt mounting medium</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>253681.0008</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G + DAPI</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti choline acetyltransferase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AP144P</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2 30% (w/w)</td>
			<td>Merck, KGA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml</td>
			<td>Rotexmedica</td>
			<td>PZN: 3862340</td>
			<td>Preparation SG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-capacity cDNA reverse transctiption kit</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>&#160;4368813</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (Forene)</td>
			<td>Abbott Laboratories</td>
			<td>2594.00.00</td>
			<td>Preparation SG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s hemalum solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09249.0500</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glasses 20x20 mm or smaller</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0101040</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 570 Reagent Pack</td>
			<td>Akoya Bioscience</td>
			<td>FP1488001KT</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>7691202</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline tablets</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912-014</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinzette Dumont SS Forceps</td>
			<td>FineScienceTools</td>
			<td>11203-25</td>
			<td>Preparation SG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>79306</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti tyrosine hydroxylase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Merck</td>
			<td>R0901-100ML</td>
			<td>RNA isolation (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2</td>
			<td>biotechne (ACD)</td>
			<td>323100</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Probe-Mm-S100b-C2</td>
			<td>biotechne (ACD)</td>
			<td>431738-C2</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Probe-Mm-Tubb3</td>
			<td>biotechne (ACD)</td>
			<td>423391</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel beads 7 mm&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>69990</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan black B</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0292.2</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan mastermix</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>4370074</td>
			<td>Gene Expression analysis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 10% solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93443-100ml</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-100ML</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wacom bamboo pen</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>CTL-460/K</td>
			<td>Cell size measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA10311647</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>W21404</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

location, dissection, and analysis of the murine stellate ganglion

自律神経系は心臓電気生理学の実質的な原動力である。特にその交感神経枝の役割は、心室性不整脈(VA)の病態生理学における継続的な調査の問題である。星状神経節(SG)のニューロン   は、交感神経鎖の両側の星形構造であり   、交感神経系の重要な要素です。SGは、治療難治性VA患者における心交感神経変性による治療のための認識された標的である。SGにおける神経細胞リモデリングおよびグリア活性化はVA患者に記載されているが、不整脈の発症に先立つ可能性のある基礎となる細胞および分子プロセスは十分に理解されておらず、自律神経変調を改善するために解明されるべきである。マウスモデルは交感神経リモデリングを研究することができますが、マウスSGの同定は経験の浅い研究者にとって困難です。したがって、マウスSGの詳細な細胞および分子生物学的研究は、多くの一般的な心疾患に欠けている。ここでは、RNAレベル(遺伝子発現解析のためのRNA単離、その際のハイブリダイゼーション)、タンパク質レベル(免疫蛍光全体実装染色)、および細胞レベル(基本的形態、細胞サイズ測定)での分析のために成体マウスのSGを解剖および研究するための基本的なレパートリーについて説明します。調製技術の課題を克服するための潜在的な解決策と、自己蛍光の消光による染色の改善方法を提示します。これにより、細胞組成およびリモデリングプロセスを決定するために、確立されたマーカーを介して神経細胞とグリア細胞を可視化することができます。ここで示す方法は、VAになりやすいマウスの自律神経機能不全に関するさらなる情報を得るためにSGを特徴付けることを可能にし、心臓の自律神経系の神経およびグリア成分を調査する追加の技術によって補完することができる。

図 1は、SG を識別して解剖する方法を視覚化します。 左右の長角のコリ筋肉はSGとリブケージから内側に入る方向の重要なランドマークです。解剖は、筋肉と最初の肋骨の間の点線に沿って行われる。SGと交感神経鎖は白い構造として見えるようになります(図1C)。図1Dは、左の長い...

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Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion

心臓自律神経系、特に交感神経の神経系における病態生理学的変化は、心室性不整脈の発症および維持に寄与する。本プロトコルでは、マウスの星状神経節を特徴付け、基礎となる分子および細胞プロセスの理解を深める方法を示す。

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Research

JoVE Journal

Medicine

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