Name: location, dissection, and analysis of the murine stellate ganglion
Uploaded: 2020-12-22T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion at JoVE.com

Forfatterne vil takke Hartwig Wieboldt for hans utmerkede tekniske assistanse, og UKE Microscopy Imaging Facility (Umif) ved University Medical Center Hamburg-Eppendorf for å gi mikroskoper og støtte. Denne forskningen ble finansiert av DZHK (German Centre for Cardiovascular Research) [FKZ 81Z4710141].

Alle prosedyrer som involverte dyr ble godkjent av Dyrepleie- og brukskomiteen i delstaten Hamburg (ORG870, 959) og North Rhine-Westphalian State Agency for Nature, Environment and Consumer Protection (LANUV, 07/11) og i samsvar med National Institutes of Health's Guide for care and use of Laboratory Animals (2011). Studier ble utført ved hjelp av mannlige og kvinnelige (i alderen 10-24 uker) C57BL / 6 mus (lagernummer 000664, Jackson Laboratories) og mus homozygot (db / db) eller heterozygot (db / het; kontroll) for di...

Forståelsen av cellulære og molekylære prosesser i nevroner og glialceller i det sympatiske nervesystemet som kommer før utbruddet av VA, er av høy interesse, da plutselig hjertestans forblir den vanligste dødsårsaken over hele verden5. Derfor, i det nåværende manuskriptet, gir vi et grunnleggende repertoar av metoder for å identifisere murin SG - et murinelement i dette nettverket - og utføre påfølgende analyser på RNA, protein og cellulært nivå.
En utf...

Hjerte autonominervesystemet er en tett regulert likevekt av sympatiske, parasympatiske og sensoriske komponenter som gjør at hjertet kan tilpasse seg miljøendringer med riktig fysiologisk respons1,2. Forstyrrelser i denne likevekten, for eksempel en økning av sympatisk aktivitet, er etablert som en nøkkeldriver for utbruddet, samt vedlikehold av ventrikulære arytmier (VA)3,4. Derfor har autonom modulasjon, oppnådd via farmakologisk reduksjon av sympatisk aktivitet med betablokkere, vært en hjørnestein i behandlingen av pasienter med VA i flere tiår5,6. Men til tross for farmakologiske og kateterbaserte intervensjoner, lider et relevant antall pasienter fortsatt av tilbakevendende VA7.
Sympatiske innspill til hjertet er for det meste mediert via nevronale cellelegemer i stellate ganglia (SG), bilaterale stjerneformede strukturer i den sympatiske kjeden, som videresender informasjon via mange intrathoracic nerver fra hjernestammen til hjertet8,9,10. Nervespirering fra SG etter skade er forbundet med VA og plutselig hjertedød11,12, understreker SG som et mål for autonom modulasjon13,14. En reduksjon av sympatiske innspill til hjertet kan oppnås midlertidig via perkutan injeksjon av lokalbedøvelse eller permanent ved delvis fjerning av SG via videoassistert thoracoskopi15,16. Hjerte sympatisk denervasjon presenterer et alternativ for pasienter med terapi-ildfast VA med lovende resultater14,16,17. Vi har lært av utplantet SG av disse pasientene at nevronal og nevrokjemisk ombygging, nevrobetennelse og glial aktivering er kjennetegn på sympatisk ombygging som kan bidra eller forverre autonom dysfunksjon18,19. Likevel forblir de underliggende cellulære og molekylære prosessene i disse nevronene uklare til dags dato, for eksempel rollen som nevronal transdifferensiering til en kolinerge fenotype20,21. Eksperimentelle studier presenterer nye tilnærminger for å behandle VA, for eksempel reduksjon av sympatisk nerveaktivitet via optogenetikk22, men grundig karakterisering av SG mangler fortsatt i mange hjertepatologier som går i hånd med VA. Musemodeller som etterligner disse patologiene gjør det mulig å studere nevronal ombygging som potensielt går foran utbruddet av arytmier12,23. Disse kan fullføres ved ytterligere morfologiske og funksjonelle analyser for autonom karakterisering av hjertet og nervesystemet. I den nåværende protokollen gir vi et grunnleggende repertoar av metoder som gjør det mulig å dissekere og karakterisere murin SG for å forbedre forståelsen av VA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92097</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion Slides SuperFrost plus&#160; 25 x 75 x 1 mm</td>
			<td>R. Langenbrinck</td>
			<td>03-0060</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil.</td>
			<td>Serva</td>
			<td>11924.03</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti neurofilament</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AB5539</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Merck, KGA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti chicken IgY Alexa 647&#160;</td>
			<td>Merck, KGA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>AP194SA6</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti goat IgG Alexa 568&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11057</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit IgG Alexa 488&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying block 37-100 mm</td>
			<td>Whatman (Sigma Aldrich)</td>
			<td>WHA10310992&#160;</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %)</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>2212.5000</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt mounting medium</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>253681.0008</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G + DAPI</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti choline acetyltransferase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AP144P</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2 30% (w/w)</td>
			<td>Merck, KGA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml</td>
			<td>Rotexmedica</td>
			<td>PZN: 3862340</td>
			<td>Preparation SG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-capacity cDNA reverse transctiption kit</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>&#160;4368813</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (Forene)</td>
			<td>Abbott Laboratories</td>
			<td>2594.00.00</td>
			<td>Preparation SG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s hemalum solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09249.0500</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glasses 20x20 mm or smaller</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0101040</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 570 Reagent Pack</td>
			<td>Akoya Bioscience</td>
			<td>FP1488001KT</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>7691202</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline tablets</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912-014</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinzette Dumont SS Forceps</td>
			<td>FineScienceTools</td>
			<td>11203-25</td>
			<td>Preparation SG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>79306</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti tyrosine hydroxylase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Merck</td>
			<td>R0901-100ML</td>
			<td>RNA isolation (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2</td>
			<td>biotechne (ACD)</td>
			<td>323100</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Probe-Mm-S100b-C2</td>
			<td>biotechne (ACD)</td>
			<td>431738-C2</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Probe-Mm-Tubb3</td>
			<td>biotechne (ACD)</td>
			<td>423391</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel beads 7 mm&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>69990</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan black B</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0292.2</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan mastermix</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>4370074</td>
			<td>Gene Expression analysis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 10% solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93443-100ml</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-100ML</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wacom bamboo pen</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>CTL-460/K</td>
			<td>Cell size measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA10311647</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>W21404</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

location, dissection, and analysis of the murine stellate ganglion

Det autonome nervesystemet er en betydelig driver for hjerteelektrofysiologi. Spesielt rollen til den sympatiske grenen er et pågående spørsmål om undersøkelse i patofysiologien til ventrikulære arytmier (VA). Nevroner i stellate ganglia (SG)   – bilaterale stjerneformede strukturer i den sympatiske kjeden –   er en viktig del av den sympatiske infrastrukturen. SG er et anerkjent mål for behandling via hjerte-sympatisk denervasjon hos pasienter med terapi-ildfast VA. Mens nevronal ombygging og glial aktivering i SG har blitt beskrevet hos pasienter med VA, er de underliggende cellulære og molekylære prosessene som potensielt går foran utbruddet av arytmi bare utilstrekkelig forstått og bør belyses for å forbedre autonom modulasjon. Musemodeller lar oss studere sympatisk nevronal ombygging, men identifisering av murin SG er utfordrende for den uerfarne etterforskeren. Dermed mangler dyptgående cellulære og molekylære biologiske studier av murin SG for mange vanlige hjertesykdommer. Her beskriver vi et grunnleggende repertoar for dissekering og studier av SG hos voksne mus for analyser på RNA-nivå (RNA-isolasjon for genuttrykksanalyser, in situ hybridisering), proteinnivå (immunfluorescerende hel monteringsfarging) og cellulært nivå (grunnleggende morfologi, cellestørrelsesmåling). Vi presenterer potensielle løsninger for å overvinne utfordringer i forberedelsesteknikken, og hvordan du kan forbedre farging via slukking av autofluorescens. Dette gjør det mulig å visualisere nevroner samt glialceller via etablerte markører for å bestemme cellesammensetning og ombyggingsprosesser. Metodene som presenteres her gjør det mulig å karakterisere SG for å få ytterligere informasjon om autonom dysfunksjon hos mus utsatt for VA og kan suppleres med ytterligere teknikker som undersøker nevronale og gliale komponenter i det autonome nervesystemet i hjertet.

Figur 1 visualiserer hvordan man identifiserer og dissekerer SG. Figur 1A viser en skjematisk tegning av stedet, mens figur 1B presenterer utsikten inn i thoraxen etter fjerning av hjerte-lunge-pakken. Venstre og høyre longus colli muskler medial fra SG og ribbeburet er viktige landemerker for orientering. Disseksjon utføres langs de stiplede linjene mellom muskler og den første ribben. SG og den sympatiske kjeden blir synlige so...

Watch this Scientific Journal Video about Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion at JoVE.com

Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion

Patofysiologiske endringer i hjerte autonominervesystemet, spesielt i sin sympatiske gren, bidrar til utbruddet og vedlikehold av ventrikulære arytmier. I den nåværende protokollen viser vi hvordan man karakteriserer murine stellate ganglia for å forbedre forståelsen av de underliggende molekylære og cellulære prosessene.

Plassering, disseksjon og analyse av Murine Stellate Ganglion

The autonomic nervous system is a substantial driver of cardiac electrophysiology. Especially&#160;the role of its sympathetic branch is an ongoing matter ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis

The vitreous is an optically clear, collagenous extracellular matrix that fills the inside of the eye and overlies the retina. 1,2 Abnormal interactions ...

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

Whole Vitreous Humor Dissection for Vitreodynamic Analysis

Hele Glasslegemet Dissection for Vitreodynamic Analysis

The authors propose an effective technique to isolate whole, intact vitreous core and cortex from post mortem enucleated porcine eyes. While previous ...

Murine Prostate Micro-dissection and Surgical Castration

Murine Prostata Micro-disseksjon og kirurgisk kastrering

Mouse models are used extensively to study prostate cancer and other diseases. The mouse is an excellent model with which to study the prostate and has ...

Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling

Disseksjon av musen bukspyttkjertelen for histologiske analyse og metabolske profilering

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at ...

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

Disseksjon og Explant kultur Murine Allantois for In Vitro analyse av Allantoic vedlegg

The placenta is essential for the growth and development of mammalian embryos. For this reason, numerous genetic alterations and likely also environmental ...

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of &#946;-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

Kvantitativ mikro-CT analyse av Aortopathy i en musemodell av β-aminopropionitrile-indusert aortaaneurisme og disseksjon

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of ...

A Non-Invasive Method for Generating the Cyclic Loading-Induced Intra-Articular Cartilage Lesion Model of the Rat Knee

En ikke-invasiv metode for å generere den sykliske belastningsinduserte intraartikulære brusklesjonsmodellen til rottekneet

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely ...

Robot-assisted Total Mesorectal Excision and Lateral Pelvic Lymph Node Dissection for Locally Advanced Middle-low Rectal Cancer

Robotassistert total mesorektal eksisjon og lateral bekkenlymfnute disseksjon for lokalt avansert mellom-lav rektalkreft

Since their approval for clinical use, da Vinci surgical robots have shown great advantages in gastrointestinal surgical operations, especially in complex ...