Name: location, dissection, and analysis of the murine stellate ganglion
Uploaded: 2020-12-22T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion at JoVE.com

Författarna vill tacka Hartwig Wieboldt för hans utmärkta tekniska hjälp och UKE Microscopy Imaging Facility (Umif) vid University Medical Center Hamburg-Eppendorf för att tillhandahålla mikroskop och stöd. Denna forskning finansierades av DZHK (German Centre for Cardiovascular Research) [FKZ 81Z4710141].

Alla försök som involverar djur godkändes av Djurvårds- och användningskommittén i delstaten Hamburg (ORG870, 959) och Nordrhein-Westfalens statliga myndighet för natur, miljö och konsumentskydd (LANUV, 07/11) och överensstämmer med National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (2011). Studier utfördes med manliga och kvinnliga (i åldern 10-24 veckor) C57BL/6 möss (lagernummer 000664, Jackson Laboratories) och möss homozygous (db/db) eller heterozygous (db/het; kontroll) f...

Förståelsen av cellulära och molekylära processer i nervceller och gliaceller i det sympatiska nervsystemet som föregår uppkomsten av VA är av stort intresse, eftersom plötsligt hjärtstillestånd fortfarande är den vanligaste dödsorsaken i världen5. Därför tillhandahåller vi i det nuvarande manuskriptet en grundläggande repertoar av metoder för att identifiera murin SG – ett murinelement i detta nätverk – och utföra efterföljande analyser på RNA-, protein- och cellnivå.</...

Hjärtaunomiska nervsystemet är en tätt reglerad jämvikt av sympatiska, parasympatiska och sensoriska komponenter som gör det möjligt för hjärtat att anpassa sig till miljöförändringar med lämpligt fysiologisktsvar 1,2. Störningar i denna jämvikt, till exempel en ökning av sympatisk aktivitet, har fastställts som en viktig drivkraft för inälva samt underhåll av ventrikulära arytmier (VA)3,4. Därför har autonom modulering, som uppnås genom farmakologisk minskning av sympatisk aktivitet med betablockerare, varit en hörnsten i behandlingen av patienter med VA iårtionden 5,6. Men trots farmakologiska och kateterbaserade ingrepp lider fortfarande ett relevant antal patienter av återkommande VA7.
Sympatisk input till hjärtat förmedlas mestadels via neuronala cellkroppar i stellate ganglierna (SG), bilaterala stjärnformade strukturer i den sympatiska kedjan, som vidarebefordrar information via många intrathoracic nerver från hjärnstammen till hjärtat8,9,10. Nerv som spirar från SG efter skada är förknippad med VA och plötslighjärtdöd 11,12, betonar SG som ett mål för autonom modulering13,14. En minskning av sympatiska ingång till hjärtat kan uppnås tillfälligt via perkutan injektion av lokala bedövningsmedel eller permanent genom partiell borttagning av SG via videoassisterad thorakoscopy15,16. Hjärt sympatisk denervation presenterar ett alternativ för patienter med terapi-eldfast VA med lovande resultat14,16,17. Vi har lärt oss av explanted SG av dessa patienter att neuronal och neurokemisk ombyggnad, neuro-inflammation och stödjeceller aktivering är kännetecken för sympatisk ombyggnad som kan bidra eller förvärra autonoma dysfunktion18,19. Fortfarande förblir de underliggande cellulära och molekylära processerna i dessa nervceller dunkla hittills, till exempel rollen av neuronal transdifferentiering i en kolinergfenotyp 20,21. Experimentella studier presenterar nya metoder för att behandla VA, till exempel minskningen av sympatisk nervaktivitet via optogenetik22, men djupgående karakterisering av SG saknas fortfarande i många hjärtpatologier som går i hand med VA. Musmodeller som efterliknar dessa patologier gör det möjligt att studera neuronal ombyggnad som potentiellt föregår uppkomsten av arytmier12,23. Dessa kan kompletteras genom ytterligare morfologiska och funktionella analyser för autonom karakterisering av hjärtat och nervsystemet. I det nuvarande protokollet tillhandahåller vi en grundläggande repertoar av metoder som gör det möjligt att dissekera och karakterisera murin SG för att förbättra förståelsen för VA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92097</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion Slides SuperFrost plus&#160; 25 x 75 x 1 mm</td>
			<td>R. Langenbrinck</td>
			<td>03-0060</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil.</td>
			<td>Serva</td>
			<td>11924.03</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti neurofilament</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AB5539</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Merck, KGA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti chicken IgY Alexa 647&#160;</td>
			<td>Merck, KGA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>AP194SA6</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti goat IgG Alexa 568&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11057</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit IgG Alexa 488&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying block 37-100 mm</td>
			<td>Whatman (Sigma Aldrich)</td>
			<td>WHA10310992&#160;</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %)</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>2212.5000</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt mounting medium</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>253681.0008</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G + DAPI</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti choline acetyltransferase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AP144P</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2 30% (w/w)</td>
			<td>Merck, KGA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml</td>
			<td>Rotexmedica</td>
			<td>PZN: 3862340</td>
			<td>Preparation SG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-capacity cDNA reverse transctiption kit</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>&#160;4368813</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (Forene)</td>
			<td>Abbott Laboratories</td>
			<td>2594.00.00</td>
			<td>Preparation SG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s hemalum solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09249.0500</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glasses 20x20 mm or smaller</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0101040</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 570 Reagent Pack</td>
			<td>Akoya Bioscience</td>
			<td>FP1488001KT</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>7691202</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline tablets</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912-014</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinzette Dumont SS Forceps</td>
			<td>FineScienceTools</td>
			<td>11203-25</td>
			<td>Preparation SG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>79306</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti tyrosine hydroxylase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Merck</td>
			<td>R0901-100ML</td>
			<td>RNA isolation (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2</td>
			<td>biotechne (ACD)</td>
			<td>323100</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Probe-Mm-S100b-C2</td>
			<td>biotechne (ACD)</td>
			<td>431738-C2</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Probe-Mm-Tubb3</td>
			<td>biotechne (ACD)</td>
			<td>423391</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel beads 7 mm&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>69990</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan black B</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0292.2</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan mastermix</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>4370074</td>
			<td>Gene Expression analysis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 10% solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93443-100ml</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-100ML</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wacom bamboo pen</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>CTL-460/K</td>
			<td>Cell size measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA10311647</td>
			<td>Whole mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>W21404</td>
			<td>RNAscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

location, dissection, and analysis of the murine stellate ganglion

Det autonoma nervsystemet är en betydande drivkraft för hjärtelektrofysiologi. Särskilt rollen för dess sympatiska gren är en pågående fråga om undersökning i patofysiologi av Ventrikulärt arytmier (VA). Nervceller i stellate ganglierna (SG)   – bilaterala stjärnformade strukturer i den sympatiska kedjan – ären viktig del av   den sympatiska infrastrukturen. SG är ett erkänt mål för behandling via hjärt sympatisk denervation hos patienter med terapi-eldfast VA. Medan neuronal ombyggnad och stödjeceller aktivering i SG har beskrivits hos patienter med VA, är de underliggande cellulära och molekylära processer som potentiellt föregår uppkomsten av arytmi endast otillräckligt förstådda och bör klargöras för att förbättra autonoma modulering. Musmodeller gör det möjligt för oss att studera sympatisk neuronal ombyggnad, men identifiering av murin SG är utmanande för den oerfarna prövaren. Således saknas djupgående cellulära och molekylärbiologiska studier av murin SG för många vanliga hjärtsjukdomar. Här beskriver vi en grundläggande repertoar för dissekering och studier av SG hos vuxna möss för analyser på RNA-nivå (RNA-isolering för genuttrycksanalyser, in situ-hybridisering), proteinnivå (immunofluorescerande helmonteringsfärgning) och cellnivå (grundläggande morfologi, cellstorleksmätning). Vi presenterar potentiella lösningar för att övervinna utmaningar inom beredningstekniken och hur man kan förbättra färgning genom släckning av autofluorescens. Detta möjliggör visualisering av nervceller samt gliaceller via etablerade markörer för att bestämma cellsammansättning och ombyggnadsprocesser. De metoder som presenteras här gör det möjligt att karakterisera SG för att få ytterligare information om autonom dysfunktion hos möss som är benägna att VA och kan kompletteras med ytterligare tekniker som undersöker neuronala och gliakomponenter i det autonoma nervsystemet i hjärtat.

Figur 1 visualiserar hur man identifierar och dissekerar SG. Figur 1A visar en schematisk ritning av platsen, medan figur 1B presenterar vyn i bröstkorgen efter avlägsnandet av hjärt-lungpaketet. Vänster och höger longus colli muskler mediala från SG och revben bur är viktiga landmärken för orientering. Dissekering utförs längs de prickade linjerna mellan musklerna och det första revbenet. SG och den sympatiska kedjan bl...

Watch this Scientific Journal Video about Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion at JoVE.com

Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion

Patofysiologiska förändringar i hjärt autonoma nervsystemet, särskilt i dess sympatiska gren, bidrar till uppkomsten och underhållet av Ventrikulärt arytmier. I det nuvarande protokollet visar vi hur man karakteriserar murin stellate ganglier för att förbättra förståelsen av de underliggande molekylära och cellulära processerna.

Plats, dissekering och analys av Murine Stellate Ganglion

The autonomic nervous system is a substantial driver of cardiac electrophysiology. Especially&#160;the role of its sympathetic branch is an ongoing matter ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

En metod för Murine Islet Isolering och subkapsulär Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis

Dissekering av mänskliga glaskropp Elements för proteomik analys

The vitreous is an optically clear, collagenous extracellular matrix that fills the inside of the eye and overlies the retina. 1,2 Abnormal interactions ...

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

Kvantitativ Analys och karakterisering av aterosklerotiska lesioner i murina Aorta Sinus

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

Whole Vitreous Humor Dissection for Vitreodynamic Analysis

Sammanlagt Glaskroppen Dissektion för Vitreodynamic Analys

The authors propose an effective technique to isolate whole, intact vitreous core and cortex from post mortem enucleated porcine eyes. While previous ...

Murine Prostate Micro-dissection and Surgical Castration

Murin Prostate Micro-dissektion och kirurgisk kastrering

Mouse models are used extensively to study prostate cancer and other diseases. The mouse is an excellent model with which to study the prostate and has ...

Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling

Dissektion av mus bukspottkörteln för histologisk analys och metabolisk profilering

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at ...

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

Dissektion och Explant kultur av murina Allantois för In vitro- analys av allantoiska fastsättning

The placenta is essential for the growth and development of mammalian embryos. For this reason, numerous genetic alterations and likely also environmental ...

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of &#946;-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

Kvantitativa Micro-CT analys av Aortopathy i en musmodell av β-aminopropionitrile-inducerad aorta Aneurysm och dissektion

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of ...

A Non-Invasive Method for Generating the Cyclic Loading-Induced Intra-Articular Cartilage Lesion Model of the Rat Knee

En icke-invasiv metod för att generera den cykliska belastningsinducerade intraartikulära brosklesionsmodellen i råttknäet

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely ...

Robot-assisted Total Mesorectal Excision and Lateral Pelvic Lymph Node Dissection for Locally Advanced Middle-low Rectal Cancer

Robotassisterad total mesorectal excision och lateral bäckenhålorna lymfkörtel dissekering för lokalt avancerad medel-låg ändtarmscancer

Since their approval for clinical use, da Vinci surgical robots have shown great advantages in gastrointestinal surgical operations, especially in complex ...