Name: location, dissection, and analysis of the murine stellate ganglion
Uploaded: 2020-12-22T14:45:00
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저자는 그의 우수한 기술 지원에 대한 하트 위비히 Wieboldt 감사하고 싶습니다, 그리고 현미경및 지원을 제공하는 대학 의료 센터 함부르크 - Eppendorf의 UKE 현미경 이미징 시설 (Umif). 이 연구는 DZHK에 의해 투자되었다 (심장 혈관 연구를위한 독일 센터) [FKZ 81Z4710141].

동물과 관련된 모든 절차는 함부르크 주의 동물 관리 및 사용위원회 (ORG870, 959)와 자연, 환경 및 소비자 보호를위한 노스 라인 - 웨스트 팔리안 국가 기관 (LANUV, 07/11)에 의해 승인되었으며 국립 보건 원 (2011)에 준수합니다. 연구 결과는 당뇨병 자발적인 돌연변이를 위한 남성과 여성 (10-24주) C57BL/6 마우스(주식 번호 000664, 잭슨 연구소) 및 마우스 호모지구우스(db/db) 또는 이종화구우스(db/het; 대조군)?...

VA의 개시에 선행된 교감 신경계의 신경세포 및 분자 프로세스에 있는 세포 및 분자 프로세스의 이해는, 급격한 심장 정지가 전 세계적으로 죽음의 일반적인 원인 남아 있기 때문에, 높은 관심사입니다5. 따라서, 현재 원고에서, 우리는 뮤린 SG를 식별하는 방법의 기본 레퍼토리를 제공합니다 - 이 네트워크 내의 뮤린 원소 - RNA에 후속 분석을 수행, 단백질, 및 세포 수준.
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심장 자율 신경계는 심장이 적절한 생리적 반응1,2로환경 변화에 적응할 수 있도록 교감, 부교감 및 감각 성분의 엄격하게 조절된 평형이다. 이러한 평형의 교란은 예를 들어, 교감 활동의 증가, 발병의 핵심 동인으로서 확립된 뿐만 아니라 심실 부정맥(VA)3,4의유지보수로 확립되었다. 따라서, 베타 차단제와의 교감 활동의 약리학적 감소를 통해 달성된 자율 변조는 수십 년 동안 VA를 가진 환자의 치료에 초석이 되어왔다5,6. 그러나 약리학 및 카테터 기반 내정간섭에도 불구하고, 환자의 관련 수는 아직도 재발성 VA7때문에 손해를 입습니다.
심장에 대한 공감 입력은 주로 스텔레이트 신경리아(SG)의 신경 세포 체를 통해 중재되며, 교감 사슬의 양자 별 모양 구조는 뇌간에서 심장8,9,10까지수많은 내트라토라시크 신경을 통해 정보를 전달한다. 부상 후 SG로부터 발아하는 신경은 VA및 갑작스런심장사멸(11,12)과관련이 있으며, SG를 자율변조의 대상으로강조한다(13,14). 심장에 대한 공감 입력의 감소는 비디오 보조 흉부검사(15,16)를통해 SG를 부분적으로 제거함으로써 국소 마취제의 경피 주입또는 영구적으로 영구적으로 얻을 수 있다. 심장 동정 성 서성 검사는 유망한 결과 와 치료 불응성 VA 환자에 대한 옵션을 제공합니다14,16,17. 우리는 신경 및 신경 화학적 리모델링, 신경 염증 및 신경교 활성화가 자율 기능 장애18,19에기여하거나 악화 시킬 수있는 공감 리모델링의 특징이라는 이러한 환자의 이식 SG에서 배웠습니다. 여전히, 이러한 뉴런의 기본 세포 및 분자 과정은 현재까지 모호하게 남아, 예를 들어, 해저 현상형으로 뉴런 전이의 역할20,21. 실험 연구는 VA를 치료하는 새로운 접근 방식을 제시, 예를 들어, 광유전학을 통해 교감 신경 활동의 감소(22)하지만 SG의 심층 특성은 여전히 VA와 함께 가는 많은 심장 병리학에서 부족. 이러한 병리를 모방 마우스 모델은 잠재적으로 부정맥의 발병 앞에 신경 리모델링을 연구 할 수 있습니다12,23. 이들은 심혼과 신경계의 자율 특성화를 위한 추가 형태학 및 기능적인 분석에 의해 완료될 수 있습니다. 본 프로토콜에서, 우리는 VA의 이해를 향상시키기 위해 뮤린 SG를 해부하고 특성화 할 수있는 방법의 기본 레퍼토리를 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92097</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion Slides SuperFrost plus&#160; 25 x 75 x 1 mm</td>
			<td>R. Langenbrinck</td>
			<td>03-0060</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil.</td>
			<td>Serva</td>
			<td>11924.03</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti neurofilament</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AB5539</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Merck, KGA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti chicken IgY Alexa 647&#160;</td>
			<td>Merck, KGA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>AP194SA6</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti goat IgG Alexa 568&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11057</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit IgG Alexa 488&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying block 37-100 mm</td>
			<td>Whatman (Sigma Aldrich)</td>
			<td>WHA10310992&#160;</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %)</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>2212.5000</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt mounting medium</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>253681.0008</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G + DAPI</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti choline acetyltransferase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AP144P</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2 30% (w/w)</td>
			<td>Merck, KGA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml</td>
			<td>Rotexmedica</td>
			<td>PZN: 3862340</td>
			<td>Preparation SG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-capacity cDNA reverse transctiption kit</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>&#160;4368813</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (Forene)</td>
			<td>Abbott Laboratories</td>
			<td>2594.00.00</td>
			<td>Preparation SG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s hemalum solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09249.0500</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glasses 20x20 mm or smaller</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0101040</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 570 Reagent Pack</td>
			<td>Akoya Bioscience</td>
			<td>FP1488001KT</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>7691202</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline tablets</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912-014</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinzette Dumont SS Forceps</td>
			<td>FineScienceTools</td>
			<td>11203-25</td>
			<td>Preparation SG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>79306</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti tyrosine hydroxylase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Merck</td>
			<td>R0901-100ML</td>
			<td>RNA isolation (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2</td>
			<td>biotechne (ACD)</td>
			<td>323100</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Probe-Mm-S100b-C2</td>
			<td>biotechne (ACD)</td>
			<td>431738-C2</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Probe-Mm-Tubb3</td>
			<td>biotechne (ACD)</td>
			<td>423391</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel beads 7 mm&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>69990</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan black B</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0292.2</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan mastermix</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>4370074</td>
			<td>Gene Expression analysis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 10% solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93443-100ml</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-100ML</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wacom bamboo pen</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>CTL-460/K</td>
			<td>Cell size measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA10311647</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>W21404</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

location, dissection, and analysis of the murine stellate ganglion

자율 신경계는 심장 전기 생리학의 실질적인 동인입니다. 특히 그 공감 분기의 역할은 심실 부정맥 (VA)의 병리 생리학에 있는 조사의 지속적인 문제입니다. 동정 사슬의 양측 별 모양 구조인 스텔레이트 신경리아(SG)의   뉴런은   공감 인프라의 중요한 구성 요소입니다. SG는 치료 내화 VA를 가진 환자에 있는 심장 교감 기질을 통해 처리를 위한 인정된 표적입니다. SG의 신경 리모델링 및 신경교 활성화는 VA 환자에서 설명되었지만, 잠재적으로 부정맥의 발병에 앞서 있는 근본적인 세포 및 분자 과정은 충분히 이해되지 않으며 자율 변조를 개선하기 위해 해명되어야 합니다. 마우스 모델은 우리가 공감 신경 리모델링을 연구 할 수 있습니다, 하지만 murine SG의 식별은 경험이 없는 조사자에게 도전이다. 따라서, 뮤린 SG의 심층 세포 및 분자 생물학적 연구는 많은 일반적인 심장 질환에 대한 부족하다. 여기서, RNA 수준(유전자 발현 분석을 위한 RNA 절연, 현장에서 혼성화), 단백질 수준(면역형성 전체 마운트 염색), 및 세포 수준(기본 형태학, 세포 크기 측정)에서 분석을 위해 성인 마우스에서 SG를 해부하고 연구하기 위한 기본 레퍼토리를 설명합니다. 우리는 준비 기술의 문제를 극복하기 위한 잠재적인 해결책과 자동 불발성 담금질을 통해 염색을 개선하는 방법을 제시합니다. 이를 통해 세포 조성 및 리모델링 과정을 결정하기 위해 확립된 마커를 통해 뉴런뿐만 아니라 신경교 세포의 시각화를 가능하게 한다. 여기에 제시된 방법은 SG가 VA에 걸리기 쉬운 마우스에 있는 자율 장애에 대한 추가 정보를 얻기 위하여 허용하고 심혼에 있는 자율 신경계의 신경 및 신경교 성분을 조사하는 추가 기술에 의해 보완될 수 있습니다.

도 1은 SG를 식별하고 해부하는 방법을 시각화합니다. 도 1A는 위치의 회로도 도면을 나타내고, 도 1B는 심장 폐 패키지를 제거한 후 흉부로 뷰를 제시한다. SG와 늑골 케이지의 왼쪽 및 오른쪽 긴 콜리 근육은 방향에 중요한 랜드마크입니다. 해부는 근육과 첫 번째 갈비뼈 사이의 점선을 따라 수행됩니다. SG와 공감 체인은 흰색<strong...

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Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion

심장 자율 신경계의 병리학적 변화, 특히 교감 지점에서 심실 부정맥의 발병 및 유지 보수에 기여합니다. 본 프로토콜에서, 우리는 근본적인 분자 및 세포 프로세스의 이해를 향상시키기 위하여 murine stellate ganglia를 특성화하는 방법을 보여줍니다.

뮤린 스텔레이트 갠리온의 위치, 해부 및 분석

The autonomic nervous system is a substantial driver of cardiac electrophysiology. Especially&#160;the role of its sympathetic branch is an ongoing matter ...

Every heartbeat is under tight control of the sympathetic nervous system. Most neurons within cardiac neurocontrol interact with the stellate ganglia. Our protocol makes it possible to study the underlying processes.With the video and images at hand, even the unexperienced investigator can find the stellate ganglion in mice and apply the techniques to different disease models. The sympathetic nervous system is a key component of cardiac arrhythmogenesis. Modulation of the stellate ganglia appears promising in the treatment of patients with life-threatening ventricular arrhythmias.Understanding the cellular and molecular processes in neurons and glial cells might pave the way for targeted therapies. The main challenge of this protocol is to locate the stellate ganglia. We recommend performing control staining for tyrosine hydroxylase in the beginning to assess the quality of preparation.After extraction of heart and lungs, place the torso of the mouse under a stereo microscope. Ensure good lighting with an external light source and flush the thorax with PBS. Locate the first rib in the longus colli muscles, then gently expose the connective tissue lateral to the longus colli muscle using the tip of the Dumont forceps.Repeat this process on the opposite side to locate the second stellate ganglion, then turn the forceps around by 180 degrees and using the flat side, grip the stellate ganglion and pull it out with minimal pressure. Place both stellate ganglia in a dish filled with PBS and inspect them with the appropriate magnification. Remove excess vessels, fat tissue, and larger nerves.Fix the stellate ganglia in 4%methanol-free paraformaldehyde for two hours at room temperature. Prepare Sudan Black stock solution for reduction of autofluorescence and improvement of signal to background ratio. Dissolve it for two to three hours on a magnetic stirrer at room temperature.Next, prepare Sudan Black working solution by centrifuging the stock solution for 30 minutes at 13, 000 times G to remove debris. Dilute the stock in 70%ethanol to a final concentration of 0.25%Sudan Black. Prepare dense bleach by mixing methanol, 30%hydrogen peroxide, and dimethyl sulfoxide at a ratio of four to one to one.Add 200 microliters of the bleach per stellate ganglion to improve antibody permeabilization and place the plate on a shaker for one hour at room temperature. Perform a descending series of rehydration using 100, 75, 50, and 25%methanol on a shaker, incubating for 10 minutes in each solution. For permeabilization, incubate the stellate ganglia twice in PBS with 1%Triton for 60 minutes each at room temperature.Remove the permeabilization solution from the stellate ganglia and add Sudan Black working solution, then incubate for two hours on a shaker. Carefully remove the Sudan Black solution by tilting the plate and pipetting from the upright side, then add 200 microliters of PBST. Wash for five minutes on a shaker.Remove PBST by aspirating it with a pipette and repeat the wash twice. After the last wash, add 200 microliters of blocking solution. Incubate at four degrees Celsius overnight on a shaker.On the next day, add primary antibodies to the blocking solution, adapting antibody concentrations from established protocols. Remove blocking solution from the stellate ganglia and add the primary antibodies. Incubate the stellate ganglia for 36 to 48 hours at four degrees Celsius on a shaker.Remove the antibody solution carefully and add 200 microliters of PBST. Place the plate on a shaker for 30 minutes. Remove the PBST and repeat the wash five more times.Prepare the secondary antibody working solution by centrifuging fluorescent Alexa labeled secondary antibodies for one minute at 13, 000 times G.Dilute the antibodies in blocking solution at a ratio of one to 500 and add them to the stellate ganglia. Incubate the plate for 12 to 24 hours at four degrees Celsius on a shaker. Remove the antibody solution carefully and add 200 microliters of PBST.For embedding, add fluorescent mounting medium on a glass slide and place it under a stereo microscope. Using Dumont forceps, pick up the stellate ganglion, remove excess liquid by dipping one end on a filter paper, and place it on the mounting medium. If necessary, correct the position of the stellate ganglion using Dumont forceps, then gently place a glass cover slip.Let the slides dry in the dark overnight at room temperature. Image the stellate ganglia stained for tyrosine hydroxylase at 200 times magnification for cell size measurement, taking four to six random images for every stellate ganglion. Analyze the images using ImageJ software to estimate cell size.An overview of a murine stellate ganglion stained positive for the sympathetic marker tyrosine hydroxylase and choline acetyltransferase in glial cells ensheathing neuronal cell bodies can be visualized by staining for S100B in combination with neuronal marker PGP9.5. An exemplary analysis of whole mount in situ hybridization and immunofluorescent co-staining of a stellate ganglion shows that tyrosine hydroxylase protein and mRNA molecules of beta-3 tubulin are expressed in large neuronal cell bodies, while mRNA of S100B is also detectable in surrounding glial cells. In the merge, it is visible that some neurons are negative for tyrosine hydroxylase, but express beta-3 tubulin, while S100B mRNA can also be detected in surrounding cells, as depicted in the magnification here.Images of tyrosine hydroxylase stained stellate ganglia were used for cell size measurements with ImageJ, and the data was compared for neuronal somata from control stellate ganglia versus diabetic stellate ganglia using the Mann-Whitney test. The expression of genes from different cell types of the stellate ganglia are shown here. Hematoxylin and eosin staining of a formalin fixed stellate ganglion visualizes connective tissue and cells on top.When attempting this protocol, remember to locate the strip and dissect along the longus colli muscle to identify the stellate ganglia, especially if the spine broke during cervical dislocation. Little is known about glial cells in the cardiac nervous system. Our techniques can be adapted to study their role in the stellate ganglia.

Research

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Medicine

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