Name: location, dissection, and analysis of the murine stellate ganglion
Uploaded: 2020-12-22T14:45:00
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Os autores gostariam de agradecer a Hartwig Wieboldt por sua excelente assistência técnica, e o UKE Microscopy Imaging Facility (Umif) do University Medical Center Hamburg-Eppendorf por fornecer microscópios e suporte. Esta pesquisa foi financiada pelo DZHK (Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular) [FKZ 81Z4710141].

Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais do Estado de Hamburgo (ORG870, 959) e pela Agência Estadual de Proteção à Natureza, Meio Ambiente e Defesa do Consumidor (LANUV, 07/11) e conforme o Guia nacional de Atenção e Uso de Animais de Laboratório (2011). Foram realizados estudos utilizando camundongos do sexo masculino e feminino (10-24 semanas) C57BL/6 (número de estoque 000664, Jackson Laboratories) e camundongos homozigos (db/db) ou heterozigous (db/het...

A compreensão dos processos celulares e moleculares em neurônios e células gliais do sistema nervoso simpático que precedem o início do VA é de alto interesse, pois a parada cardíaca súbita continua sendo a causa de morte mais comum em todo o mundo5. Portanto, no manuscrito atual, fornecemos um repertório básico de métodos para identificar o Murine SG – elemento murino dentro dessa rede – e realizar análises subsequentes sobre RNA, proteína e nível celular.
<p class="jove_con...

O sistema nervoso autônomo cardíaco é um equilíbrio fortemente regulado de componentes simpáticos, parassimpáticos e sensoriais que permite ao coração se adaptar às mudanças ambientais com a resposta fisiológica adequada1,2. Distúrbios nesse equilíbrio, por exemplo, um aumento da atividade solidária, foram estabelecidos como um driver-chave para o início, bem como a manutenção de arritmias ventriculares (VA)3,4. Portanto, a modulação autônoma, alcançada através da redução farmacológica da atividade simpática com beta-bloqueadores, tem sido uma pedra angular no tratamento de pacientes com VA por décadas5,6. Mas, apesar das intervenções farmacológicas e baseadas em cateter, um número relevante de pacientes ainda sofre de VA7recorrente .
A entrada simpática ao coração é mediada principalmente através de corpos de células neuronais na gânglio estelar (SG), estruturas bilaterais em forma de estrela da cadeia simpática, que retransmitem informações através de numerosos nervos intratorácicos do tronco cerebral ao coração8,9,10. O nervo que brota do SG após a lesão está associado à VA e morte cardíaca súbita11,12, enfatizando o SG como alvo de modulação autônoma13,14. Uma redução da entrada simpática no coração pode ser alcançada temporariamente através de injeção percutânea de anestésicos locais ou permanentemente por remoção parcial do SG via toracoscopia assistida por vídeo15,16. A denervação cardíaca simpática apresenta uma opção para pacientes com terapia-refratário VA com resultados promissores14,16,17. Aprendemos com a SG explantada desses pacientes que a remodelagem neuronal e neuroquímica, a neuro-inflamação e a ativação gliais são marcas de remodelação simpática que podem contribuir ou agravar a disfunção autônoma18,19. Ainda assim, os processos celulares e moleculares subjacentes nesses neurônios permanecem obscuros até o momento, por exemplo, o papel da transdiferente neuronal em um fenótipo colinérgico20,21. Estudos experimentais apresentam novas abordagens para tratar va, por exemplo, a redução da atividade nervosa simpática via optogenética22, mas a caracterização aprofundada do SG ainda está faltando em muitas patologias cardíacas que andam na mão com a VA. Modelos de camundongos que imitam essas patologias permitem estudar a remodelagem neuronal que potencialmente precede o aparecimento de arritmias12,23. Estes podem ser completados por análises morfológicas e funcionais para caracterização autônoma do coração e do sistema nervoso. No presente protocolo, fornecemos um repertório básico de métodos que permitem dissecar e caracterizar o SG murino para melhorar a compreensão do VA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92097</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion Slides SuperFrost plus&#160; 25 x 75 x 1 mm</td>
			<td>R. Langenbrinck</td>
			<td>03-0060</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil.</td>
			<td>Serva</td>
			<td>11924.03</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti neurofilament</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AB5539</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Merck, KGA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti chicken IgY Alexa 647&#160;</td>
			<td>Merck, KGA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>AP194SA6</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti goat IgG Alexa 568&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11057</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit IgG Alexa 488&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying block 37-100 mm</td>
			<td>Whatman (Sigma Aldrich)</td>
			<td>WHA10310992&#160;</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %)</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>2212.5000</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt mounting medium</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>253681.0008</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G + DAPI</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti choline acetyltransferase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AP144P</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2 30% (w/w)</td>
			<td>Merck, KGA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml</td>
			<td>Rotexmedica</td>
			<td>PZN: 3862340</td>
			<td>Preparation SG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-capacity cDNA reverse transctiption kit</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>&#160;4368813</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (Forene)</td>
			<td>Abbott Laboratories</td>
			<td>2594.00.00</td>
			<td>Preparation SG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s hemalum solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09249.0500</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glasses 20x20 mm or smaller</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0101040</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 570 Reagent Pack</td>
			<td>Akoya Bioscience</td>
			<td>FP1488001KT</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>7691202</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline tablets</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912-014</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinzette Dumont SS Forceps</td>
			<td>FineScienceTools</td>
			<td>11203-25</td>
			<td>Preparation SG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>79306</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti tyrosine hydroxylase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Merck</td>
			<td>R0901-100ML</td>
			<td>RNA isolation (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2</td>
			<td>biotechne (ACD)</td>
			<td>323100</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Probe-Mm-S100b-C2</td>
			<td>biotechne (ACD)</td>
			<td>431738-C2</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Probe-Mm-Tubb3</td>
			<td>biotechne (ACD)</td>
			<td>423391</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel beads 7 mm&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>69990</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan black B</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0292.2</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan mastermix</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>4370074</td>
			<td>Gene Expression analysis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 10% solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93443-100ml</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-100ML</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wacom bamboo pen</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>CTL-460/K</td>
			<td>Cell size measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA10311647</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>W21404</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

location, dissection, and analysis of the murine stellate ganglion

O sistema nervoso autônomo é um driver substancial de eletrofisiologia cardíaca. Especialmente o papel de seu ramo simpático é uma questão de investigação em curso na fisiopatologia das arritmias ventriculares (VA). Os neurônios da gânglios estelares (SG)   – estruturas bilaterais em forma de estrela da cadeia simpática –   são um componente importante da infraestrutura simpática. O SG é um alvo reconhecido para o tratamento via denervação cardíaca em pacientes com terapia-refratário va. Embora a remodelagem neuronal e a ativação gliana no SG tenham sido descritas em pacientes com VA, os processos celulares e moleculares subjacentes que potencialmente precedem o início da arritmia são apenas insuficientemente compreendidos e devem ser elucidados para melhorar a modulação autônoma. Modelos de mouse nos permitem estudar remodelagem neuronal simpática, mas a identificação do Murine SG é um desafio para o investigador inexperiente. Assim, faltam estudos biológicos celulares e moleculares aprofundados da SG murina para muitas doenças cardíacas comuns. Aqui, descrevemos um repertório básico para dissecar e estudar o SG em camundongos adultos para análises no nível de RNA (isolamento de RNA para análises de expressão genética, hibridização in situ), nível de proteína (coloração de montagem total imunofluorescente) e nível celular (morfologia básica, medição do tamanho da célula). Apresentamos soluções potenciais para superar desafios na técnica de preparação e como melhorar a coloração através da sacieciação da autofluorescência. Isso permite a visualização de neurônios, bem como células gliais através de marcadores estabelecidos, a fim de determinar processos de composição celular e remodelação. Os métodos aqui apresentados permitem caracterizar o SG para obter mais informações sobre disfunção autônoma em camundongos propensos ao VA e podem ser complementados por técnicas adicionais que investigam componentes neuronais e gliais do sistema nervoso autônomo no coração.

A Figura 1 visualiza como identificar e dissecar o SG. A Figura 1A mostra um desenho esquemático do local, enquanto a Figura 1B apresenta a visão no tórax após a remoção do pacote coração-pulmão. Os músculos longus colli esquerdo e direito medial do SG e da caixa torácica são marcos importantes para a orientação. A dissecação é realizada ao longo das linhas pontilhadas entre os músculos e a primeira costela. O SG e...

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Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion

Alterações fisiopatológicas no sistema nervoso autônomo cardíaco, especialmente em seu ramo simpático, contribuem para o surgimento e manutenção de arritmias ventriculares. No presente protocolo, mostramos como caracterizar gânglios estelares murinos para melhorar a compreensão dos processos moleculares e celulares subjacentes.

Localização, Dissecção e Análise do Gânglio Murine Stellate

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